早期B細(xì)胞因子與骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展

張曉娟 郭常輝 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400010)

遺傳基因及其表達(dá)對于機(jī)體的生長、發(fā)育、成熟、衰老甚至死亡起著重要作用。新近發(fā)現(xiàn)〔1〕核轉(zhuǎn)錄因子-早期B細(xì)胞因子(early B-cell factor，EBF)家族除與骨重建關(guān)系密切外，EBF-1在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞(Obs)的發(fā)育、分化方面作用明顯。本文旨在探討EBF-1與骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 EBF-1的結(jié)構(gòu)、基因及功能

人EBF-1屬于核轉(zhuǎn)錄因子EBF家族，為591個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈核蛋白。EBF家族均為核蛋白，又稱作COE或者O/E〔2〕。Liberg等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)在人和鼠體內(nèi)均表達(dá) EBF 家族的4個(gè)成員:EBF1、EBF2、EBF3及 EBF4，均表達(dá)于 B淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及其他幾種類型的細(xì)胞。在不同的動(dòng)物中，某些EBF基因存在不同的剪接轉(zhuǎn)錄本，目前關(guān)于這些不同剪接轉(zhuǎn)錄本的功能結(jié)構(gòu)域和表達(dá)模式尚待進(jìn)一步研究。

人EBF-1 mRNA全長2 762 bp，基因定位在染色體5q34。EBF-1氨基端含有EBF家族特征性，與攜帶有5'-CCC NNG GG-3'的DNA序列相結(jié)合的非典型性的鋅指結(jié)構(gòu)，即H-X3-CX2-C-X5-C。EBF-1的羧基端含有EBF家族特征性的堿性螺旋一環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)域，也稱作rHLH結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是2個(gè)由15個(gè)氨基酸殘基組成高度同源的兩性螺旋和1個(gè)由7個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)，共同構(gòu)成HLH結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)核蛋白家族的同源或異源二聚體〔4〕。Roessler等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)EBF-1由2個(gè)啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，分別是距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)的EBF1α和距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較近的EBF1β。2個(gè)啟動(dòng)子介導(dǎo)產(chǎn)生不同的蛋白，EBF1α比EBF1β在氨基末端少14個(gè)氨基酸殘基，但2種異形體的功能相同。在調(diào)節(jié)B細(xì)胞發(fā)育的過程中，啟動(dòng)子EBF1β比EBF1α所起的作用更大，EBF1α由白細(xì)胞介素(IL)-7、早期轉(zhuǎn)錄因子(E2A)、EBF1和轉(zhuǎn)錄激活因子5(STAT5)激活;EBF1β由成對眶5基因(Pax-5)、聚氨酯1(PU-1)和E26轉(zhuǎn)錄因子1(Etsl)激活，它們共同形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。

EBF-1廣泛表達(dá)于人、鼠、果蠅及線蟲等體內(nèi)。從小鼠身上研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)、Obs、破骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和某些基質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)有EBF-1。EBF家族參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，以及嗅覺感受器的表達(dá)。人EBF-1對于嗅神經(jīng)的發(fā)育、分化及表達(dá)起著重要作用，并積極參與了早期B淋巴細(xì)胞的發(fā)育，為B淋巴細(xì)胞發(fā)育所必需的蛋白。EBF1缺乏會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育停滯在B220+CD43+Ig-的祖B細(xì)胞階段，不能發(fā)育為成熟的B細(xì)胞。Akerblad等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)在人和小鼠的脂肪組織內(nèi)均有EBF1、EBF2、EBF3，但EBF1的表達(dá)含量最高，并與過氧化物酶體增值物激活受體γ(PPARγ)在抑制脂肪細(xì)胞分化方面起著類似的作用。Jimenez等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)PPARγ和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白 α(CCAAT/enhancer binding proteins α，C/EBPα)是EBF的直接靶基因，EBF1和EBF2的沉默可以阻滯3T3-L1細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，證實(shí)了EBF-1在脂肪細(xì)胞的分化中具有重要作用。Baba等〔8〕研究Wnt-β-catenin通路在造血細(xì)胞分化過程中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，淋巴祖細(xì)胞在恒定表達(dá)活性β-catenin時(shí)，EBF-1減少70%;而髓性祖細(xì)胞表達(dá)β-catenin時(shí)，EBF-1可以被檢測到，這提示EBF-1可能表達(dá)于淋巴與髓系分離前的最初階段的祖細(xì)胞內(nèi)。Martinez等〔9〕研究西班牙人患多發(fā)性硬化癥(MS)患者的EBF1基因發(fā)現(xiàn)，其rsl368297位的AA頻率明顯高于正常人，提示EBF1單核苷酸多態(tài)性與MS的發(fā)生有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)〔10〕Ebf1的mRNA和蛋白質(zhì)可以在人骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)、Obs分化的各個(gè)階段均有表達(dá)。

2 EBF-1與骨組織

人體內(nèi)骨組織時(shí)刻都在進(jìn)行骨形成與骨吸收，二者處于動(dòng)態(tài)平衡才能維持人體的健康與內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，在這個(gè)過程中EBF-1發(fā)揮了重要作用。

2.1 EBF-1與骨形成 Obs是骨形成的主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。從未成熟到可以分泌類骨質(zhì)的Obs，均可以見到EBF-1的表達(dá)。并不是所有的Obs均可以表達(dá)EBF-1，只有在骨表面的Obs才可能表達(dá)，這可能是由細(xì)胞內(nèi)部功能不同所致〔11〕。在EBF-1-/-小鼠模型身上，Obs數(shù)目明顯增加，可解釋其伴隨現(xiàn)象:如骨形成速率增加、骨小梁數(shù)目增加、類骨質(zhì)容積和厚度的增加以及血清中骨鈣素的明顯上升。但細(xì)胞本身在增殖和分化功能方面，并未見到明顯改變。Hesslein等〔10〕研究顯示4周齡 EBF-1-/-小鼠同12周齡 EBF-1-/-小鼠在成骨細(xì)胞數(shù)目方面并沒有明顯區(qū)別。雖然類骨質(zhì)增加明顯，類骨質(zhì)厚度在4周和12周齡EBF-1-/-小鼠分別增加了22%、25%，但礦化速度并未受到明顯影響，反應(yīng)骨形成的堿性磷酸酶(ALP)存在明顯的時(shí)間依賴性。4周齡EBF-1-/-小鼠的骨體積(BV，其不包含未礦化的類骨質(zhì))無明顯改變，但12周齡EBF-1-/-小鼠的BV較同齡正常小鼠增加了75%。

2.2 EBF-1與骨吸收 破骨細(xì)胞貼附在舊骨區(qū)域，分泌酸性物質(zhì)溶解礦物質(zhì)，分泌蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成骨吸收陷窩，是骨吸收的主要功能細(xì)胞。EBF-1-/-小鼠牙齒和視力發(fā)育正常，這說明小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞功能并未受到影響。Hesslein等〔10〕研究顯示盡管類骨質(zhì)厚度增加，骨小梁間距變窄，但12周齡EBF-1-/-小鼠的骨髓腔并未堵塞。同正常小鼠比較，4周和12周齡EBF-1-/-小鼠的骨髓腔無明顯改變。4周齡EBF-1-/-小鼠破骨細(xì)胞較正常4周齡小鼠有所減少，但12周齡EBF-1-/-小鼠與正常12周齡小鼠相比，破骨細(xì)胞增加了1.5倍，其原因可能是第4周時(shí)新生成的Obs功能尚未成熟，不足以介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化〔12〕。Obs影響破骨細(xì)胞分化的過程可能由于核因子κB受體活化因子配基(RANKL)或巨唑細(xì)胞集落刺激因子(MCSF)表達(dá)的減少，亦可能是成骨細(xì)胞產(chǎn)生的骨保護(hù)素(OPG)增多所致。Hesslein等在加入了RANKL或M-CSF的培養(yǎng)基中進(jìn)行骨髓體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示4 w時(shí)EBF-1-/-組破骨細(xì)胞數(shù)目較EBF+/+組明顯減少，隨著時(shí)間增加，這種差距逐步減少，12 w時(shí)EBF-1-/-組與EBF+/+組相比，破骨細(xì)胞差異不明顯。EBF-1-/-小鼠體內(nèi)B細(xì)胞基本停留在B220+階段，破骨細(xì)胞來源的祖細(xì)胞被更多的濃縮在骨髓里。提示EBF-1-/-小鼠可能存在生成破骨細(xì)胞的祖細(xì)胞受體表達(dá)減少從而使破骨細(xì)胞數(shù)目減少〔13，14〕。

2.3 EBF-1與骨重建 骨重建是骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡過程。骨密度反應(yīng)骨代謝，是評價(jià)骨質(zhì)疏松嚴(yán)重程度的一個(gè)重要指標(biāo)。骨密度與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞關(guān)系密切。在EBF-1-/-小鼠體內(nèi)，骨密度和Obs數(shù)目顯著增加。Obs表達(dá)EBF-1，決定了其與骨重建的關(guān)系非常密切〔15〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔16〕EBF-1-/-小鼠發(fā)育明顯落后于正常小鼠，在長達(dá)8個(gè)月的觀察期內(nèi)，EBF-1-/-小鼠發(fā)育遲緩一直存在，3～5 w時(shí)部分小鼠出現(xiàn)不明原因死亡。EBF-1-/-小鼠的骨生長板明顯老于同期的正常小鼠，但二者的軟骨細(xì)胞在功能上卻未見任何差別。由此可見EBF-1-/-小鼠的發(fā)育遲緩與軟骨細(xì)胞關(guān)系并不密切。

3 EBF-1與骨質(zhì)疏松的關(guān)系

機(jī)體骨形成與骨吸收是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，女性自40歲起，男性自50歲起，Obs的功能就逐步下降，破骨細(xì)胞骨吸收功能逐步加強(qiáng)，因而骨吸收大于骨形成，骨礦物質(zhì)含量及有機(jī)質(zhì)成等比例減少，骨量趨于下降，這一過程加上內(nèi)分泌、營養(yǎng)、遺傳、藥物或疾病的影響，使得機(jī)體易發(fā)生骨質(zhì)疏松。

hBMSCs 2-12具有向脂肪細(xì)胞或者骨化細(xì)胞分化的潛能，在骨質(zhì)疏松患者中不僅骨祖細(xì)胞減少，hBMSCs本身的骨化能力也下降。有研究發(fā)現(xiàn)EBF-1是調(diào)節(jié)hBMSCs向脂肪細(xì)胞或骨化細(xì)胞分化的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子〔17〕。由此可見，EBF-1可能會(huì)成為從根本上治療骨質(zhì)疏松的一個(gè)新靶點(diǎn)，但它們之間究竟存在怎樣的聯(lián)系，仍待進(jìn)一步深入研究。

4 展望

EBF-1-/-小鼠模型的建立證實(shí)了EBF-1在調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞或骨化細(xì)胞分化過程中扮演了重要角色，其表達(dá)異常會(huì)直接或間接影響骨量，從而影響全身的骨骼系統(tǒng)。在Obs的發(fā)育和分化過程中EBF-1起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。從分子學(xué)角度為骨質(zhì)疏松的病因增添了新的理論，進(jìn)一步證明了EBF-1在骨代謝平衡方面起著舉足輕重的作用，也為治療骨質(zhì)疏松提供了新的方向。但目前有許多問題仍待解決，如EBF-1的作用通路，EBF-1的劑量對hBMSCs分化的影響，以及與其他細(xì)胞因子相互作用調(diào)控骨代謝。目前臨床研究尚不多，均有待進(jìn)一步研究。相信在不久的將來，在治療骨質(zhì)疏松的領(lǐng)域，EBF-1會(huì)有更廣闊的前景。

1 Kieslinger M，F(xiàn)olberth S，Dobreva G，et al.EBF2 regulates osteoblast-dependent differentiation of osteoclasts〔J〕.Dev Cell，2005;9(6):757-7.

2 Gisler R，Jacobsen SE，Sigvardsson M.Cloning of human early B-cell factor and identification of target genes suggest a conserved role in B-cell development in man and mouse〔J〕.Blood，2000;96(4):1457-64.

3 Liberg D，Sigvardsson M，Akerblad P.The EBF/Olf/Collier family of transcription factors:regulators of differentiation in cells originating form all three embryonal germ layers〔J〕.Mol Cell Biol，2002;22(24):8389-97.

4 Dubois L，Vincent A.The COE-Collier/Olf1/EBF-transcription factors:structural conservation and diversity of developmental functions〔J〕.Mech Dev，2001;108(1-2):3-12.

5 Roessler S，Gyory I，Imhof S，et al.Distinct promoters mediate the regulation of Ebf1 gene expression by interleukin-7 and Pax5〔J〕.Mol Cell Biol，2007;27(2):579-94.

6 Akerblad P，Lind U，Liberg D，et al.Early B-cell factor(O/E-1)is a promoter of adipogenesis and involved in control of genes important for terminal adipocyte differentiation〔J〕.Mol Cell Biol，2002;22(22):8015-25.

7 Jimenez MA，Akerblad P，Sigrardsson M，et al.Critical role for Ebf1 and Ebf2 in the adipogenic transcriptional cascade〔J〕.Mol Cell Biol，2007;27(2):743-57.

8 Baba Y，Garrett KP，Kincade PW.Constitutively active β-catenin confers multilineage differentiation potential on lymphoid and myeloid progenitors〔J〕.Immunity，2005;23(6):599-609.

9 Martinez A，Mas A，de-las-Heras V，et al.Early B-cell factor gene association with multiple sclerosis in the Spanish population〔J〕.BMC Neurol，2005;5:19.

10 Hesslein G，F(xiàn)retez JA，Xi Y，et al.Ebf1-dependent control of the osteoblast and adipocyte lineages〔J〕.Bone，2009;44(4):537-46.

11 Lagergren A，Mansson R，Zeterblad J，et al.The Cxcl12，periostin and Ccl9 genes are direct targets for early B-cell factor in OP-9 stroma cells〔J〕.JBiol Chem，2007;282(19):14454-62.

12 Akerblad P，M?nsson R，Lagergren A，et al.Gene expression analysis suggests that EBF-1 and PPARgamma2 induce adipogenesis of NIH-3T3 cells with similar efficiency and kinetics〔J〕.Physiol Genomics，2005;23(2):206-16.

13 Li Y，Toraldo G，Li A，et al.B cells and T cells are critical for the preservation of bone homeostasis and attainment of peak bone mass in vivo〔J〕.Blood，2007;109(9):3839-48.

14 Horowitz MC，Xi Y，Pflugh DL，et al.Pax5-deficient mice exhibit early onset osteopenia with increased osteoclast progenitors〔J〕.Immunol，2004;173:6583-91.

15 Lin H，Grosschedl R.Failure of B-cell differentiation in mice lacking the transcription factor EBF〔J〕.Natura，1995;376(6537):263-7.

16 Uccelli A，Aloisi F，Pistoia V.Unveiling the enigma of the CNS as a B-cell fostering environment〔J〕.Trends Immunol ，2005;26(5):254-9.

17 Calvi LM，Adams GB，Weibrecht KW，et al.Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche〔J〕.Nature，2003;425(6960):841-6.