真菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其抑制劑研究進(jìn)展

徐西光 張子平 程波

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，福州 350005)

真菌是具有真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物，其中某些菌種可引起動、植物的多種病害，影響人體健康，甚至威脅人類生命安全。目前抗真菌藥物在作用于真菌細(xì)胞的同時大都對宿主細(xì)胞有不同程度的副作用，且臨床上耐藥株越來越多。為了抑制病原真菌，人們一直致力于尋找新的藥物作用靶點(diǎn)以及新型抗真菌藥物。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對包括白念珠菌在內(nèi)的致病性真菌的毒力很重要，而人類細(xì)胞中不存在該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。因此，針對雙組分信號傳遞系統(tǒng)研發(fā)新的抗真菌藥靶，能有效地作用于真菌細(xì)胞而不對宿主細(xì)胞造成損傷［1］。

1 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)普遍存在于各種原核生物信號通路中，主要作用為調(diào)節(jié)細(xì)胞的趨化、黏附力、新陳代謝等生理功能及生物的致病性。這一信號傳導(dǎo)通路首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)［2］，許多真菌如釀酒酵母、裂殖酵母、白念珠菌等都具有與原核生物結(jié)構(gòu)相似的“雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)”。

“雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)”由一個組氨酸蛋白激酶(HK，也稱之“感受器激酶”)和一個“反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(RR)”組成。感受器激酶通常是跨膜蛋白，與胞外配體相結(jié)合;反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白是一個胞質(zhì)蛋白，可與DNA序列特異性相結(jié)合;當(dāng)感受器激酶與配體相結(jié)合時，激酶上的保守組氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，隨后該磷酸基被傳遞到反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白接受域一個保守的天冬氨酸殘基上，激活或抑制反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，最后調(diào)控基因表達(dá)。

真菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)相對原核生物有所不同，真核生物中的雙組分系統(tǒng)為變異性，有多級的“磷酸接力傳遞”。目前人類致病性真菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)了解最多的是白念珠菌。白念珠菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)包括:3個雜合組氨酸激酶(HKs:CaSln1p、CaNik1p和 CaHK1p)，1 個含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移過渡體(Ypd1p)，2個反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(RRs:CaSsk1p和CaSkn7p)。雜合組氨酸激酶包括1個保守的組氨酸殘基和1個保守的天冬氨酸殘基。細(xì)胞在等滲環(huán)境下，信號由胞膜感受器激酶(Sln1p)上的天冬氨酸殘基自身磷酸化，然后傳向含單個保守組氨酸殘基的中間轉(zhuǎn)移體Ypd1p，磷酸化的Ypd1p與反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白Ssk1p或Skn7p相互作用，使其反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白接受域的一個保守的天冬氨酸殘基磷酸化，從而完成 His-Asp-His-Asp(His:組氨酸;Asp:天冬氨酸)的磷酸傳遞過程。Ssk1p和Skn7p都包括一個保守的天冬氨酸接受域，根據(jù)刺激信號的不同來決定Ssk1p或Skn7p的活化［3］。

廣義的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)還包括高滲透性甘油促絲裂原活化蛋白激酶 (HOG-MAPK)途徑，該途徑為真菌和人類所共有，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓適應(yīng)及氧化應(yīng)激。在等滲環(huán)境下，雙組分信號通過上述途徑傳遞，磷酸化的Ssk1p不能激活其下游的Ssk2p，HOG途徑不被啟動;而在高滲環(huán)境下，不產(chǎn)生Sln1p-Ypd1p-Ssk1p的磷酸傳遞，去磷酸化的Ssk1p激活Ssk2p，然后依次激活下游的Pbs2p及Hog1p，完成磷酸基團(tuán)的傳遞，從而激活HOG途徑。該信號另一分支為Sho1p分支，Sho1p為跨膜感受器蛋白，它通過多種蛋白激酶 (Ste20p、Ste50p，GTP酶 Cdc42)激活 Ste11p，從而活化Pbs2p及 Hog1p，完成 HOG 途徑的傳遞［4-5］。

2 細(xì)菌和真菌擁有相似的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)存在于包括細(xì)菌、真菌在內(nèi)的大部分低等真核生物、原核生物及植物中，且在細(xì)菌與真菌中具有相似的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。這些雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白在細(xì)菌、真菌等微生物適應(yīng)高滲透壓及氧化刺激、細(xì)胞壁生物合成以及毒力、黏附力等方面起著重要作用。但哺乳動物細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，針對這些信號分子作為研發(fā)抗真菌藥的新型藥靶，能夠有效地抵抗致病性真菌而不對宿主細(xì)胞造成損傷［1，6］。

細(xì)菌與真菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制類似［7］。Petrikaite等［8］學(xué)者嘗試將已知的細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑應(yīng)用于抑制真菌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，取得了良好的效果。這提示可從細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑中篩選新型抗真菌藥物，Deschenes等［9］通過試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。設(shè)想將細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑應(yīng)用于臨床抗真菌治療，研發(fā)新型抗真菌藥物，將為各類真菌感染提供新型、有力的藥物治療手段，彌補(bǔ)目前抗真菌藥物較少且副作用較大的缺憾。

3 雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑

當(dāng)前常用的抗真菌藥物主要有直接作用于真菌細(xì)胞膜，損害細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的多烯類，影響真菌細(xì)胞膜麥角固醇生物合成的唑類、丙烯胺類、硫脲類和嗎啉類，選擇性抑制β-(1，3)-D-葡聚糖合成酶阻礙真菌細(xì)胞壁合成的棘白菌素類以及干擾真菌核酸的合成的5-氟胞嘧啶。這些藥物都存在一定的毒副作用，且耐藥菌株時有報(bào)道［10-11］。因此，探明雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的機(jī)制，可為抑制物的設(shè)計(jì)提供多個靶點(diǎn)，包括信號分子結(jié)合位點(diǎn)、蛋白激酶的自身磷酸化位點(diǎn)、磷酸基團(tuán)從激酶向反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)移途徑以及反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白接受磷酸基團(tuán)的位點(diǎn)等等。下面就介紹國內(nèi)外出現(xiàn)的有效或潛在的適用于抗真菌的細(xì)菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑。

利凡諾(Ethacridine Lactate又名雷佛奴爾、乳酸依沙吖啶) 為外用殺菌防腐劑，對革蘭陽性細(xì)菌及少數(shù)革蘭陰性細(xì)菌有較強(qiáng)的殺滅作用。Foster等［12］報(bào)道雙組分信號通路在細(xì)菌存活與致病中具有重要作用，而利凡諾作為雙組分信號系統(tǒng)抑制劑可以抑制組氨酸激酶的磷酸化，動力學(xué)分析顯示利凡諾可阻斷磷酸基團(tuán)的傳遞。分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可研究出相似的雙組分信號系統(tǒng)抑制劑。Petrikaite等［8］報(bào)道可抑制雙組分信號系統(tǒng)的利凡諾誘導(dǎo)劑可作為潛在的新型抗真菌藥物，且已在多種念珠菌屬藥敏試驗(yàn)中取得良好抑菌效果;Sergeev等［13］通過研究證實(shí)多烯類藥物合并利凡諾具有更強(qiáng)的抑制真菌的效果。

RWJ-49815、RWJ-49968 和 RWJ-61907 這 3種藥物為雙組分調(diào)控系統(tǒng)的小分子抑制物，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些小分子抑制物在金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌中具有良好的抑菌作用［14］。有關(guān)研究還表明大部分此類抑制物的作用機(jī)制是與ATP競爭以阻斷雙組分信號分子功能域的激酶活性［15］。Stephenson等［16］研究證實(shí) RWJ-49815可以改變激酶的羧基端結(jié)構(gòu)域，從而抑制激酶的催化活性。Deschenes等［9］通過實(shí)驗(yàn)觀察三種細(xì)菌的組氨酸激酶抑制劑的抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)所有3種化合物都不同程度的抑制了釀酒酵母和白念珠菌菌株的增長，并且通過抑制不同的組氨酸激酶發(fā)揮作用，從而證實(shí)了這些化合物的抗真菌特性。

氯氰碘柳胺(Closantel又名克羅散泰、氯生太爾) 氯氰碘柳胺是一種廣譜驅(qū)蟲藥，而作為細(xì)菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑，同時具有治療和預(yù)防作用。Cheng等［17］報(bào)道雙組分信號在細(xì)菌感受信號及適應(yīng)環(huán)境變化中發(fā)揮重要作用，氯氰碘柳胺作為組氨酸激酶的抑制劑，在作用于細(xì)菌后，可完全阻斷細(xì)菌對宿主細(xì)胞的感染;雙重免疫熒光標(biāo)記可示氯氰碘柳胺使細(xì)菌雙組分系統(tǒng)基因不同程度地受到抑制，繼而組氨酸激酶自身磷酸化的活性下降;Theodorou等［18］學(xué)者也證實(shí)該類藥品可以阻斷雙組分系統(tǒng)信號分子的磷酸轉(zhuǎn)移;Hlasta等［19］應(yīng)用結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系分析表明氯生太爾通過水楊苯胺作為藥效基團(tuán)來抑制雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，具有潛在抗真菌作用，需要我們進(jìn)一步去證實(shí)。

其他 另外11-脫氫皮質(zhì)酮 (compound-A)、四氯水楊酰苯胺 (tetrachlorosalicylanilide)及 TNPATP等藥物有報(bào)道均為雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)抑制劑［20］。Tabbene 等［21］研究證實(shí) compound A 對致病性念珠菌株有很強(qiáng)的殺菌活性，藥敏試驗(yàn)顯示該藥具有比兩性霉素B更低的MIC值;Ganendren等［22］亦表示compound A可考慮應(yīng)用于抗新生隱球菌等真菌的感染。

4 結(jié) 語

綜上所述，針對微生物雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)及其抑制劑的研究很多，主要集中在鑒定雙組分信號蛋白及其抑制劑對其作用靶點(diǎn)的研究。這些蛋白在細(xì)菌及真菌等在適應(yīng)滲透壓、生物合成及致病性等方面發(fā)揮重要作用，因此研究其抑制劑具有重要臨床意義。雖然近年來在雙組分信號系統(tǒng)這一領(lǐng)域的研究有很大的進(jìn)展，但對念珠菌Ypd1p是如何識別并與反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白相互作用，以及HOG途徑在真菌與哺乳動物之間的的差異性還不清楚［23］。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為真菌體內(nèi)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一支，還需進(jìn)一步的研究來明確不同潛在的抗真菌靶點(diǎn);對于一些篩選到的潛在的抗真菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，在人體內(nèi)的安全性、有效性、特異性等還有待檢驗(yàn)［24］。

人類致病性真菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白與其細(xì)胞壁合成及毒力等致病因素相關(guān)，針對這組蛋白作為新型藥靶，本文探討了若干的潛在的新型抗真菌藥物。今后隨著真菌基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展和互相交叉滲透，相信在不久的將來，抗真菌藥物的研究將會取得更大的突破，從而可以正確選擇合理的抗真菌藥物，探索并制定出高效、低毒和經(jīng)濟(jì)的診療方案。

［1］Chauhan N，Calderone R.Two-component signal transduction proteins as potential drug targets in medically important fungi［J］.Infect Immun，2008，76(11):4795-4803.

［2］Crump JA，Griffin PM，Angulo FJ.Bacterial contamination of animal feed and its relationship to human foodborne illness［J］.Clin Infect Dis，2002，35(7):859-865.

［3］Kruppa M，Calderone R.Two-component signal transduction in human fungal pathogens［J］.FEMS Yeast Res，2006，6(2):149-159.

［4］Bahn YS.Master and commander in fungal pathogens:the twocomponent system and the HOG signaling pathway［J］.Eukaryot Cell，2008，7(12):2017-2036.

［5］Saito H，Tatebayashi K.Regulation of the osmoregulatory HOG MAPK cascade in yeast［J］.Biochem，2004，136(3):267-272.

［6］Chauhan N，Latge JP，Calderone R.Signalling and oxidant adaptation inCandida albicansandAspergillus fumigatus［J］.Nat Rev Microbiol，2006，4(6):435-444.

［7］Lange R，Wagner C，de Saizieu A，et al.Domain organization and molecular characterization of 13 two-component systems identified by genome sequencing ofStreptococcus pneumoniae［J］.Gene，1999，237(1):223-234.

［8］Petrikaite V，Tarasevicius E，Pavilonis A.New ethacridine derivatives as the potential antifungal and antibacterial preparations［J］.Medicina(Kaunas)，2007，43(8):657-663.

［9］Deschenes RJ，Lin H，Ault AD，et al.Antifungal properties and target evaluation of three putative bacterial histidine kinase inhibitors［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43(7):1700-1703.

［10］Sangamwar AT，Deshpande UD，Pekamwar SS.Antifungals:need to search for a new molecular target［J］.Indian J Pharm Sci，2008，70(4):423-430.

［11］Duo M，Zhang M，Luk YY，et al.Inhibition ofCandida albicansgrowth by brominates furanones［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(5):1551-1563.

［12］Foster JE，Sheng Q，McClain JR，et al.Kinetic and mechanistic analyses of new classes of inhibitors of two-component signal transduction systems using a coupled assay containing HpkADrrA from Thermotogamaritima［J］.Microbiology，2004，150(Pt4):885-896.

［13］Sergeev PV，Romanenko IM，Ukhina TV.The cellular acid phosphatase activity in yeast-like fungi of the genus Candida exposed to ultrasound，polyene antibiotics and dyes［J］.Biull Eksp Biol Med，1993，116(9):272-274.

［14］Yamada-Okabe T，Mio T，Ono N，et al.Roles of three histidine kinase genes in hyphal development and virulence of the pathogenic fungusCandida albicans［J］.J Bacteriol，1999，181(23):7243-7247.

［15］Hilliard JJ，Goldschmidt RM，Licata L，et al.Multiple mechanisms of action for inhibitors of histidine protein kinases from bacterial two-component systems［J］.Antimicrob Agents Chemother，1999，43(7):1693-1699.

［16］Stephenson K，Yamaguchi Y，Hoch JA.The mechanism of action of inhibitors of bacterial two-component signal transduction systems［J］.Biological Chemistry，2000，275(49):38900-38904.

［17］Cheng Z，Kumagai Y，Lin M，et al.Intra-leukocyte expression oftwo-component systems inEhrlichiachaffeensisandAnaplasma phagocytophilumand effects of the histidine kinase inhibitor closantel［J］.Cell Microbiol，2006，8(8):1241-1252.

［18］Theodorou EC，Theodorou MC，Kyriakidis DA.Inhibition of the signal transduction through the AtoSC system by histidine kinase inhibitors inEscherichia coli［J］.Cell Signal，2011，23(8):1327-1337.

［19］Hlasta DJ，Demers JP，F(xiàn)oleno BD，et al.Novel inhibitors of bacterial two-component systems with gram positive antibacterial activity:pharmacophore identification based on the screening hit closantel［J］.Bioorg Med Chem Lett，1998，8(14):1923-1928.

［20］Calera JA，Zhao XJ，Calderone R.Defective hyphal development and avirulence caused by a deletion of the SSK1 response regulator gene inC.albicans［J］.Infect Immun，2000，68(2):518-525.

［21］Tabbene O，Kalai L，Ben Slimene I，et al.Anti-candida effect of bacillomycin D-like lipopeptides from Bacillus subtilis B38［J］.FEMS Microbiol Lett，2011，316(2):108-114.

［22］Ganendren R，Widmer F，Singhal V，et al.In vitroantifungal activities of inhibitors of phospholipases from the fungal pathogenCryptococcus neoformans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(5):1561-1569.

［23］Cheetham J，Smith DA，da Silva Dantas A，et al.A single MAPKKK regulates the Hog1 MAPK pathway in the pathogenic fungusC.albicans［J］.Mol Biol Cell，2007，18(11):4603-4614.

［24］Stephenson K，Hoch JA.Two-component and phosphorelay signal-transduction systems as therapeutic targets［J］.Curr Opin Pharmacol，2002，2(5):507-512.