15-KETE對(duì)慢性缺氧大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀離子通道的作用

張一飛，郭守利，劉 曄，朱大嶺

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院藥學(xué)部，哈爾濱 150086；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，哈爾濱 150086；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱 150086）

肺血管收縮反應(yīng)增強(qiáng)和結(jié)構(gòu)重建是低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）的重要特征，其主要表現(xiàn)形式是肺血管收縮和中膜平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，但其機(jī)制尚未明確。近來(lái)關(guān)于花生四烯酸（arachidonic acid，AA）及其一系列代謝產(chǎn)物在肺動(dòng)脈收縮節(jié)律的調(diào)節(jié)作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。15-酮基二十碳四烯酸（15-KETE）是AA的15-脂質(zhì)氧化酶（15-LO）一種代謝終產(chǎn)物，同時(shí)也是AA的15-LO另一種代謝產(chǎn)物15-HETE脫氫氧化產(chǎn)物［1，2］。有研究表明缺氧可上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞15-LO的表達(dá)［3］，因此缺氧時(shí)AA的代謝產(chǎn)物有其相應(yīng)的細(xì)胞分布及相應(yīng)的作用位點(diǎn)。

電壓門控鉀通道（KV）作為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的氧感受器，在缺氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的重要性越來(lái)越受到重視。有研究報(bào)道15-HETE通過(guò)抑制Kv通道引起肺動(dòng)脈收縮［3］，15-KETE對(duì)大鼠肺動(dòng)脈環(huán)的收縮作用比15-HETE更強(qiáng)烈［4］，其收縮作用依賴于Kv通道、細(xì)胞外液鈣離子和L-型鈣離子通道［5］，外源性15-KETE能濃度依賴性地抑制常氧大鼠PASMCs IK［6］V。本實(shí)驗(yàn)觀察了15-KETE對(duì)缺氧大鼠PASMCs IKV的影響，并與其對(duì)常氧大鼠PASMCs IKV的作用加以比較，為進(jìn)一步闡明15-KETE收縮肺動(dòng)脈離子通道機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：12只健康雄性SD大鼠，體重200±20g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供［SCXK（黑）2006-033］。

1.1.2 藥品與試劑：膠原酶I型，彈性酶，BSA，TEA，Na2ATP，Na2GTP，HEPES和BAPTA（Sigma，美國(guó)）；DTT（Roche，美國(guó)），15-KETE（Biomol，美國(guó)），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器：體視解剖顯微鏡（SMZ-168，Motic），膜片鉗儀，Axopatch 200B，USA；數(shù)-模轉(zhuǎn)換器，DigiData 1322A，USA；Olympus IX-70倒置顯微鏡，Japan；三維液壓推進(jìn)儀，Narishige Co LTD，Japan；微電極拉制儀，Narishige Co LTD，Japan。

1.1.4 液體配制：（1）生理鹽溶液（physiological salt solution，PSS）：成分（mmol/L）：NaCl 130、KCl 5、MgCl21.2、CaCl21.5、HEPES 10和glucose 10；分離細(xì)胞用無(wú)鈣PSS液，CaCl2由等摩爾的MgCl2取代，用NaOH調(diào)pH7.4。（2）灌流液：同PSS液，記錄Kv時(shí)含1mmol/L TEA灌流液，灌流速度為1mL/min。（3）電極內(nèi)液（Pipette solution，mmol/L）：KCl 125，Na2ATP 5，Na2GTP 0.5，MgCl24，CaCl22，HEPES 10，BAPTA 10），5mol/L KOH調(diào)至pH 7.2，GTP提供信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的底物，ATP一方面提供能量代謝所需底物，一方面抑制IKATP。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制作：參見(jiàn)文獻(xiàn)［7］，將12只健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為兩組（n=6），一組置于正常的培養(yǎng)箱中，其吸入氧（FiO2）濃度為21％，作為正常組；一組置于缺氧的培養(yǎng)箱中，其吸入氧濃度為10％，連續(xù)飼養(yǎng)9d，培養(yǎng)箱內(nèi)大鼠呼出的CO2、水蒸氣分別用氧化鈣和無(wú)水氯化鈣吸收，排出的氨氣由硼酸吸收，大鼠自由采食和飲水。

1.2.2 大鼠肺動(dòng)脈壓力和右心室肥厚的檢測(cè)：飼養(yǎng)9d后，大鼠經(jīng)1.5％戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，分離出右外頸靜脈并剪一小切口，插入聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)右心室至肺動(dòng)脈，另一端接壓力感受器，以RM-6000型多導(dǎo)生理儀測(cè)定肺動(dòng)脈平均壓（mPAP）。然后剖胸取出大鼠心臟，剪去心房組織，沿室間隔邊緣分離右心室（RV）和左心室+室間隔（LV+S），將殘血沖靜后，用濾紙將水吸干，自然干燥片刻后，稱量RV和LV+S，以RV/（LV+S）比值反映右心室肥厚程度。

1.2.3 大鼠單個(gè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的急性分離［8］：SD大鼠經(jīng)1.5％戊巴比妥鈉（40mg/kg）麻醉后，迅速開胸取出心和肺，放入盛有4℃的生理鹽溶液的燒杯中洗去血液，剪下肺葉移入冰浴盛有生理鹽溶液硅膠板的培養(yǎng)皿中，用大頭釘把肺葉固定在硅膠板上，體視顯微鏡下分離肺內(nèi)小動(dòng)脈（內(nèi)徑300～700μm），放入含1.5mg/mL膠原酶的生理鹽溶液中孵育20min，用顯微外科剪刀細(xì)心的剝離掉肺動(dòng)脈外的一薄層結(jié)蒂組織及外膜，沿長(zhǎng)軸剪開，用濕棉球輕擦去除內(nèi)皮，以上過(guò)程均通以95％O2和5％CO2，剩下的平滑肌剪成1mm×1mm的組織塊，然后用含2.0mg/mL膠原酶和0.5mg/mL彈性酶的生理鹽溶液37℃消化45min，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個(gè)細(xì)胞。分離好的細(xì)胞懸液置于4℃冰箱保存，6h內(nèi)可用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)［9］：取幾滴細(xì)胞懸液于細(xì)胞池，靜置20～30min，使細(xì)胞充分貼壁，然后平放在倒置顯微鏡上，選取胞膜光滑，胞核清晰，胞漿均勻的細(xì)胞進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。記錄電極用玻璃毛細(xì)管，經(jīng)電極拉制儀兩步法拉制成微電極，阻抗為3～5MΩ。采用全細(xì)胞膜片鉗記錄方法，在電流鉗下記錄細(xì)胞膜電位（Em），在電壓鉗下記錄Kv電流。記錄電流時(shí)，鉗制電壓為-60mV，給予從-60mV至+50mV，階躍電壓為10mV，脈沖時(shí)間為400ms的去極化刺激12次，頻率為0.2Hz；信號(hào)采集頻率：10kHz，濾波頻率：2kHz。采樣后數(shù)據(jù)由pClamp7.0軟件自動(dòng)記錄，存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)硬盤內(nèi)供測(cè)量分析。細(xì)胞外給藥采用排管給藥法，即通過(guò)三維操縱器移動(dòng)快速換藥裝置的排管進(jìn)行，排管每管直徑為0.2mm，管口距所記錄的細(xì)胞約100μm。所有的實(shí)驗(yàn)均在室溫（22℃～24℃）進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理：抑制率的計(jì)算：抑制率=（用藥前的峰電流值-用藥后的峰電流值）/用藥前的峰電流值×100％。所有結(jié)果用±s表示，采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，自身對(duì)照用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間資料的比較用非配對(duì)t檢驗(yàn)，用Origin7.5軟件包作圖。

2 結(jié)果

2.1 慢性缺氧大鼠模型的建立

檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)9d飼養(yǎng)后，缺氧組大鼠mPAP、RV、RV/（LV+S）均顯著高于對(duì)照組，顯示慢性缺氧大鼠模型復(fù)制成功（表1）。

表1 慢性缺氧大鼠的肺動(dòng)脈平均壓和右心室/（左心室+室間隔）的變化（n=6）Tab.1 The change of mPAP and RV/（LV+S）of rats exposed to chronic hypoxia（n=6）

2.2 慢性缺氧對(duì)大鼠PASMCs影響

2.2.1 慢性缺氧對(duì)大鼠PASMCs Em、Cm影響：分別在電流鉗制模式、斜坡刺激模式記錄正常組和缺氧組大鼠PASMCs靜息膜電位（Em）、膜電容（Cm）的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性低氧可明顯引起PASMCs去極化，但對(duì)PASMCs的Cm并沒(méi)有顯著的影響（表2）。

表2 慢性缺氧對(duì)大鼠PASMCs Em、Cm的影響（n=6）Tab.2 Effect of chronic hypoxia on Em，Cm in rat PASMCs（n=6）

2.2.2 慢性缺氧對(duì)PASMCs IKV的影響：在電壓鉗模式下記錄正常組和缺氧組大鼠PASMCs全細(xì)胞電壓門控鉀電流（IKV）的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧明顯抑制IKV，-20mV時(shí)電流從（26±6）pA/pF降至（21±3）pA/pF，+50mV時(shí)從（136±24）pA/pF降至（98±12）pA/pF，（P＜0.01，n=6），抑制率分別為（20.1±1.2）％和（28.4±2.4）％（圖1）。從全細(xì)胞電流圖及I-V曲線可以看出，低氧并沒(méi)有改變IKv的活化閾值及基本電流特征。

2.3 15-KETE、4-AP、TEA對(duì)慢性低氧大鼠PASMCs的影響

2.3.1 15-KETE、4-AP、TEA對(duì)慢性低氧大鼠PASMCs Em和Cm的影響：分別在電流鉗制模式和斜坡刺激模式下記錄大鼠PASMCs靜息膜電位（Em）和膜電容（Cm）。分別在用藥前1min，用藥時(shí)2min和用藥后3min記錄15-KETE（1×10-8mol/L、1×10-7mol/L、1×10-6mol/L）、TEA（1×10-3mol/L）對(duì)慢性低氧大鼠PASMCs Em和Cm的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)15-KETE、4-AP、TEA對(duì)慢性低氧大鼠PASMCs Cm無(wú)影響（表3）；15-KETE、4-AP均可引慢性低氧大鼠PASMCs起PASMCs去極化，TEA對(duì)慢性低氧大鼠PASMCs Em無(wú)影響（表2）。

圖1 慢性缺氧對(duì)PASMCs IKV的影響Fig.1 Effect of chronic hypoxia on KVcurrent in PASMCs

表3 15-KETE、4-AP、TEA對(duì)慢性低氧對(duì)大鼠PASMCs Em和Cm的影響（n=6）Tab.3 Effect of 15-KETE、4-AP，TEA on Em，Cm in chronic hypoxic rat PASMCs（n=6）

2.3.2 15-KETE對(duì)慢性缺氧PASMCs IKV的影響：采用排管給藥法觀察各濃度（1×10-8～1×10-6mol/L）15-KETE對(duì)IKV的影響。結(jié)果表明，15-KETE于3min內(nèi)作用穩(wěn)定，每間隔3min給一個(gè)藥物濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)15-KETE對(duì)IKV的影響呈濃度依賴性抑制，隨著濃度的增加，15-KETE使其I-V曲線明顯下移（圖2）。

圖2 不同濃度的15-KETE對(duì)慢性缺氧大鼠SMCs的IKV影響Fig.2 Effect of varying concentration of 15-KETE on IKv of PASMCs

2.3.3 15-KETE對(duì)正常和慢性缺氧大鼠PASMCs的IKV抑制率的比較：在急性分離的正常和缺氧的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌上，封接破膜形成全細(xì)胞記錄方式，將膜電位鉗制在-60mV，給予-60mV至+50mV（步幅為10mV）去極化方波刺激，于封接破膜形成全細(xì)胞記錄后第1min在浴槽內(nèi)采用排管給藥法觀察各濃度下（1×10-8～1×10-6mol/L）15-KETE對(duì)常氧、慢性缺氧PASMCs IKV的影響。15-KETE約于3min內(nèi)作用穩(wěn)定，每間隔3min給一個(gè)藥物濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種情況下15-KETE對(duì)IKV的影響呈濃度依賴性抑制。低濃度15-KETE（1×10-8mol/L）對(duì)常氧、慢性缺氧PASMCs IKV的平均阻抑率無(wú)顯著差異。較高濃度15-KETE（1×10-7、1×10-6mol/L）對(duì)缺氧PASMCs IKV的平均阻抑率顯著高于常氧PASMCs（圖3）。

圖3 15-KETE對(duì)正常和慢性缺氧大鼠PASMCs的IKV抑制率的比較Fig.3 Comparison of IKVinhibition induced by 15-KETE on rat PASMCs from normoxia and chronic hypoxia

3 討論

已知大鼠PASMCs至少上存在3種鉀通道，分別是延遲整流鉀通道（Kv）、鈣激活的鉀通道（KCa）和ATP敏感的鉀通道（KATP），目前的研究表明，Kv在控制靜息膜電位及氧感受方面起著重要的作用［10］。

本研究表明，在常氧和低氧兩種情況下，Kv阻斷劑4-AP均可引起PASMCs去極化，即Em負(fù)值升高，且這種變化在常氧和低氧時(shí)無(wú)差異，這說(shuō)明低氧并沒(méi)有改變Kv在控制Em方面的基礎(chǔ)作用。而特異性的KCa阻斷劑TEA無(wú)論在常氧還是低氧情況下對(duì)Em均無(wú)影響，說(shuō)明KCa對(duì)調(diào)節(jié)Em不起作用，這可能是因?yàn)镵Ca的激活電位高于Em所致［11］。

本研究結(jié)果表明，慢性低氧大鼠PASMCs Kv通道電流密度明顯減少，但單位細(xì)胞的電容即表面積無(wú)明顯變化，提示單位細(xì)胞的Kv通道電流幅度降低是電流密度變化的主要原因。但也有報(bào)道低氧對(duì)IKv無(wú)影響［12］，這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞與新鮮急性酶分離的細(xì)胞離子通道的特性發(fā)生了變化，抑或是因?yàn)閯?dòng)物的種屬、體內(nèi)或體外缺氧的不同，以及后者的PASMCs來(lái)源于主肺動(dòng)脈所致。本研究中PASMCs來(lái)源于肺內(nèi)動(dòng)脈4～6級(jí)分支，而這些動(dòng)脈中Kv細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)［11］。低氧抑制PASMCs IKv的機(jī)制目前尚未闡明，這可能是因?yàn)榈脱跻餚ASMCs表型轉(zhuǎn)化、PKC上調(diào)、抑制了低氧敏感性鉀通道的表達(dá)［13］，或是通過(guò)其他影響PASMCs增殖的轉(zhuǎn)錄因子，間接抑制IKv，如c-jun的過(guò)度表達(dá)不僅可以抑制PASMCs Kv活性，并可抑制Kv基因的表達(dá)［14］。

15-KETE是AA的15-脂質(zhì)氧化酶（15-LO）一種代謝終產(chǎn)物。由于缺氧可上調(diào)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞15-LO的表達(dá)［3］，因此15-KETE在PASMCs有其相應(yīng)的細(xì)胞分布及相應(yīng)的作用位點(diǎn)。我們先前研究表明，15-KETE以濃度依賴性方式強(qiáng)烈收縮離體肺動(dòng)脈環(huán)［4］，并且收縮作用依賴于Kv通道、細(xì)胞外液鈣離子和L-型鈣離子通道［5］。另有研究表明，缺氧抑制PASMCs上的K+通道，主要是Kv通道［15］。因此，15-KETE可能是聯(lián)系缺氧與Kv通道之間的重要介質(zhì)。

本研究發(fā)現(xiàn)，15-KETE在常氧和慢性低氧時(shí)均可引起Em的升高，但升高的程度并無(wú)差異，不同的是慢性低氧時(shí)，較高濃度15-KETE對(duì)IKv的抑制作用明顯強(qiáng)于常氧時(shí)，這說(shuō)明低氧可能改變了PASMCs對(duì)一些內(nèi)源性因子的敏感性。

先前的研究已經(jīng)證明，在有鈣的環(huán)境中，15-KETE對(duì)常氧PASMCs IKv的抑制作用明顯增強(qiáng)［6］。因此，本研究中慢性低氧時(shí)15-KETE對(duì)IKv的抑制作用加強(qiáng)，可能與慢性低氧時(shí)PASMCs細(xì)胞內(nèi)鈣水平增高有關(guān)［16］。

另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性低氧及15-KETE對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的Cm沒(méi)有影響，說(shuō)明兩者均不能改變肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的大小。

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