Fmr1基因敲除對小鼠生理發(fā)育和繁殖性能的影響

戴麗軍，葉炳飛，黃月玲

（廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣州 510182）

人類脆性X綜合征（fragile X chromosome syndrome，F(xiàn)raX）是最常見的遺傳性智力低下疾病之一，目前發(fā)現(xiàn)X染色體上Fmr1基因的缺陷是該病的誘因。Fmr1基因的表達(dá)產(chǎn)物是FMR1蛋白（FMRP），F(xiàn)MRP在生物體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要作用［1］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常近交系FVB小鼠為背景，利用基因敲除技術(shù)將Fmr1基因定點(diǎn)滅活制備而成的動(dòng)物模型［2］，目前已廣泛應(yīng)用于FraX的研究。

我們利用毒理學(xué)和畸胎學(xué)相結(jié)合的行為致畸試驗(yàn)方法［3］，對廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)的清潔級FVB.KO和FVB進(jìn)行了一系列生長發(fā)育和神經(jīng)行為功能的測試，并對所獲得的數(shù)據(jù)加以分析比較，借以了解Fmr1基因敲除對動(dòng)物的繁殖性能和生理發(fā)育、尤其是子代神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)育的影響，為該基因敲除品系小鼠的研究應(yīng)用提供背景資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

FVB.KO和FVB于2002年由廣州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所從荷蘭Erasmus大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心引進(jìn)，經(jīng)廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育飼養(yǎng)，分別建立了清潔級種群。（合格證號：2004A053和2004A052）。

選取10周齡清潔級FVB.KO和FVB種鼠各20只，雌雄各半進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在清潔級環(huán)境中，合格證號：飼養(yǎng)環(huán)境2004B022；實(shí)驗(yàn)環(huán)境2004C075。室內(nèi)溫度為20℃～26℃，相對濕度為50％～70％，光照明暗交替12h：12h。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

JJ100電子天平，精確到0.01g。常熟雙杰測試儀器廠制造。

1.4 測定方法

選用10對FVB和10對經(jīng)PCR檢測為FVB.KO的10周齡種鼠，采取1∶1全部同胞兄妹近親繁殖的方法，連續(xù)生產(chǎn)。動(dòng)物飲用酸化水（pH2.5～3.0），食用全價(jià)營養(yǎng)飼料，飲水和飼料每日更換一次，墊料每周更換兩次，所用物品均通過高溫高壓滅菌（121℃，30min），飼養(yǎng)流程嚴(yán)格按照清潔級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施SOP操作。

選取各對第2胎仔鼠進(jìn)行繁殖性能和生理發(fā)育的觀察記錄。

繁殖性能測定指標(biāo)包括：窩產(chǎn)仔數(shù)、初生仔鼠體重、初生仔鼠體長、離乳均重、離乳體長、雌雄比例和離乳率［4］。

生理發(fā)育測定指標(biāo)包括：耳廓分離、體毛長出、門齒萌發(fā)和眼瞼開裂［5］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Fmr1基因敲除小鼠的繁育

FVB.KO小鼠為近交系小鼠，按照要求，選擇遺傳特征穩(wěn)定、繁殖能力強(qiáng)、母性好的FVB.KO全部同胞兄妹，按雌雄1∶1的方式進(jìn)行繁殖。圖1～4顯示的是FVB.KO小鼠的正常繁育狀態(tài)。

圖1 雌雄1∶1同胞兄妹繁殖（雌鼠已孕）Fig.1 Brother-sister breeding（the male mouse was pregnant）

圖2 帶乳鼠Fig.2 Lactation mouse and suckling mice

圖3 雌雄種鼠及新生鼠Fig.3 Father，mother and newborns

圖4 雌雄種鼠及幼鼠Fig.4 Father，mother and their babies

2.2 Fmr1基因?qū)π∈蠓敝承阅艿挠绊?/p>

經(jīng)t-檢驗(yàn)，與FVB比較，F(xiàn)VB.KO的窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳率等值偏低，但無顯著差異（P＞0.05）。兩品系的雌雄比例有極顯著差異（P＜0.01）（表1）。

表1 FVB.KO與FVB的繁殖性能Tab.1 The reproduction performance in FVB.KO and FVB

2.3 Fmr1基因?qū)π∈笊戆l(fā)育指標(biāo)的影響

經(jīng)t-檢驗(yàn)，兩品系在耳廓分離、體毛長出、門齒萌發(fā)和眼瞼開裂的時(shí)間方面差異不顯著（表2）。

表2 FVB.KO和FVB生理發(fā)育指標(biāo)測定Tab.2 The indices of behavioral development in FVB.KO and FVB

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系在長期封閉繁育的過程中，基因得以明確并穩(wěn)定遺傳，形成了各自遺傳特性（包括繁殖性能）方面的明顯差異［6］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常的近交系FVB小鼠為背景，利用基因敲除技術(shù)，敲除X染色體上的脆性X智力低下1號基因（fragile X retardation-1，F(xiàn)MR1）制備的人類脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)raX）動(dòng)物模型。Fmr1基因在生物體發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，具有組織特異性和時(shí)間特異性，該基因參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)發(fā)育過程的調(diào)節(jié)。脆性X綜合征是一種發(fā)病率僅次于先天愚型的遺傳性先天性智力低下綜合征，是由Fmr1基因缺陷引起Fmr1蛋白（fragile X retardation-1 protein，F(xiàn)MRP）合成減少而導(dǎo)致的，是X連鎖不完全顯性遺傳病。該病在人群中發(fā)病率男性約1/4000，女性約1/8000。患者的體征、認(rèn)知及行為特征取決于性別和分子突變情況［7-9］。

神經(jīng)行為毒理學(xué)方法通常用于篩檢具有神經(jīng)毒性的化學(xué)物和藥物，主要分為兩類：生理發(fā)育和行為分析。1991年，美國EPA提出行為測試指南包括行為功能觀察、活動(dòng)度、程度控制行為測定，后來又增加發(fā)育神經(jīng)毒測定，包括行為功能測定、活動(dòng)度、聽覺驚愕、學(xué)習(xí)和記憶等［10］。鑒于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是一個(gè)精密的時(shí)程化改變過程，這一過程中的每一步驟都必需在時(shí)間和空間上準(zhǔn)確無誤地進(jìn)行，任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生障礙都將導(dǎo)致神經(jīng)功能的改變［3］，我們將這一方法推廣至研究與神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育相關(guān)的基因功能的檢測，為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基因作用提供簡單有效的評價(jià)手段。

在實(shí)驗(yàn)中我們選擇遺傳特征穩(wěn)定、繁殖能力強(qiáng)、母性好的FVB.KO和FVB進(jìn)行繁育，對各品系第二胎新生仔鼠的多項(xiàng)生理發(fā)育和繁殖性能指標(biāo)進(jìn)行了較全面的測定分析［3-6］，初步研究了Fmr1基因敲除對動(dòng)物繁殖與生理發(fā)育的影響。在繁殖性能方面，F(xiàn)VB.KO不僅具有其背景FVB的特點(diǎn)，而且具有基因敲除后形成的自身特點(diǎn)。FVB.KO除窩產(chǎn)仔數(shù)、離乳率等指標(biāo)偏低外，與FVB比較，最大的差異是雌性后代所占的比例明顯降低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)VB雌性后代數(shù)量是其雄性后代數(shù)量的1.64倍，而FVB.KO則是0.85倍，兩者間差異極顯著。造成這種結(jié)果的原因尚待進(jìn)一步分析，我們會(huì)在今后的繁育過程中密切跟蹤。在生理發(fā)育方面，F(xiàn)VB.KO與FVB在耳廓分離、體毛長出、門齒萌發(fā)和眼瞼開裂的發(fā)育時(shí)間上較接近，沒有明顯差異?？沙醪降贸鼋Y(jié)論：FMR1基因的破壞對小鼠生理發(fā)育各項(xiàng)指標(biāo)的影響不大。

［1］黃濤，沈巖，吳冠蕓.FMR1基因結(jié)構(gòu)與功能［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1995，26（3）：218-222.

［2］Cathy E.Bakker，Coleta Verheij，Rob Willemsen，et al.Fmr1 Knockout Mice：A model to study fragile X mental retardation［J］.Cell，1994，78：23-33.

［3］姬艷麗，佘素貞，豆正東，等.昆明種小鼠正常行為發(fā)育指標(biāo)探討［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（6）：429-432.

［4］吳清洪，顧為望，張嘉寧，等.SPF級C57BL/6J小鼠生長發(fā)育和繁殖性能指標(biāo)的測定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（10）：606-607，614.

［5］Brunner RL，Mclean M，Vorhees CV，et al.A comparison of behavioral and anatomicalmeasures of hydroxyurea induced abnormalities［J］.Teratology，1978，18：379-384.

［6］任連生，白喜花，閆磊，等.SX1近交系小鼠生長繁育主要指標(biāo)的測定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（8）：470-472.

［7］羅莉，鄔晉芳，夏露.脆性X綜合征FMR1基因研究進(jìn)展［J］.中國婦幼健康研究，2006，17（5）：415-417.

［8］戴麗軍，黃莉，廖軍.長爪沙鼠血清雌性激素的比較研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，13（4）：246-248.

［9］黃濤，沈巖，吳冠蕓.FMR1基因結(jié)構(gòu)與功能［J］.生理科學(xué)進(jìn)展，1995，26（3）：218-222.

［10］Karlberg J.兒童早期生長遲緩［J］.中華兒童保健雜志，1996，4（3）：11-12.