化瘀瀉濁方對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的影響

郭立芳 王月華 王鳳麗 李林林 袁國(guó)棟

(河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院，河北 石家莊 050011)

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種原因引起的慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎衰的共同途徑〔1〕。其程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-7是一種內(nèi)源性腎臟保護(hù)因子，具有抗纖維化作用，而這種保護(hù)作用可能與其拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1有關(guān)〔2〕。前期實(shí)驗(yàn)研究證明化瘀瀉濁方具有減輕腎臟病理?yè)p害，減少纖維化面積，抑制腎組織 TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的作用〔3〕。本研究以BMP-7為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探索本方對(duì)RIF發(fā)生發(fā)展的影響及其可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康、雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量(180±10)g，清潔級(jí)。由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):冀醫(yī)動(dòng)管字第703058號(hào))。

1.2 主要試劑及用藥 兔抗大鼠BMP-7單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供?；鲂?jié)岱接缮S芪30 g、生大黃 12 g、地龍 12 g、丹參 15 g、蒲公英 15 g、槐花 15 g、生牡蠣30 g、赤芍15 g等組成，由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)院藥房提供，上藥按比例稱取后，水煎、過(guò)濾、濃縮，裝入瓶中密封備用。纈沙坦由諾華公司提供(批號(hào)X0538)。

1.3 動(dòng)物模型和分組 動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、纈沙坦組、化瘀泄?jié)岱浇M、阿魏酸哌嗪分散片組，每組10只。纈沙坦組予纈沙坦5.3 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌服;化瘀泄?jié)岱浇M予化瘀泄?jié)岱?.7 g·kg－1·d－1經(jīng)口灌服;阿魏酸哌嗪分散片組予阿魏酸哌嗪分散片6.7 mg·kg－1·d－1經(jīng)口灌服;假手術(shù)組和模型組予同等量生理鹽水經(jīng)口灌服。手術(shù)前1日開始給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天。左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)按參照文獻(xiàn)〔3〕進(jìn)行。除假手術(shù)組外其余各組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。于實(shí)驗(yàn)第21日全部殺檢，取左側(cè)腎臟以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色進(jìn)行病理學(xué)觀察，并采用免疫組化方法檢測(cè)BMP-7的表達(dá)。

1.4 免疫組織化學(xué)方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自動(dòng)彩色病理圖像分析系統(tǒng)，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個(gè)視野，計(jì)算一個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，在光亮度和放大倍數(shù)一致的條件下對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量，最后取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行One-Way ANOVA和組間LSD法。

2 結(jié)果

2.1 HE及Masson染色結(jié)果 腎組織HE及Masson染色顯示:模型組腎間質(zhì)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生，腎小管部分萎縮、管腔閉塞或擴(kuò)張，腎小球數(shù)目明顯減少，面積縮小。腎小囊粘連或擴(kuò)張，小囊周圍大量纖維組織增生。其他各治療組間質(zhì)可見(jiàn)多少不等的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量纖維組織增生，腎小管輕度擴(kuò)張，部分腎小球輕度萎縮，小囊擴(kuò)張，腎小球數(shù)量無(wú)明顯改變。

2.2 BMP-7蛋白的表達(dá)、分布及半定量分析結(jié)果 BMP-7主要表達(dá)于集合管和腎小管胞質(zhì)中，在腎小球中未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。半定量分析顯示，在假手術(shù)組 BMP-7高表達(dá)(n=10，36.52% ±4.76%)，模型組(n=8，16.60% ±4.25%)及各治療組較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.01);纈沙坦組(n=9，26.52% ±4.89%)、化瘀泄?jié)岱浇M纈沙坦組(n=9，25.65% ±3.65%)、阿魏酸哌嗪分散片組(n=9，21.35% ±2.68%)與模型組相比，BMP-7的表達(dá)均呈顯著性增高(P＜0.01)，其中化瘀泄?jié)岱浇M優(yōu)于阿魏酸哌嗪分散片組(P＜0.01)，其他各組間均無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

3 討論

目前中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RIF病因病機(jī)有以下幾個(gè)方面。先天異常:腎為先天之本，稟賦于父母之精氣，若先天不足，腎精虧虛，則尿管及腎發(fā)育異常。濕熱蘊(yùn)結(jié):外邪入侵，郁而化熱，蘊(yùn)結(jié)于腎與膀胱;或內(nèi)熱下移，濕熱互結(jié)，膀胱氣化不利，水液內(nèi)停。瘀血絡(luò)阻:久病多瘀，血不利則病水，瘀血阻滯，尿路不暢，水濕郁結(jié)于內(nèi);或瘀血內(nèi)阻，氣滯血瘀，阻塞尿路?？傊?，本病是以濕熱、瘀血、絡(luò)阻等為基本病機(jī)，且相互轉(zhuǎn)化，相互影響。本實(shí)驗(yàn)以化瘀泄?jié)嶂兴帉?duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導(dǎo)的RIF大鼠模型進(jìn)行干預(yù)性治療，符合上述病機(jī)，具有可行性。方中丹參、赤芍、大黃、地龍活血通絡(luò)，化瘀泄?jié)?蒲公英、槐花清熱利濕，解毒泄?jié)?加用生牡蠣軟堅(jiān)散結(jié);生黃芪益氣，且黃芪益氣有走而不守之性，所以本品益氣不僅可以扶正固本，又可以助丹參、地龍等行血消瘀通絡(luò)祛邪治標(biāo)。諸藥相伍通補(bǔ)并用、標(biāo)本兼顧，故成為臨床用于延緩腎臟病發(fā)展進(jìn)程的基礎(chǔ)方。

RIF是多種慢性腎臟疾病如慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等發(fā)展到終末期腎衰的共同途徑。它以過(guò)量細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為特征。眾多細(xì)胞因子參與該過(guò)程，TGF-β1被公認(rèn)為是最主要的促纖維化因子，是各種因子誘導(dǎo)小管上皮-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)的中心環(huán)節(jié)〔4，5〕。BMP-7 是 TGF-β 超家族中的一員，有20個(gè)以上的亞型，主要在腎、骨組織中表達(dá)，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化和凋亡、調(diào)控組織發(fā)育和形態(tài)維持。在本研究中應(yīng)用化瘀泄?jié)嶂兴庍M(jìn)行藥物干預(yù)治療，觀察其對(duì)RIF的防治作用。發(fā)現(xiàn)化瘀泄?jié)岱浇M大鼠腎組織BMP-7蛋白較模型組顯著增高。且前期實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)化瘀瀉濁方具有減少纖維化面積，抑制腎組織TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)作用〔3〕。體外研究也表明BMP-7能夠拮抗TGF-β1的致腎纖維化作用，其活性減低可能會(huì)促進(jìn)腎纖維化的發(fā)生〔6，7〕。BMP-7是內(nèi)源性抗腎臟纖維化的調(diào)節(jié)因子，作為正調(diào)節(jié)因素的對(duì)應(yīng)物，起到制約腎臟纖維化的作用，BMP-7和TGF-β1的平衡對(duì)腎臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要作用。由此我們認(rèn)為BMP-7蛋白表達(dá)減少和TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達(dá)增多與腎小管間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，但其作用機(jī)制，有待深入研究。

1 張愛(ài)青，甘衛(wèi)華，陳榮華，等.胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及膠原合成的作用〔J〕.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007;23(2):127-9.

2 Wang S，Hirschberg R.BMP-7 antagonizes TGF-beta-dependent fibrogenesis in mesangial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2003;284(5):1006-13.

3 潘利敏，王鳳麗，王彥凱，等.化瘀瀉濁方對(duì)腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠TGF-β1、p-Smad 2/3的影響〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010;16(9):775-6.

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