采用唾液淀粉酶和D-木糖排泄率對(duì)利血平脾虛證模型的評(píng)價(jià)研究*

李 燦，張海艇，陳玉龍

中醫(yī)動(dòng)物模型是開展中醫(yī)證候及中藥新藥實(shí)驗(yàn)研究的重要方法之一，已成為中醫(yī)科研方法體系的一個(gè)重要組成部分，但是如何對(duì)所建立的動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，是中醫(yī)證候模型研究的難點(diǎn)。

本研究應(yīng)用此指標(biāo)對(duì)最常用的中醫(yī)動(dòng)物模型利血平脾虛證模型進(jìn)行了評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠44只，體重100g～140g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK(粵)2008-0002)，適應(yīng)性飼養(yǎng)至平均體重300g左右時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

利血平注射液為廣東邦民制藥廠有限公司出品(批號(hào)080813)，生理鹽水為太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)08080017)，冰乙酸廣州市番禺力強(qiáng)化工廠(批號(hào)20070803-3)，可溶性淀粉、碘化鉀為天津大茂化學(xué)試劑廠，Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、碘酸鉀、生理鹽水為廣州化學(xué)試劑廠，苯甲酸為廣州星群制藥廠，以上試劑均為分析純。

1.3 儀器

H-600E-M型透射電鏡(日本 HITACHI公司);DY89-1型電動(dòng)勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Uvmini-1240紫外分光光度計(jì)(島津制作所);DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 分組和造模

雄性SD大鼠自由飼養(yǎng)至300g左右，隨機(jī)分為正常組20只、模型組大鼠24只，模型組大鼠皮下注射0.5mg/kg/d利血平注射液8d;正常組大鼠注射等量生理鹽水8d。第9天正常組隨機(jī)處死10只大鼠，模型組大鼠12只，其余大鼠正常飼養(yǎng)30d。

1.5 標(biāo)本取材

唾液取材方法:用2%戊巴比妥鈉以3ml/kg劑量麻醉后，待其稍清醒處于嗜睡狀態(tài)容易控制時(shí)，用帶塑料套管的注射針頭在大鼠口腔內(nèi)部?jī)蓚?cè)抽取唾液10min，等大鼠稍清醒時(shí)用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，在刺激的過程中同時(shí)抽取唾液10min，分別標(biāo)記冷凍保存。

第9天和第39天，處死前用2%戊巴比妥鈉以3ml/kg劑量麻醉，麻醉后用剪刀沿左側(cè)耳后剪開一條線取下左側(cè)腮腺，一部分用3%戊二醛固定做電鏡檢查，剩余部分冷凍保存;縫合傷口，等大鼠稍清醒時(shí)用10%冰乙酸溶液20μl刺激大鼠舌尖1次/min，共刺激30min，取下右側(cè)腮腺，一部分用3%戊二醛固定做電鏡檢查，剩余部分冷凍保存。冷凍保存部分用以檢測(cè)其他指標(biāo)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 一般狀態(tài) 每日觀察記錄各組大鼠的體重、攝食量、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、大便性狀和毛發(fā)光澤度。

1.6.2 唾液淀粉酶的活性和唾液流量檢測(cè)唾液淀粉酶活性檢測(cè)采用碘比色法［3］，具體方法如下:各玻璃管加入0.04%可溶性淀粉溶液1ml，37℃恒溫水浴3min，空白管加入0.01ml水，樣品管加入唾液10μl混勻，37℃ 水浴 7.5min，全部管中加入1ml碘應(yīng)用液，在波長(zhǎng)660nm處用分光光度計(jì)測(cè)各管的OD值。

淀粉酶活性的計(jì)算方法:淀粉酶單位/100ml=(對(duì)照管 OD值-測(cè)定管的 OD值)/對(duì)照管 OD值 ×1600;酸刺激前后唾液淀粉酶活性(sAA)活性比值=酸刺激后sAA活性單位/酸刺激前sAA活性單位;刺激前流量比=刺激后流量/刺激前流量;刺激前后總sAA活性比值=(酸刺激后sAA活性單位×刺激后流量)/(酸刺激前sAA活性單位×刺激前流量)。

1.6.3 腮腺淀粉酶檢測(cè) 用4℃預(yù)冷的勻漿器在預(yù)冷的PBS緩沖液中按5ml/g組織的量勻漿腮腺組織;在4℃ 14000×g離心5min，取上清。檢測(cè)方法如上。

1.6.4 檢測(cè)尿D-木糖排泄率 造模結(jié)束后所有大鼠禁食不禁水12h后，每只大鼠灌胃3%D-木糖4ml，收集5h尿液。參考文獻(xiàn)［4-5］用對(duì)溴苯胺法測(cè)定尿 D-木糖排泄率:每例取0.5ml尿液樣本，雙蒸水稀釋10倍后加入2%對(duì)溴苯胺溶液2.5ml，取濃度為1mg/ml的 D-木糖溶液，依次倍比稀釋制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本管和標(biāo)準(zhǔn)管置70℃恒溫水浴箱10min，然后室溫放置70min，以分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520nm下檢測(cè)。

木糖排泄率(%)=［(根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所計(jì)算濃度(mg/mL)×尿總量 mL×尿液稀釋倍數(shù)/灌胃木糖量)］ ×100% 。

1.6.5 大鼠腮腺組織病理學(xué)檢查 大鼠麻醉后用剪刀沿左側(cè)耳后剪開一條線，取下左側(cè)腮腺，4℃生理鹽水清洗后置中性甲醛溶液固定。固定12h后，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯固定后石蠟包埋，切片HE染色做病理組織學(xué)觀察。

1.6.6 電鏡下觀察酶原顆粒數(shù)量 固定、包埋，在解剖顯微鏡下修塊，切半薄切片，HE染色。在解剖顯微鏡下和普通顯微鏡下定位，超薄切片，電子染色、漂洗，干燥后電鏡下放大100000倍觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料2組比較用t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以珋x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 利血平脾虛模型動(dòng)物觀察

大鼠一般狀態(tài):大鼠注射利血平造模后，扎堆懶動(dòng)，爛便，毛色粗糙，食量減少，體重下降(與正常組比較:P＜0.01);造模第8天停藥后，造模大鼠食量增加，體重逐漸回升，第39天正常組與實(shí)驗(yàn)組無(wú)差別(見圖1)。

圖1 2組動(dòng)物體重變化

2.2 尿D-木糖排泄率

表1顯示，在造模前、第9天(造模結(jié)束)、第23天、第39天4次檢測(cè)各組大鼠尿D-木糖排泄率。在造模前模型組、正常大鼠木糖排泄率無(wú)差異(與正常組比較P＞0.05);第9天模型組與正常組大鼠木糖排泄率明顯降低(與正常組比較P＜0.01);在第23天模型組與正常組大鼠木糖排泄率仍降低(與正常組比較P＜0.05);第39天模型組木糖排泄率逐漸回升，但仍低于正常組(與正常組比較P＜0.05)。

表1 尿D-木糖排泄率(珋x±s，%)

2.3 唾液流量及唾液淀粉酶

2.3.1 酸刺激前后2組大鼠的唾液流量 表2顯示，造模第9天和第39天，2組大鼠在酸刺激后唾液流量與刺激前相比均顯著升高，但2組大鼠間無(wú)顯著差異。

表2 正常組和模型組大鼠酸刺激前后唾液流量比較((μl)珋x±s)

2.3.2 酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值變化每組10只大鼠，比較實(shí)驗(yàn)第9、23、39天的酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組在第9天酸刺激前后唾液淀粉酶活性顯著降低，第39天2組無(wú)顯著意義。

表3 酸刺激前后酸刺激前后唾液淀粉酶活性比值

2.3.3 大鼠腮腺內(nèi)淀粉酶活性 第9天，2組大鼠腮腺內(nèi)sAA在酸刺激前沒有顯著差異，但是模型組大鼠在酸刺激后sAA高于正常組，刺激后的下降率低于正常組。第39天，給予模型組大鼠酸刺激后腮腺sAA仍高于正常組大鼠。

表4 2組大鼠腮腺內(nèi)淀粉酶活性(活性單位/g組織)(珋x±s)

2.4 各組大鼠腮腺組織形態(tài)學(xué)觀察

第9天和39天，各組大鼠腮腺組織病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)各組大鼠腮腺組織有明顯病理改變，鏡下所見腺體細(xì)胞無(wú)腫大，間質(zhì)未見充血水腫，腺管周圍及纖維間質(zhì)中無(wú)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡未見萎縮、消失，腺管上皮未見增生水腫，管腔內(nèi)未見充滿壞死細(xì)胞和滲出物(見圖2)。

2.5 酸刺激下腮腺酶原顆粒

第9天顯示，2組大鼠腮腺組織內(nèi)酶原顆粒在酸刺激前沒有顯著差異，在刺激后正常組顯著下降，模型組殘留的酶原顆粒數(shù)量顯著高于正常組(詳見圖3)。

第39天，觀察酸刺激后各組大鼠腮腺內(nèi)殘余的酶原顆粒，模型組相對(duì)正常組殘余的酶原顆粒數(shù)量較多(見圖4)。

3 討論

用利血平法建立脾虛證動(dòng)物模型由北京市中醫(yī)研究所首創(chuàng)［6］，是目前中醫(yī)藥研究最常用的動(dòng)物模型之一。一般情況下，動(dòng)物模型有自然恢復(fù)現(xiàn)象，利血平脾虛證動(dòng)物模型也不例外。我們的實(shí)驗(yàn)表明，利血平脾虛大鼠模型在造模剛結(jié)束時(shí)動(dòng)物出現(xiàn)飲食減少、體重下降、便溏、消瘦、懶動(dòng)、兩眼瞇縫等類似脾虛證的表現(xiàn)，這些癥狀比較符合脾虛證候，但是在停用利血平后，各種癥狀特別是體重有所恢復(fù)，雖然仍有所偏低，但從單一癥狀上已很難說明動(dòng)物還是脾虛證候。

圖2 光鏡下觀察各組大鼠腮腺組織的形態(tài)學(xué)改變(HE染色 ×400)

圖3 第9天正常組和模型組大鼠腮腺組在透射電鏡觀測(cè)腮腺組織酶原顆粒(×105)

圖4 第39天大鼠腮腺組織在透射電鏡觀測(cè)腮腺組織酶原顆粒(×105)

脾氣虛證是以消化系統(tǒng)為中心的多系統(tǒng)、多器官功能障礙綜合癥候群，以消化、運(yùn)動(dòng)、吸收功能障礙為主。木糖是一種五碳糖，通常在血液中不存在，主要在小腸上段吸收，所以D-木糖排泄率能夠反映空腸的吸收功能狀態(tài)。中醫(yī)認(rèn)為，脾與唾液分泌關(guān)系密切，是重要的消化腺。研究發(fā)現(xiàn)，脾虛患者在酸刺激下唾液淀粉酶活性(sAA)比值下降。1986年在鄭州召開的全國(guó)虛證研究會(huì)議和中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則確定，木糖吸收試驗(yàn)和酸刺激下sAA為脾虛證診斷的參考指標(biāo)，目前這2項(xiàng)指標(biāo)己被廣泛應(yīng)用于脾虛證的研究中。因此，課題組采用反映小腸吸收功能的D-木糖排泄率和反映消化酶分泌的唾液淀粉酶為主要評(píng)價(jià)模型的指標(biāo)。

本研究表明，模型組動(dòng)物在造模結(jié)束時(shí)D-木糖排泄率顯著下降，并一直持續(xù)到模型后30d，說明利血平法脾虛模型在小腸吸收方面從造模結(jié)束一直到模型后30d仍存在功能障礙。造模結(jié)束后，酸刺激前后的唾液分泌流量沒有差異，而唾液淀粉酶活性比值較正常大鼠相比顯著降低，滯留腮腺的唾液淀粉酶酸前后比值增高，說明脾虛模型大鼠存在唾液淀粉酶分泌障礙，這與臨床觀察相一致。在造模后30d，唾液淀粉酶分泌障礙有所恢復(fù)，但仍然存在。

在本研究中，我們用直接抽取和唾液腺勻漿2種方法測(cè)定檢測(cè)酸刺激前后唾液淀粉酶分泌情況，發(fā)現(xiàn)唾液腺勻漿方法得到的數(shù)據(jù)更為穩(wěn)定。

為進(jìn)一步研究唾液淀粉酶分泌障礙機(jī)制，我們對(duì)利血平脾虛證模型腮腺進(jìn)行普通病理和電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在普通病理上沒有變化。電鏡超微結(jié)構(gòu)可知，脾虛證模型酶原顆粒較多，特別是在酸刺激下，模型組殘留的酶原顆粒數(shù)量顯著高于正常組。表明動(dòng)物唾液淀粉酶分泌障礙不是由于炎癥或者纖維化等所引起，但其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

總之，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用D-木糖排泄率和酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值對(duì)利血平脾虛模型大鼠進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)該模型符合脾虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且可以在一段時(shí)間內(nèi)(造模后1d～30d)用來(lái)評(píng)價(jià)藥物療效。D-木糖排泄率比酸刺激前后唾液淀粉酶分泌比值更靈敏和方便。

［1］ 1986年全國(guó)中兩醫(yī)結(jié)合虛證與老年病研究專業(yè)委員會(huì).中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)［S］.中西醫(yī)結(jié)合雜志，1986，6(10):598.

［2］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993:93-95.

［3］ 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第2版.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:239-245.

［4］ 張 翥，馬繼偉，李寅超.溢尿停對(duì)實(shí)驗(yàn)性脾虛SD大鼠胃腸功能的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜，2004，31(8):703-704.

［5］ 張愛郁，白德貞，張延英，等.慢性腹瀉161例尿 D-木糖測(cè)定的臨床研究［J］.甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1993，10(4):13-14.

［6］ 北京市中醫(yī)研究所.有關(guān)脾氣虛實(shí)質(zhì)的臨床觀察和實(shí)驗(yàn)研究［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志，1982，62(1):22.