降糖三黃片對糖尿病心肌病大鼠心室重構(gòu)的電鏡觀察*

王慧睿，李賽美，王保華，熊學(xué)軍，陳 云，林 潔

糖尿病心肌病的病理生理特點(diǎn)為左心室舒張功能障礙，晚期也有收縮功能減低，心肌及間質(zhì)細(xì)胞的重構(gòu)是糖尿病心肌病左心室舒張和收縮功能障礙的主要原因之一，目前臨床尚缺乏有效治療。降糖三黃片是針對2型糖尿病氣陰不足、瘀血阻絡(luò)的病機(jī)，由《傷寒論》經(jīng)方桃核承氣湯加味研制而成。前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味桃核承氣湯對2型糖尿病及其心血管并發(fā)癥具有一定的防治作用［1-3］。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察糖尿病心肌病發(fā)生心室重構(gòu)時的超微結(jié)構(gòu)變化以及中藥降糖三黃片對其的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及造模 SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，體重50g～80g，購自南方醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心(廣東省實(shí)驗動物檢測所，合格證001號，環(huán)境設(shè)施合格證028號)。所有大鼠普通飼料(總熱量6.94J/g，其中蛋白質(zhì)23%，碳水化合物53%，脂肪5%(購自廣東省實(shí)驗動物中心)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，改用高脂飼料(總熱量4.9kcal/g，其中蛋白質(zhì)20%，碳水化合物35%，脂肪45%，蛋氨酸按1%比例添加，購自廣東省實(shí)驗動物中心)喂養(yǎng)1個月。造模前禁食12h，造模組按30mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射STZ(溶于0.1mmol/L檸檬酸緩沖液，pH4.5)，正常組腹腔內(nèi)注射等量檸檬酸緩沖液。1周后，測定空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(Fasting insulin，F(xiàn)INS)，計算胰島素敏感指數(shù)［Insulin sensitive index，ISI，ISI=In(FINS ×FBG)－1］。連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/L，查尿糖++以上，胰島素敏感指數(shù)降低，且有多飲、多尿、多食現(xiàn)象，確認(rèn)為2型糖尿病模型。2型糖尿病大鼠成模后，給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周，即出現(xiàn)糖尿病大鼠心肌病變［4］。

1.1.2 試劑及藥品 鏈脲佐菌素購自Sigma公司;降糖三黃片為廣州中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑，規(guī)格為每片0.25g;卡托普利片(商品名:開博通)為中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格為每片12.5mg。

1.1.3 主要儀器 美國雅培公司快速微量血糖儀;Acuson sequoia 512高頻超聲診斷儀;Hitachi H-7500透射電子顯微鏡購自Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組與造模組(含模型組與治療組)。糖尿病造模成功后造模組進(jìn)一步分層，隨機(jī)分為模型組、降糖三黃片干預(yù)組、卡托普利干預(yù)組。49只大鼠完成實(shí)驗，正常組10只，模型組13只，降糖三黃片干預(yù)組13只，卡托普利干預(yù)組13只(余5只或死亡或不符合條件)。中藥組(降糖三黃片)藥量按787.5mg/(kg(d)的劑量給予，西藥組(卡托普利)藥量按照4mg/(kg(d)的劑量給予，正常組及模型組灌服等量蒸餾水。

1.2.2 生化指標(biāo)測定 STZ注射1周后，大鼠禁食12h后空腹眼眶靜脈竇采血。糖尿病大鼠造模成功后8周，處死前腹主動脈采血檢測FBG、膽固醇和甘油三酯以及胰島素。

1.2.3 心功能的超聲檢測［5］實(shí)驗?zāi)┬谐曅膭訄D檢查。二維超聲檢測指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(LVED，mm)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF，%)，組織多普勒指標(biāo)包括左室側(cè)壁二尖瓣環(huán)收縮期最大運(yùn)動速度(Sm，cm/s)、舒張早期最大運(yùn)動速度(Em，cm/s)、舒張晚期最大運(yùn)動速度(Am，cm/s)和舒張早期與舒張晚期最大運(yùn)動速度比值(Em/Am)。

1.2.4 取材及電鏡標(biāo)本制作 經(jīng)心臟超聲檢查后，迅速打開胸腔摘取心臟，以冰冷的生理鹽水沖洗去血液，小心剪去連接心臟的血管，用濾紙吸干水迅速以電子天平稱全心重量;沿房室交界處剪去心房部分，將余下的室間隔、左室游離壁作為左室重量(Left ventricles weight，LVM)，左室重量與體質(zhì)量的比值分別作為左室重量指數(shù)(LVMI，mg/g)。再將左心室切成1mm3小塊，先用體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定，0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)沖洗，再用10g/L鋨酸固定，PBS洗，酒精丙酮系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，AO超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，最后置透射電鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以珋x±s表示。采用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，多樣本均數(shù)間比較采用one-wayANOVA檢驗，組間比較采用 LSD-t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)比較(見表1)

表1 各組大鼠體質(zhì)量及生化指標(biāo)比較(珋x±s)

表2 各組大鼠超聲心動圖指標(biāo)比較(珋x±s)

2.2 降糖三黃片對糖尿病心肌病大鼠心功能的影響(見表2)

2.3 降糖三黃片對糖尿病心肌病大鼠左心室重量指數(shù)的影響(見表3)

表3 各組大鼠心臟重量、左心室重量及左心室重量指數(shù)改變(珋x±s)

2.4 降糖三黃片對糖尿病心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響(圖1)

2.4.1 正常組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌組織由眾多的心肌細(xì)胞組成，心肌細(xì)胞有分枝，細(xì)胞間由閏盤相連，形態(tài)正常。胞核位于心肌細(xì)胞中央部位，呈長桿狀，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，少量異染色質(zhì)分布于核膜下或分散存在于核質(zhì)中，兩層核膜清晰可辨;細(xì)胞縱切面可見胞漿充滿大量縱向平行排列的肌原纖維;I帶、A帶、H帶與 Z線、M線均明顯易辨，形成明暗相間的肌節(jié)結(jié)構(gòu);胞漿中有豐富的線粒體，位于核旁與與肌原纖維束間，呈圓形或卵圓形，其嵴密集，排列有序，充滿整個線粒體內(nèi)腔。

2.4.2 模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞縱切面可見肌原纖維排列紊亂、斷裂、分離、局部溶解;線粒體腫脹，外膜不完整，嵴減少與稀疏，部分線粒體缺失;胞核染色質(zhì)凝聚，核膜不完整并呈節(jié)段性溶解消失病變。

2.4.3 卡托普利組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)也較接近正常，細(xì)胞核長桿狀，位于細(xì)胞中央，形態(tài)與正常組相似，肌原纖維無病變，線粒體形態(tài)輕度腫脹，個別有畸形病變;胞核染色質(zhì)有輕度凝聚現(xiàn)象。

2.4.4 降糖三黃片組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)接近正常組，胞核長桿狀，位于細(xì)胞中央，形態(tài)正常;肌原纖維排列整齊，與正常組相近;線粒體形態(tài)輕度腫脹，胞核染色質(zhì)有輕度凝聚現(xiàn)象。

3 討論

圖1 糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察(放大比例為×8000，標(biāo)尺為1 m)

糖尿病心肌病是一種獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥，其臨床特征以左室舒張功能障礙為主，隨著病程的進(jìn)展也會出現(xiàn)收縮功能降低，逐漸發(fā)展為充血性心力衰竭［6］。心室重構(gòu)是指心室結(jié)構(gòu)改變，包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞的增殖及膠原組織增生等，同時心臟的功能也受到明顯影響。隨著心肌肥厚以及心室重構(gòu)的發(fā)生和發(fā)展，心律失常、心衰和猝死的發(fā)生率也隨之提高。目前的治療仍局限在以控制血糖為基礎(chǔ)，尚無特異有效的治療方法。中醫(yī)藥以整體調(diào)節(jié)、毒副作用小在糖尿病心肌病心室重構(gòu)的調(diào)節(jié)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。針對2型糖尿病氣陰不足、瘀血阻絡(luò)的病機(jī)，我院由《傷寒論》經(jīng)方桃核承氣湯加味研制而成中藥降糖三黃片，具體藥物有北黃芪、大黃、生地、桃仁、玄參、麥門冬、桂枝、甘草、玄明粉，在臨床運(yùn)用取得良好效果。運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與手段，探討糖尿病心肌病心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制，對進(jìn)一步提高療效、拓展中藥降糖三黃片在臨床的應(yīng)用范圍具有重要意義。

本研究以高脂高熱量飼料誘導(dǎo)加小劑量鏈脲佐菌素注射建立動物模型，具有中度胰島素抵抗、中度高血糖、高血脂等表現(xiàn)，基本符合2型糖尿病的臨床特點(diǎn)。電鏡檢查顯示，大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，肌原纖維呈灶性溶解，線粒體腫脹，外膜不完整，嵴減少與稀疏，胞核染色質(zhì)凝聚，核膜不完整并呈節(jié)段性溶解消失，與以往報道的糖尿病心肌超微結(jié)構(gòu)改變一致。超聲心動圖檢查顯示，在模型組反映左室舒張功能的指標(biāo)Em/Am顯著降低，反映左室收縮功能的指標(biāo)LVEF和Sm顯著降低，提示本研究建立的動物模型符合2型糖尿病心肌病。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗?zāi)┠Ｐ徒M大鼠左室重量、左室重量指數(shù)均顯著增加，說明在糖尿病心肌病基礎(chǔ)上出現(xiàn)了心室的重構(gòu)，為今后糖尿病心肌病心室重構(gòu)的實(shí)驗研究提供了良好的載體。

研究結(jié)果表明，中藥降糖三黃片不僅能緩解糖尿病大鼠“三多一少”的臨床癥狀，在客觀指標(biāo)上還能夠有效地降低血糖、血脂水平，減輕胰島素抵抗，全面改善2型糖尿病所導(dǎo)致的糖脂代謝紊亂狀態(tài)，這與既往關(guān)于加味桃核承氣湯改善糖脂代謝紊亂的報道一致［7、8］。超聲心動圖及透視電子顯微鏡觀察中藥降糖三黃片能夠改善心功能各項指標(biāo)，降低左室重量指數(shù)，有效改善糖尿病心肌病大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)，逆轉(zhuǎn)其心室重構(gòu)的過程，其效果與西藥卡托普利相似，2組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。推測其作用機(jī)制如下:①通過其對糖尿病的血糖控制，延緩糖尿病心肌病的發(fā)生，改善其預(yù)后;②降糖三黃片中活血通絡(luò)的成分如桃仁、桂枝、大黃等能夠改善心肌的微循環(huán)，從而起到延緩糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的作用;③降糖三黃片的作用效果與卡托普利有相似之處，是否其作用機(jī)制也通過作用于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶途徑需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究。

［1］ 李賽美，熊曼琪，林安鐘，等.中醫(yī)不同治法對糖尿病大鼠冠狀動脈結(jié)扎致心肌缺血預(yù)防作用的對比觀察［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(6):438-440.

［2］ 李賽美，熊曼琪，林安鐘，等.不同造模法糖尿病大鼠心肌電鏡觀察及對中藥效應(yīng)的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2000，6(6):14-16.

［3］ 李賽美，儲全根，莫 偉，等.加味桃核承氣湯及提取物對糖尿病大鼠主動弓病變影響的電鏡觀察［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，22(2):134.

［4］ 李賽美，吳玲霓，儲全根，等.加味桃核承氣湯及其不同提取物對糖尿病大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，28(3):236.

［5］ Julius M.Gardin， Francis M Siri， Richard N，et al.Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice Leinwand［J］.American Heart Association，Inc Circulation Research，1995，76:907-914.

［6］ Hayat SA，Patel B，Khattar RS，et al.Diabetic cardiomyopathy:mechanisms，diagnosis and treatment［J］.Clin Sci(Colch)，2004，107(6):539-557.

［7］ 熊曼琪，梁柳文，林安鐘，等.加味桃核承氣湯治療2型糖尿病的臨床和實(shí)驗研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1992，12(2):74-76.

［8］ 熊曼琪，林安鐘，朱章志，等.加味桃核承氣湯對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1997，17(3):165-168.