糖皮質激素對機械通氣大鼠肺組織iNOS、NO表達的影響

劉 芳，張新日，張 巖

（山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院呼吸科，太原 030001）

呼吸機所致肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是影響機械通氣臨床療效的一個重要因素，研究VILI的發(fā)生機制和防治措施對提高機械通氣的應用水平以及危重癥患者的救治水平均具有重要意義［1］。本研究擬通過動物試驗，探討糖皮質激素對大潮氣量機械通氣大鼠肺組織誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及一氧化氮（NO）表達的干預作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型制備

雄性健康Wistar大鼠24只（山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供）［SCXK（晉）2009-001］，體重310～380g，隨機分為3組①對照組：未行機械通氣；②機械通氣組：VT=40mL/kg；③地塞米松干預組：VT=40mL/kg，通氣前1h經腹腔注入DXM（6mg/kg）。

用25％烏拉坦4mL/kg腹腔注射將大鼠麻醉后行氣管切開。除對照組外，其余大鼠均通過膠管與動物人工呼吸機（DH-150型，浙江大學醫(yī)學儀器廠制造）連接，進行機械通氣。各組大鼠的通氣參數除潮氣量外，其余參數均相同，即I∶E=1∶3，F(xiàn)iO2=21％，F(xiàn)=60次/min，通氣時間為90min。

通氣結束后經腹主動脈取血2～3mL，肝素鈉抗凝，離心取上清液置于EP管中，-80℃凍存?zhèn)溆?。然后將大鼠放血處死，切取肺臟。在無菌狀態(tài)下取右肺上葉置于已消毒的EP管中，-80℃冰箱保存，用于RT-PCR及肺組織NO測定。取右肺下葉以10％中性福爾馬林灌注固定，24h后行常規(guī)石蠟包埋，用于HE及免疫組織化學染色。

1.2 RT-PCR法檢測肺組織iNOSmRNA的表達

用Trizol（TaKaRa寶生物工程有限）提取肺組織總RNA，以大鼠GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）作為內參。大鼠iNOS及內參引物由北京奧科生物技術有限公司合成。大鼠iNOS及內參（GAPDH）引物由北京奧科生物技術有限公司合成。iNOS上游引物：5’-GGC TCC AGC ATG TAC CCT-3’；下游引物：5’-TCC TGC CCG CTG AGT TCG T-3’；反應條件：95℃預變性4min，95℃變性30s，55℃復性30s，70℃延伸30s，30個循環(huán)，最后70℃延伸2min。GAPDH上游引物：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’；下游引物：5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’；反應條件：95℃預變性4min，95℃變性30s，59℃復性30s，70℃延伸30s，30個循環(huán)，最后70℃延伸5min。取PCR產物在2％瓊脂糖凝膠上進行電泳，用天能2500凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描條帶密度，以目的基因光密度值與內參光密度值的比值表示肺組織iNOS mRNA的相對表達量。

1.3 肺組織iNOS免疫組織化學染色

采用鏈霉素親和-生物素-過氧化酶復合物（SABC）法檢測大鼠肺組織iNOS蛋白表達。操作步驟按試劑盒說明（購自武漢博士德生物有限公司）進行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶50，以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對照。

結果判斷：陽性表達為細胞質呈棕褐色，陽性表達細胞多集中于細支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞。采用MIAS-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)檢測每個高倍視野（40×10）的目標平均灰度（GO）、視場平均灰度（GV）和面積密度（AAR），并計算出陽性單位，即PU=［∣GO-GV︱×100］/［（1-AAR）×Gmax］，其中Gmax為最大灰度（255）［1］。

1.4 肺組織和血漿NO測定

采用硝酸還原酶法測定肺組織和血漿NO含量，方法及操作步驟按試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明進行。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達

各組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達測定結果見表1和圖1～5。結果顯示，機械通氣組和DXM干預組肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01），而DXM干預組肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達水平較機械通氣組明顯降低（P＜0.01）。

表1 各組大鼠肺組織iNOSmRNA及其蛋白表達Tab.1 The expression of iNOS mRNA and proteinum in lung in groups

圖1 各組大鼠肺組織iNOS mRNA表達（RT-PCR）Fig.1 The expression of iNOS mRNA in lung tissue in groups（RT-PCR）

圖2 機械通氣組大鼠肺組織彌漫性肺間質水腫和炎性細胞浸潤Fig.2 Different levels of interstitial and alveolar edema，infiltration and activation of inflammation cells could be seen in ventilation group

圖3 對照組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.3 iNOS protein in lung tissue in control group（SABC）

2.2 血漿和肺組織NO測定

各組大鼠血漿和肺組織NO含量測定結果見表2。結果顯示：機械通氣組和DEX干預組血漿和肺組織NO含量均明顯高于對照組（P＜0.01），而DXM干預組血漿和肺組織NO含量較機械通氣組明顯降低（P＜0.01）。

圖4 機械通氣組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.4 iNOS protein in lung tissue in ventilation group（SABC）

圖5 DXM干預組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.5 iNOS protein in lung tissue in DXM group（SABC）

表2 各組大鼠血漿和肺組織中NO含量Tab.2 NO in lung and blood in groups

3 討論

呼吸機所致肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是影響機械通氣臨床療效的一個重要因素，其發(fā)病機制相當復雜，涉及面非常廣泛，是目前醫(yī)學界研究的熱點之一［2］。研究表明，大潮氣量機械通氣可引起炎癥細胞在局部肺組織聚集、活化，并釋放多種炎性介質和細胞因子［3］。這些炎性介質和細胞因子不但可直接造成肺組織損傷，還可激活更多的炎性細胞釋放炎性介質或細胞因子，從而形成瀑布效應，使機體損害因素進一步放大。本研究結果顯示，機械通氣組大鼠肺組織可見彌漫性肺間質水腫和炎性細胞浸潤，進一步證實大潮氣量機械通氣可導致急性肺損傷的發(fā)生。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是由多種細胞產生的廣泛存在于生物體內的小分子物質，體內NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化生成。NOS依其激活條件可分為固有型（cNOS）和誘導型（iNOS）兩種類型［4，5］。正常時，cNOS催化體內生成少量NO，具有多種重要的生理功能。在病理條件下，由iNOS誘導產生的大量NO則可作為一種炎性介質參與多種疾?。ㄈ缰夤芟⒓毙院粑狡染C合征）的發(fā)病過程，日益受到了人們的關注［6，7］。然而，NO是否參與VILI的發(fā)生過程，目前文獻報道甚少。本實驗結果顯示，機械通氣組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達水平，以及血漿和肺組織NO含量均明顯高于對照組，說明大潮氣量機械通氣可誘導局部肺組織iNOS高表達而合成大量NO，后者不但具有細胞毒性作用，還可參與體內氧自由基形成，促進體內炎癥反應，從而直接和間接引起肺組織損傷［2］。

糖皮質激素（glucocorticoids，GCs）是一種藥理作用廣泛的藥物，對非特異性炎癥反應具有明顯抑制作用。研究表明，GCs不但能抑制PMN和血小板聚集、活化，還能促進肺表面活性物質的合成，穩(wěn)定溶酶體膜，減少溶酶體酶及相關介質的釋放，因而很早就用于ALI/ARDS的治療［8，9］。近年來，GCs對iNOS及NO的作用逐漸被人們所認識。有人在LPS誘導的急性肺損傷動物實驗中采用逆轉錄-聚合酶鏈反應技術證明，地塞米松可使肺組織iNOS mRNA表達量明顯減少，且具有劑量相關性，提示GCs可在轉錄水平上抑制iNOS的活性，從而減少NO的生成［10］。本實驗結果顯示，DXM干預組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達水平，以及血漿和肺組織NO含量均較機械通氣組明顯降低，說明糖皮質激素可通過抑制肺組織iNOS的表達，減少NO生成，對機械通氣大鼠肺組織具有一定保護作用。然而，糖皮質激素究竟通過何種途徑抑制肺組織iNOS表達，目前尚不清楚，推測其作用可能與其抑制PMN等炎癥細胞活化及釋放炎性介質有關，但其具體作用機制還有待進一步研究［11］。

綜上所述，機械通氣可使肺泡上皮及毛細血管內皮細胞受到過度牽拉，導致氣血屏障結構受損，使炎癥細胞、炎性介質和細胞因子構成的調節(jié)網絡失控，從而誘導iNOS mRNA及其蛋白高表達，產生大量內源性NO而引起肺組織損傷。糖皮質激素可通過抑制肺組織iNOS mRNA及其蛋白的表達，減少NO的生成，對VILI具有一定防治作用。

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