缺氧誘導(dǎo)胃癌多藥耐藥的機(jī)制研究

雷 婷,劉理禮,韓 霜,郭雪艷,丁 杰

1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院消化病中心,新疆烏魯木齊 830000;2.第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科;3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化病院全軍消化病研究所腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4.陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科

缺氧是實(shí)體瘤普遍存在的現(xiàn)象,多年來,人們對腫瘤組織缺氧重要性的認(rèn)識來源于一個(gè)事實(shí),缺氧細(xì)胞對治療具有固有的耐受性。近年來不斷有文獻(xiàn)報(bào)道在例如結(jié)腸癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、睪丸癌等多種腫瘤細(xì)胞對阿霉素、鉑劑、絲裂霉素和環(huán)磷酰胺等化療藥物發(fā)生了耐藥[1-3]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧能夠顯著降低胃癌細(xì)胞對于多種化療藥物的敏感性,其主要是通過上調(diào)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及增加抗凋亡分子Bcl-2/Bax的比例實(shí)現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人胃癌細(xì)胞系SGC7901引自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。鼠抗人p-gp、MRP、Bcl-2和Bax單克隆抗體購自Santa Cruz公司。細(xì)胞培養(yǎng)用1640培養(yǎng)液(Gibco公司),胎牛血清(浙江杭州四季青公司。RTPCR試劑盒(Promega),缺氧培養(yǎng)箱:Forma Scientific公司(1%O2,5%CO2,94%N2)。

1.2 M TT比色法 將待檢細(xì)胞預(yù)先缺氧(1%O2)或常規(guī)培養(yǎng) 8 h,將化療藥物按不同濃度加入各孔細(xì)胞,繼續(xù)缺氧或常規(guī)培養(yǎng)48 h;MTT呈色后,選擇490 nm波長比色,計(jì)算胃癌細(xì)胞在缺氧和常氧條件下化療藥物不同濃度下的存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)×100%。IC50的計(jì)算以細(xì)胞存活率為縱軸,藥物濃度對數(shù)為橫軸作半對數(shù)圖,并按作圖法求出胃癌細(xì)胞黏附于不同成分后對兩種藥物的 IC50值。

1.3 Annexin V/PI染色法 收獲對數(shù)生長期的待檢細(xì)胞,細(xì)胞貼壁后加入VCR,劑量為2.5 mg/L,37℃缺氧或常氧培養(yǎng)48 h;加入5μL的Annexin V-FITC后收集細(xì)胞,PI染液,流式細(xì)胞儀分析。計(jì)算細(xì)胞的凋亡指數(shù):細(xì)胞凋亡指數(shù)=(早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù))/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 阿霉素蓄積潴留實(shí)驗(yàn) 收獲對數(shù)生長中期的待檢細(xì)胞,按照每孔 1×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中;培養(yǎng)過夜后,缺氧或常氧培養(yǎng)12 h后每孔加入ADR至終濃度為5mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)1 h;收獲細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的ADR熒光強(qiáng)度,計(jì)算藥物的泵出率:細(xì)胞藥物泵出率(%)=(阿霉素的蓄積量-阿霉素的潴留量)/阿霉素的蓄積量×100%。

1.5 W estern blot 提取不同時(shí)間暴露于缺氧的胃癌細(xì)胞SGC7901的總蛋白,一抗分別為p-gp、MRP、Bcl-2和Bax單克隆抗體分別缺氧不同時(shí)間的蛋白水平的變化。

1.6 半定量RT-PCR 利用細(xì)胞總RNA提取試劑Trizaol提取細(xì)胞的總RNA,共20μL的反應(yīng)體積用于1～2μg總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),cDNA產(chǎn)物于-20℃保存。半定量PCR引物根據(jù)MDR1、MRP、Bcl-2、Bax和β-actin mRNA序列用Primer Primere 5軟件設(shè)計(jì)。引物由上海英駿生物工程公司合成,序列如下:上游引物5′-AACGGAAGCCAGAACATTCC-3′,下游引物5′-AGGCTTCCTGTGGCAAAGAG-3′(MDR1);上游引物5′-ATACCTGCTGTTCGGATTT-3′,下游引物5′-CGC ATAGTGGATGGCTTT-3′(MRP-1);上游引物5′-AGGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′,下游引物5′-GAGACAGCCAGGAG AAATCAAA-3′(Bcl-2);上游引物5′-CAGGATCGAGCAGGGCGAATG-3′下游引物5′-GCTTGAGGAGTCTCACCCAACCA-3′(Bax);上游引物5′-ATCCTGCCAGTAGCATATGC-3′,下游引物5′-ACCGGGTTGGTTTTGATCTG-3′(β-actin)。PCR反應(yīng)條件94℃40 s,57℃40 s,72℃1min,70℃10min,30個(gè)循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 根據(jù)數(shù)據(jù)不同,相應(yīng)采用配對 t檢驗(yàn)、方差分析及Dunnett's多均數(shù)比較等方法,使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)處理。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對于化療藥物敏感性的影響

2.1.1 MTT比色法檢測常氧狀態(tài)下和缺氧狀態(tài)下的胃癌細(xì)胞SGC7901對于化療藥物5-氟尿嘧啶(5-Fu)和長春新堿(VCR)等5種化療藥物的藥物敏感性:缺氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞對 5種化療藥物的敏感性均明顯低于常氧狀態(tài)下的胃癌細(xì)胞,提示缺氧能夠顯著降低化療藥物的敏感性(P＜0.05,見表1)。

表1 SGC 7901在缺氧和常氧條件下對 5種化療藥物的IC50 (μg/m L,±s)Tab 1 IC 50 of chemotherapeutic d rugs under normoxic and hypoxic condition in SGC 7901 cells(μg/m L,±s)

與常氧狀態(tài)下的SGC7901的IC50相比,*P＜0.05

化療藥物常氧狀態(tài)(IC50)缺氧狀態(tài)(IC50) 耐藥指數(shù)5-Fu 2.16±0.86 8.92±1.13* 4.1±0.13 VCR 1.23±0.01 6.23±0.15* 5.1±1.51 CDDP 3.23±1.18 7.51±1.03* 2.3±0.33 VP16 4.43±1.59 12.09±3.46* 2.7±0.11 ADM 0.33±0.22 0.72±0.19* 2.1±0.91

2.1.2 Annexin V/PI染色法借助流式細(xì)胞儀檢測胃癌細(xì)胞SGC7901在常氧和缺氧狀態(tài)下對于化療藥物誘導(dǎo)下的凋亡情況:常氧狀態(tài)下VCR誘導(dǎo)SGC7901的凋亡指數(shù)為44.7%,而在缺氧條件下,VCR誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞的凋亡指數(shù)下降了 20.7%,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而未加VCR的兩組細(xì)胞中常氧和缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞凋亡指數(shù)無顯著性差異。提示缺氧能夠增加胃癌細(xì)胞抵抗化療藥物誘導(dǎo)的凋亡能力(見圖1)。

2.1.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測常氧狀態(tài)和缺氧狀態(tài)下胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)阿霉素的蓄積和潴留,并計(jì)算相應(yīng)的藥物泵出率:與常氧狀態(tài)下相比,缺氧條件下的SGC7901細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積和潴留均明顯減少,藥物泵出率顯著增加(見表2)。

表2 胃癌細(xì)胞的阿霉素蓄積潴留和藥物泵出率(±s)Tab 2 Accumu lation and retention of Adriam ycin in SGC 7901 cells under normoxic and hypoxic condition(±s)

表2 胃癌細(xì)胞的阿霉素蓄積潴留和藥物泵出率(±s)Tab 2 Accumu lation and retention of Adriam ycin in SGC 7901 cells under normoxic and hypoxic condition(±s)

與常氧狀態(tài)下的SGC7901細(xì)胞的泵出率相比,*P＜0.05

熒光強(qiáng)度蓄積 潴留 泵出率SGC7901(N)6.34±0.51 5.47±0.23 0.14±0.04 SGC7901(H)5.04±0.48 3.76±0.33 0.25±0.03*

圖1 SGC 7901細(xì)胞在常氧和缺氧下VCR誘導(dǎo)的凋亡指數(shù)Fig 1 Apoptosis index induced by VCR under normoxic and hypoxic condition in SGC 7901 cells

2.2 缺氧上調(diào)MDR和MRP的表達(dá) 通過Western blot檢測不同時(shí)間缺氧處理的SGC7901細(xì)胞中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白p-gp和MRP的表達(dá),結(jié)果顯示(見圖2A):與常氧狀態(tài)下的SGC7901細(xì)胞相比,在缺氧培養(yǎng)8 h后細(xì)胞內(nèi)的p-gp和MRP蛋白水平明顯增加,具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

半定量RT-PCR檢測不同時(shí)間處理的SGC7901細(xì)胞中MDR1和MRP1的mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖2B):與常氧狀態(tài)下相比,缺氧能夠明顯上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MDR1和MRP1的mRNA水平。

圖2 M DR和MRP在常氧和缺氧條件下的表達(dá)Fig 2 Exp ression o f MDR and M RP under normoxic and hypoxic condition

2.3 缺氧增加抗凋亡分子 Bcl-2和降低促凋亡分子Bax的表達(dá) 通過Western blot檢測不同時(shí)間缺氧處理的SGC7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá),結(jié)果顯示(見圖 3A):與常氧狀態(tài)下的細(xì)胞相比, SGC7901細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)4 h后,抗凋亡分子Bcl-2的蛋白水平呈時(shí)間依賴性的增加,并在缺氧 8 h后達(dá)到高峰,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而凋亡相關(guān)分子Bax的表達(dá)在缺氧2 h后明顯下降,且隨著缺氧時(shí)間的延長,Bax的表達(dá)也逐漸下降。

半定量RT-PCR檢測不同時(shí)間處理的SGC7901細(xì)胞中Bcl-2和Bax的mRNA水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見圖3B):與常氧狀態(tài)下的細(xì)胞相比,缺氧能夠明顯上調(diào)Bcl-2mRNA水平,下調(diào)Bax mRNA水平,且變化趨勢與蛋白水平一致。

圖3 Bcl-2和Bax在缺氧和常氧條件下的表達(dá)Fig 3 Expression of Bcl-2 and Bax under normoxic and hypoxic condition

3 討論

早在 20世紀(jì)七、八十年代,研究人員就發(fā)現(xiàn)在暴露于缺氧條件下或缺氧應(yīng)激后,腫瘤細(xì)胞對阿霉素、鉑劑和環(huán)磷酰胺等化療藥物發(fā)生耐藥[4]。而后研究者相繼在不同腫瘤組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),缺氧會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐受。Kinoshita等[5]研究發(fā)現(xiàn),缺氧可以增加結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的抗凋亡能力,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。另有文獻(xiàn)報(bào)道,在睪丸癌細(xì)胞[6]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[7]、胰腺癌[8]缺氧均可以降低化療藥物的療效。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞SGC7901中,缺氧顯著增加了 5-氟脲嘧啶、長春新堿、順鉑等 5種化療藥物的藥物敏感性,尤其是對于 5-氟尿嘧啶和長春新堿的耐受更為顯著。

多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞同時(shí)對多種化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理并不相同的藥物產(chǎn)生的耐受性。p-gp(ABCB1)是第一個(gè)被確定可介導(dǎo)多藥耐藥現(xiàn)象的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也是研究最廣泛深入的一個(gè)成員,是ABC(ATP binding cassette family)超家族的成員,研究證實(shí) p-gp高表達(dá)或活性增強(qiáng)可降低藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積,導(dǎo)致MDR。MDR1基因的誘導(dǎo)表達(dá)取決于細(xì)胞類型:多種誘導(dǎo)劑在不同的細(xì)胞中以不同的方式影響該基因的活性。例如,射線照射過的中國倉鼠細(xì)胞對長春新堿耐藥,其機(jī)制可能與翻譯或翻譯后調(diào)節(jié)有關(guān)[9]?；瘜W(xué)致癌劑誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞 MDR1基因活性增強(qiáng),再生大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行部分肝切除后也產(chǎn)生同樣的作用[10]。某些細(xì)胞因子在特定類型的培養(yǎng)細(xì)胞中誘發(fā)ABCB1-MDR現(xiàn)象。熱休克和細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑也會(huì)影響 MDR1基因的活性。近年來發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)一些腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá),參與了缺氧誘導(dǎo)的MDR。

Katrina等[11]用RNA定量微陣分析顯示,缺氧后上皮細(xì)胞中MDR1增加了7倍;而且缺氧條件下p-gp功能較常氧增強(qiáng)(7±0.4)倍;并證實(shí)MDR1基因上存在HIF-1的結(jié)合位點(diǎn)。從而進(jìn)一步證實(shí)MDR1是缺氧反應(yīng)基因。Wartenberg等[12]發(fā)現(xiàn)缺氧時(shí)p-gp在肝癌細(xì)胞中表達(dá)增高,氧化劑 H2O2和丁硫氨酸亞礬胺降低p-gp的表達(dá),而自由基清除劑N-乙酰半胱氨酸和維生素E則增加了p-gp的表達(dá),提示缺氧可誘導(dǎo)p-gp的表達(dá)。缺氧可以通過對 MDR1的轉(zhuǎn)錄激活參與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥。

但是,也有兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道,在乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)了化療藥物的抵抗,但缺氧并無改變pgp和MRP的表達(dá)水平,提示缺氧導(dǎo)致的化療誘導(dǎo)的抵抗存在細(xì)胞特異性[13,14]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中,缺氧能夠增加MDR1基因及其產(chǎn)物p-gp的表達(dá),降低化療藥物在胃癌細(xì)胞中的潴留和蓄積,從而部分誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的MDR。除此以外,我們還發(fā)現(xiàn)缺氧還能夠增加另外一個(gè)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MRP1的表達(dá)。提示,在胃癌細(xì)胞中,缺氧誘導(dǎo)的 MDR表型部分通過增加p-gp和MRP的表達(dá),從而降低了化療藥物在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

另外,缺氧可以降低化療藥物誘導(dǎo)的凋亡,主要是通過上調(diào)抗凋亡分子的表達(dá)或是降低凋亡分子的表達(dá),從而降低化療藥物的殺傷效能。而在此過程中,文獻(xiàn)報(bào)道,缺氧能夠抑制凋亡分子Bid的表達(dá),降低依托泊甙對于結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷效能。在口腔鱗狀上皮癌細(xì)胞中,缺氧通過抑制Caspase-9和Caspase-3的活性以及增加抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-X(L)的表達(dá)從而抑制凋亡的發(fā)生。但是,缺氧還存在著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。Moritz等[15]發(fā)現(xiàn)人和小鼠胰島β細(xì)胞缺氧6 h即出現(xiàn)核固縮,Caspase-3表達(dá)增高;研究還發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)胰島素瘤細(xì)胞系(MIN6)凋亡比例增加。缺氧還可激活促凋亡分子RTP801、NIX、NIP3[16],由此引起細(xì)胞凋亡。

在凋亡的發(fā)生機(jī)制中,凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2及其家族成員在其中起著重要的作用。Bcl-2與Bax的比例調(diào)節(jié)了凋亡的發(fā)生[17]。我們的研究發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中,缺氧4 h后能夠明顯上調(diào)抗凋亡分子Bcl-2的表達(dá),缺氧2 h后能夠明顯下調(diào)促凋亡分子 Bax的表達(dá),因此,我們推測,在胃癌細(xì)胞 SGC7901中,缺氧通過增加抗凋亡分子Bcl-2/Bax的比例抑制了化療藥物誘導(dǎo)的凋亡,從而介導(dǎo)胃癌細(xì)胞的MDR。眾所周知,缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是缺氧活化的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種靶基因來維持腫瘤細(xì)胞在缺氧條件下的生存。有研究證實(shí)缺氧上調(diào)p-gp的表達(dá)是通過HIF-1轉(zhuǎn)錄活化MDR1基因的機(jī)制調(diào)節(jié)的,那么在胃癌細(xì)胞中我們發(fā)現(xiàn)的缺氧上調(diào)的MRP、Bcl-2是否也是通過HIF-1轉(zhuǎn)錄活化的還有待于進(jìn)一步的研究。

[1]Harrison L,Blackwell K.Hypoxia and anemia:factors in decreased sensitivity to radiation therapy and chemotherapy[J]?Oncologist, 2004,9(Suppl 5):31-40.

[2]Greco O,Marpels B,Joiner MC.How to overcome(and exploit) tumor hypoxia for targeted gene therapy[J].J Cell Physiol,2003, 197(3):312-325.

[3]Brown JM.Exploiting the hypoxic cancer cell:mechanisms and therapeutic strategies[J].Mol Med Today,2000,6(4):157-162.

[4]Teicher BA,Lazo JS,Sartorelli AC.Classification of antineoplastic agents by their selective toxicities toward oxygenated and hypoxic tumor cells[J].Cancer Res,1981,41(1):73-81.

[5]Kinoshita M,Johnson DL,Shatney CH,et al.Cancer cells surviving hypoxia obtain hypoxia resistance and maintain anti-apoptotic potential under reoxygenation[J].Int JCancer,2001,91(3):322-326.

[6]Koch S,Mayer F,Honecker F,etal.Efficacyof cytotoxic agentsused in the treatment of testicular germ cell tumoursunder normoxic and hypoxic conditions in vitro[J].Br J Cancer,2003,89(11): 2133-2139.

[7]Yang DI,Chen SD,Yang YT,et al.Carbamoylating chemoresistance induced by cobaltpretreatment in C6 glioma cells:putative rolesof hypoxia-inducible factor-1[J].Br J Pharmacol,2004,141(6): 988-996.

[8]Yokoi K,Fidler IJ.Hypoxia increases resistance of human pancreatic cancer cells to apoptosis induced by gemcitabine[J].Clin Cancer Res,2004,10(7):2299-2306.

[9]Hill BT,Deuchars K,Hosking LK,et al.Overexpression of P-glycoprotein inmammalian tumor cell linesafter fractionated X irradiation in vitro[J].JNatl Cancer Inst,1990,82(7):607-612.

[10]Burt RK,Thorgeirsson SS.Coinduction of MDR-1 multidrug-resistance and cytochrome P-450 genes in rat liver by xenobiotics[J].J Natl Cancer Inst,1988,80(17):1383-1386.

[11]Katrina M,Timothy J,Karhausen J,et al.Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance(MDR 1)gene[J]. Cancer Res,2002,62(15):3387-3394.

[12]Wartenberg M,Gronczynska S,Bekhite MM,etal.Regulation of the multidrug resistance transporterP-glycoprotein inmulticellularprostate tumor spheroidsby hyperthermia and reactive oxygen species[J].Int JCancer,2005,113(2):229-240.

[13]Greijer AE,de Jong MC,Scheffer GL,etal.Hypoxia-induced acidification causesmitoxantrone resistance notmediated by drug transporters in human breast cancer cells[J].CellOncol,2005,27(1):43-49.

[14]Hyun JY,Chun YS,Kim TY,et al.Hypoxia-inducible factor 1alphamediated resistance to phenolic anticancer[J].Chemotherapy, 2004,50(3):119-126.

[15]MoritzW,Meier F,Stroka DM,et al.Apoptosis in hypoxic human pancreatic islets correlates with HIF-1alpha expression[J].FASEB J,2002,16(7):745-747.

[16]Shoshani T,Faerman A,Mett I,et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene,RTP801,involved in apoptosis[J].Mol Cell Biol,2002,22(7):2283-2293.

[17]Salomons GS,Brady HJ,Verwijs-Janssen M,et al.The Bax alpha/ Bcl-2 ratiomodulates the response to dexamethasone in leukemia cells and ishighly variable in childhood acute leukem ia[J].Int JCancer, 1997,71(6):959-965.