利用人臍帶血干細(xì)胞制備人鼠肝組織嵌合體模型

周 笛，范 沛，張 建，顧為望，姚 剛，劉光澤

（1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 501515；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心，廣州 510602）

人臍血中富含豐富的臍血干細(xì)胞，而且來源豐富、簡單易得，目前成為干細(xì)胞研究的應(yīng)用熱點(diǎn)，臍血干細(xì)胞在誘導(dǎo)因子作用下可分化為肝細(xì)胞，這個(gè)在體外研究早已有報(bào)道［1，2］。這無疑給肝病的治療帶來很大的有利條件。據(jù)世界衛(wèi)生組織調(diào)查，全球約有20億人感染過乙型肝炎病毒（HBV），其中3.5億是慢性HBV攜帶者。HBV又是肝細(xì)胞癌（HCC）的主要誘因，流行病學(xué)研究表明，乙肝與肝細(xì)胞癌（HCC）的發(fā)生密切相關(guān)［3，4］，因此HBV深切關(guān)系著人們的生命和健康。乙型肝炎的研究長久以來面臨缺少穩(wěn)定可靠的HBV感染細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，從而阻礙了對HBV致病機(jī)制、抗病毒藥物篩選和疫苗研制等的研究進(jìn)程。近年來隨著肝移植技術(shù)的迅速發(fā)展，小鼠肝臟嵌合人肝細(xì)胞將為人類針對人體肝臟疾病和肝細(xì)胞病毒的研究提供佳的體內(nèi)模型［5］。我們以裸鼠作為受體，通過移植人臍血造血干細(xì)胞，探索建立一種制備人肝組織嵌合的動(dòng)物模型可能性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：年齡為6周的雄性裸鼠（BALB/c nu-小鼠）21只（其中5只為對照組），體重18～22g；另選取年齡為6周、體重18～22g的雄性KM小鼠5只，作為對照組，均購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中心SPF級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部［SCXK（粵）2006-0015］。

1.1.2 人臍帶血干細(xì)胞：由廣東省臍帶血造血干細(xì)胞庫（廣東省婦幼保健院）提供。

1.1.3 HBV陽性血清：由解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心提供，血清HBVDNA定量檢測為107copy/mL。

1.2 方法

1.2.1 人臍血干細(xì)胞的移植：取裸鼠17只作實(shí)驗(yàn)組，每只經(jīng)尾靜脈注射0.2μL人臍帶血干細(xì)胞，1周后，再次按同樣方法再次移植0.2μL人臍血干細(xì)胞。并持續(xù)觀察。

1.2.2 HBV的感染和檢測：移植干細(xì)胞后第21天經(jīng)尾靜脈每只注射0.1mL人HBV血清。7d后取肝組織，HBsAg免疫組化檢測。

1.2.3 肝臟甲胎蛋白的免疫組化檢測：實(shí)驗(yàn)組裸鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，取肝臟組織，大小約0.5cm×0.5cm×0.3cm，4％多聚甲醛固定，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，脫蠟至水，3％H2O2處理15min，檸檬酸緩沖液微波抗原修復(fù)10min，一抗（兔抗AFP多克隆抗體，購自Invitrogen，編號：18-0055）。

1.2.4 血清甲胎蛋白和白蛋白的定量檢測：感染1周后取實(shí)驗(yàn)組小鼠血清，經(jīng)摘除眼球取靜脈血，每只約取1mL，4℃、3000r/min離心15min分離各約200μL血清，常規(guī)放射免疫法測定血清甲胎蛋白和全自動(dòng)生化儀測定血清白蛋白含量。另用同樣方法定量檢測正常裸鼠和KM小鼠（各5只）血清作為對照組。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析：利用SPSS13.0（SPSS Inc.U.S.A）分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 人臍血干細(xì)胞的移植

實(shí)驗(yàn)組裸鼠共成功注射17只，其中2只非正常死亡，剩下15只生存狀態(tài)良好。

2.2 血清甲胎蛋白和白蛋白含量

不同組別間血清甲胎蛋白和白蛋白含量比較見表1。實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝組織的AFP含量顯著高于裸鼠和KM鼠的對照組（P＜0.05）；而實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝組織中的ALB含量則低于裸鼠和KM對照組（P＜0.05）。

表1 不同組別間AFP和ALB含量Tab.1 The contents of AFP and ALB in different groups

2.3 肝臟甲胎蛋白的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)方法對移植人臍血干細(xì)胞的裸鼠于進(jìn)行肝臟組織AFP檢測，移植后第7天（圖1）即可觀察到AFP陽性細(xì)胞存在，陽性細(xì)胞分布于肝表面及肝小葉內(nèi)，AFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。再分別對移植后14d（圖2），21d（圖3）的小鼠肝臟檢測，均可見到AFP陽性肝細(xì)胞，表明嵌合的人肝細(xì)胞可一定時(shí)期在小鼠的肝臟內(nèi)存在。（圖見彩插2）

2.4 乙肝血清病毒感染后肝臟HBsAg組化

乙肝血清病毒感染7d后，取小鼠肝臟組織HBsAg組化檢測，顯示陽性（圖4），顯微鏡低倍鏡下可顯示密集成片的陽性細(xì)胞。HBsAg在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，呈現(xiàn)棕黃色。表明人臍血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)不僅存活，而且能被乙肝血清病毒感染。（圖見彩插2）

3 討論

干細(xì)胞能在正常肝臟內(nèi)存活可分化成肝細(xì)胞［6］。臍血造血干細(xì)胞的含量等于或超過骨髓，并且常常高于成人外周血。造血干細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)后在肝臟內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞［7］。還有研究證明，臍血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可以自分泌方式提供自身某些生長因子，促進(jìn)自身增殖分化［8］。BALB/c裸鼠先天性胸腺發(fā)育不良，體內(nèi)T細(xì)胞數(shù)量明顯減少，缺乏細(xì)胞免疫功能，并且價(jià)格容易獲得，以此為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備小鼠感染HBV的人鼠肝臟嵌合模型具有重要的意義。故本研究采用尾靜脈注射移植人臍帶血干細(xì)胞的方法制備人鼠肝嵌合體小鼠，方法簡便，成功率高。

AFP是人體胚胎時(shí)期胎兒肝細(xì)胞和卵黃囊內(nèi)合成的一種糖蛋白，胎兒出生1～2周后迅速下降至成人水平（0～20μg/L）［9］。AFP的生成量和胎兒肝臟或肝細(xì)胞再生時(shí)的分裂細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，故有人認(rèn)為AFP是由分裂增殖的肝細(xì)胞所產(chǎn)生，也可用于了解肝細(xì)胞再生情況［10］。因此我們以AFP作為檢測指標(biāo)，用免疫組化法來檢測嵌合小鼠肝組織。臍血干細(xì)胞移植7d后采集小鼠肝臟標(biāo)本檢測到AFP陽性細(xì)胞，AFP表達(dá)于肝細(xì)胞質(zhì)中，染色細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。顯微鏡下觀察可見細(xì)胞呈圓形，類圓形，為成熟肝細(xì)胞表型，與正常肝細(xì)胞相似。之后又對第14天、第21天采集的小鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行AFP免疫組化檢測，陽性表達(dá)持續(xù)，分析人臍血干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組裸鼠的肝臟內(nèi)分化成為有活性的人肝細(xì)胞。對照組肝臟組織中AFP則顯示陰性。HBV感染后7d，肝臟組織HBsAg免疫組化檢測顯示陽性。此外，RIA定量測定實(shí)驗(yàn)組和對照組的AFP和ALB的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示有顯著差異（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組的AFP明顯高于對照組，實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟組織經(jīng)免疫組化可看到肝臟組織呈現(xiàn)棕黃色，表明有陽性細(xì)胞存在，提示有新的人肝細(xì)胞生成。

ALB主要由肝細(xì)胞合成分泌［11，12］，其它組織細(xì)胞分泌極少，是最常用和最可靠的肝細(xì)胞功能檢測指標(biāo)。ALB的檢測可代表肝臟的合成和儲備功能。肝細(xì)胞的成熟會使ALB合成增多，而細(xì)胞的活力下降會使ALB合成減少。實(shí)驗(yàn)組在感染后的ALB含量低于正常小鼠，提示肝細(xì)胞在體內(nèi)存活并具有生物學(xué)特性。已有研究證明肝損傷可使ALB降低［13］，提示實(shí)驗(yàn)組被感染肝臟肝功能受損、使蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和釋放發(fā)生障礙促使ALB低于對照組。

有人利用人類特有的肝臟細(xì)胞、膽管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物來分析臍血干細(xì)胞移植小鼠肝臟細(xì)胞；用FISH試驗(yàn)檢測人和鼠的DNA，RT-PCR檢測人ALB，結(jié)果表明：人血清白蛋白（hALB）、G蛋白（GS）、抗細(xì)胞角質(zhì)蛋白-18（CK-18）、AFP、抗細(xì)胞角質(zhì)蛋白-19（CK-19）、ALBmRNA、CK-18mRNA、AFPmRNA等在鼠肝組織中被發(fā)現(xiàn)［14-16］，證明了人類臍血干細(xì)胞可以在NOD/SCID小鼠肝內(nèi)生長，并分化成為成熟肝細(xì)胞。另外，利用雙免疫熒光染色法（抗人類肝細(xì)胞和抗人類ALB抗體）亦可證明嵌合鼠肝臟內(nèi)存在能產(chǎn)生ALB的臍血來源的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)與正常肝細(xì)胞一樣的雙核結(jié)構(gòu)，并且持續(xù)到55周仍可被檢測到［16］，更是證明了這一理論的可靠性。所以，本實(shí)驗(yàn)將人臍血干細(xì)胞移植到裸鼠肝臟內(nèi)，并用HBV進(jìn)行感染，制備了HBV人鼠嵌合肝模型。為進(jìn)一步研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為臍血干細(xì)胞在肝臟疾病中的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

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