代謝組學(xué)方法及其在中醫(yī)藥中的應(yīng)用

鄭敏霞，沈 潔（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，杭州市 310006）

從系統(tǒng)生物學(xué)的角度看，疾病是因蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)被“擾動(dòng)”而致，而中醫(yī)中的“證候”可能是蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)被“擾動(dòng)”后所發(fā)生的一種特異性變化狀態(tài)。這一被擾動(dòng)網(wǎng)絡(luò)可通過其分泌到血液和尿液的內(nèi)源性成分的改變而反映出來，而這種改變常以組、群、譜的特征出現(xiàn)。因此，反映中醫(yī)證候規(guī)律的“物質(zhì)基礎(chǔ)”將可能是“組”、“群”、“譜”集成的形式[1]。

1 代謝組學(xué)概念

1.1 代謝組學(xué)定義

代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科，指的是單個(gè)細(xì)胞、組織、器官或體液中所有小分子代謝物的集合，主要包括基因調(diào)控生物體在代謝過程中形成的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，即有機(jī)體內(nèi)合成的代謝物便構(gòu)成了代謝組，是關(guān)于生物體系內(nèi)源代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。它研究的是生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)及其與所受內(nèi)在或外在因素影響的關(guān)系。常用的方法是檢測和量化一個(gè)生物整體代謝隨時(shí)間變化的規(guī)律，并對之進(jìn)行編目；建立內(nèi)在和外在因素影響下，代謝整體的變化軌跡，反映某種病理（生理）過程中所發(fā)生的一系列生物事件[2]。

1.2 代謝組學(xué)研究意義

與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)的優(yōu)勢在于：①一切外源性刺激（如藥物、食品、環(huán)境等因素）都會促使生物體系進(jìn)行調(diào)節(jié)并導(dǎo)致代謝組的變化，這種變化是生物過程的最終結(jié)果，生物體許多不能從轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組體現(xiàn)出的變化可以通過代謝組體現(xiàn)；②代謝組學(xué)放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化，從而使檢測更容易；③代謝組學(xué)的研究不需建立全基因組測序及大量表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）的數(shù)據(jù)庫，且代謝物的種類要遠(yuǎn)小于基因和蛋白的數(shù)目；④由于給定的代謝物在每個(gè)組織中都是一樣的，所以研究中采用的技術(shù)更為通用也更易被人們所接受[3]，正如Billy David所言：“基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么”[4]。

2 代謝組學(xué)分析技術(shù)

先進(jìn)的分析檢測技術(shù)結(jié)合模式識別和專家系統(tǒng)等計(jì)算分析方法是代謝組學(xué)研究的基本方法。生物樣本中代謝物種類復(fù)雜，數(shù)目眾多，單一分析手段往往難以實(shí)現(xiàn)對樣本中全部代謝產(chǎn)物的測定。精確、靈敏、高通量的分析方法為代謝物分析提供化學(xué)手段，是代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)。各種常用的分離分析和不分離分析的手段都已經(jīng)應(yīng)用于代謝組學(xué)分析工作中，其中最常用的分析方法是1H核磁共振（1H-NMR）[5]和色譜（毛細(xì)管電泳）-質(zhì)譜聯(lián)用[6]，這兩種方法各具特點(diǎn)，互為補(bǔ)充。

代謝組學(xué)是數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的學(xué)科，各種模式識別的計(jì)算技術(shù)從大量的分析信號中發(fā)現(xiàn)有用知識或特征模式，是代謝組學(xué)研究的重要工具。海量數(shù)據(jù)要求適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)方法進(jìn)行有效信息的提取、噪聲信息的剔除等處理，最終達(dá)到能夠正確判斷或預(yù)測生物樣本的代謝模式，以及對具體代謝模式所對應(yīng)的生物標(biāo)志物（群）進(jìn)行識別的目的。

3 代謝組學(xué)在中醫(yī)藥中的應(yīng)用

代謝組學(xué)與中醫(yī)學(xué)在許多方面有相近的屬性，如果把它們有機(jī)的結(jié)合起來研究將是非常有意義的工作。代謝組學(xué)之父、英國倫敦帝國理工學(xué)院Jeremy Nicholson教授也認(rèn)為人體應(yīng)該作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來研究，應(yīng)用代謝組學(xué)和全面性系統(tǒng)策略來理解疾病過程，這與中醫(yī)的整體觀念和辨證論治思維方式不謀而合。

3.1 代謝組學(xué)與中醫(yī)辨證論治

代謝組學(xué)的研究通過對某一病證相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷，能夠幫助人們更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況，同時(shí)代謝組學(xué)還有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)記物而達(dá)到輔助臨床診斷的目的。它能夠通過檢測不同時(shí)間患者的尿液或血液，對這些由疾病引起的代謝產(chǎn)物的響應(yīng)進(jìn)行分析，即代謝物組分析。其準(zhǔn)確性依賴于儀器的性能，可以提高診治的科學(xué)化、定量化，避免人為因素的誤診。Zheng X等[7]采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用結(jié)合模式識別的代謝組學(xué)方法研究了冠心病中醫(yī)臨床分型的體內(nèi)物質(zhì)基礎(chǔ)，其兩證型間的多個(gè)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的含量存在明顯差異，且代謝組學(xué)的整體數(shù)據(jù)和標(biāo)志物信息均顯示出兩證型冠心病的差異，提示代謝組學(xué)所研究的體內(nèi)小分子化合物可能正是中醫(yī)分型的物質(zhì)基礎(chǔ)。Lu YH等[8]采用GC-MS聯(lián)用法測定健康人和原發(fā)性高血壓病患者的血清內(nèi)源性代謝物，結(jié)合主成分分析（PCA）和其偏最小乘方分析（PLS-DA），發(fā)現(xiàn)健康人和高血壓病患者血清代謝物譜有明顯的差異，利用馬氏距離（MD）分析可以清晰的區(qū)分3種中醫(yī)臨床證型的高血壓，同時(shí)還能顯示高血壓的發(fā)展過程。Li L等[9]應(yīng)用NMR技術(shù)分析氣虛血瘀證鼠的尿液代謝物，發(fā)現(xiàn)模型組在甲酸鹽和肌酐等產(chǎn)物中與正常組存在差異。上海交通大學(xué)藥學(xué)院采用代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)腎陽虛模型動(dòng)物的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常組動(dòng)物，而用溫陽中藥干預(yù)后，模型動(dòng)物的代謝譜回歸至正常范圍，呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的結(jié)果[10]?！白C”的研究可以和處于科學(xué)前沿、綜合程度很強(qiáng)的系統(tǒng)生物學(xué)方法相結(jié)合，同時(shí)也是生命科學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)的結(jié)合。這將把“證”的研究再次推向科學(xué)發(fā)展的前沿，成為中醫(yī)現(xiàn)代化最重要的研究方向之一。

3.2 代謝組學(xué)與中醫(yī)藏象理論

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的藏象學(xué)說就是研究內(nèi)在的生命本質(zhì)與外在現(xiàn)象的關(guān)系，揭示臟腑與形體諸竅、自然環(huán)境關(guān)系的學(xué)說。不同臟腑表現(xiàn)出來的生理現(xiàn)象是機(jī)體在不同環(huán)境下代謝結(jié)果的集中體現(xiàn)。換言之，藏象就是通過外在可見形象研究內(nèi)在不可見事物的一種方法，這種研究方法與現(xiàn)代“黑箱理論”有相似之處[11]。代謝組學(xué)可以通過對“黑箱”外在的內(nèi)源性代謝物的種類和數(shù)量的變化，與從疾病前兆到疾病發(fā)生、達(dá)到臨床診斷判定標(biāo)準(zhǔn)這一進(jìn)程作相關(guān)性研究，可以獲得疾病前判定的科學(xué)依據(jù)，有利于對疾病進(jìn)行預(yù)防和對預(yù)防效果的評價(jià)。例如偏頭痛的病因病機(jī)未明，一直以來有血管舒縮異常學(xué)說、神經(jīng)機(jī)能障礙學(xué)說、三叉神經(jīng)血管假說等，但是偏頭痛患者在先兆期和發(fā)病期都會出現(xiàn)前列腺素、神經(jīng)肽等一系列內(nèi)源性物質(zhì)的異常[12]，代謝組學(xué)可以通過對這一系列的內(nèi)源性物質(zhì)的監(jiān)控達(dá)到預(yù)防疾病的目的。

3.3 代謝組學(xué)與中藥方劑的整體療效

疾病是系統(tǒng)化、動(dòng)態(tài)化、整體化的過程，在治療時(shí)應(yīng)隨疾病的進(jìn)程不同而調(diào)整藥物劑量，甚至藥物的種類，而以單一成分作用到單靶點(diǎn)的西藥對此束手無策，因?yàn)榧膊“l(fā)生的不同階段需要不同的藥物組分發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，復(fù)方藥或多組分藥將在疾病治療中擔(dān)當(dāng)重要角色。Wei YJ等[13]采用LC-ESI-MS法進(jìn)行了復(fù)方丹參制劑體內(nèi)代謝組學(xué)研究，分析測定了14種皂苷、13種酚酸和9種醌類化合物，而且檢測了口服該藥后鼠血漿、尿液和糞便中的53種代謝產(chǎn)物，包括30種原型化合物和23種轉(zhuǎn)化后的化合物，并且得到了復(fù)方丹參制劑中幾種成分的代謝途徑，揭示了該復(fù)方制劑的體內(nèi)過程和活性物質(zhì)基礎(chǔ)。四君子湯在臨床上可以治療腹瀉和便秘，這種可治療截然相反的兩個(gè)疾病的方劑使用在西醫(yī)里是不可思議的。其實(shí)中醫(yī)用它來主治脾胃氣虛證，而脾胃氣虛證可以理解成導(dǎo)致代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生特定的損傷或破壞，這種損傷的兩個(gè)“極端”的結(jié)果就是腹瀉和便秘，四君子湯的使用一旦“方證對應(yīng)”，就可以通過多種成分、多層次、多靶點(diǎn)地對“網(wǎng)絡(luò)性”損傷進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到治療疾病（甚至是相反疾病的）的效果。中藥（尤其是復(fù)方）的整體性作用機(jī)制和療效在系統(tǒng)代謝組學(xué)的研究方法中，將可能得到充分的展示和挖掘。

3.4 代謝組學(xué)在中藥現(xiàn)代化方面的應(yīng)用

植物代謝物是中藥的活性成分，其種類和含量隨品種、生長環(huán)境、采集季節(jié)以及炮制方法等因素而變化。因此，中藥的質(zhì)量問題主要就是植物代謝組的問題，而藥理和毒理則是藥物對服藥者內(nèi)分泌（代謝組）的影響。

3.4.1 代謝組學(xué)與中藥現(xiàn)代基礎(chǔ)研究 代謝組學(xué)研究可對各原料藥有效成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，從而克服采用不同原料藥材的中藥成品質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。同一藥材的多基源情況使中藥或中成藥品種多而復(fù)雜，成分極不穩(wěn)定，最終影響成品中藥的標(biāo)準(zhǔn)化推廣[14]。Wang M等[15]研究了采摘時(shí)間對銀杏葉代謝產(chǎn)物的影響，在相同的條件（土壤、壓力和氣候條件）下，分別在清晨和晚上采摘銀杏葉，用甲醇提取葉中存在的代謝產(chǎn)物，如銀杏內(nèi)酯、白果內(nèi)酯和黃酮類物質(zhì)，并用薄層色譜法分析。結(jié)果顯示，采摘時(shí)間雖只有一段時(shí)間的間隔，但其銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯的含量卻有較明顯的增長，不僅是含量高低而且代謝產(chǎn)物的組成數(shù)量也受采摘時(shí)間的影響，這種效應(yīng)對黃酮類物質(zhì)的影響最明顯。所以，應(yīng)用代謝組學(xué)研究方法對道地藥材進(jìn)行指紋圖譜水平鑒別，是嚴(yán)格控制中藥原藥材質(zhì)量的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一?，F(xiàn)代中藥系統(tǒng)研究的指導(dǎo)思想必須符合多成分、多靶點(diǎn)、整體調(diào)節(jié)的中醫(yī)藥基本思想，又能以現(xiàn)代技術(shù)進(jìn)行有效的科學(xué)表征，建立基于代謝組學(xué)思想的化學(xué)分析平臺得出的中藥組分的各種指紋化圖譜（數(shù)據(jù)庫）[16]，并以此作為通用的準(zhǔn)則搶占國際標(biāo)準(zhǔn)的制高點(diǎn)，這應(yīng)是中藥現(xiàn)代研究的一個(gè)基本突破口。

3.4.2 代謝組學(xué)與中藥現(xiàn)代臨床研究 充分利用代謝組學(xué)技術(shù)建立新的中藥研發(fā)模式，其中心任務(wù)是建立考慮共生菌群代謝作用和CYP450代謝特性的新研發(fā)平臺，構(gòu)建帶有人體菌群或代謝酶系的動(dòng)物模型，實(shí)現(xiàn)宿主遺傳特性和菌群及酶系結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)化，通過對體液和組織的代謝組學(xué)特征開展研究，準(zhǔn)確評價(jià)中藥的藥理藥效，建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)和操作規(guī)范，有助于臨床合理用藥和預(yù)防疾病，從而為中藥代謝機(jī)制和研發(fā)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化研究奠定基礎(chǔ)[17]。

中藥毒理涉及藥物毒性損害的劑量、藥效毒性安全比、毒性作用靶器官、毒性作用持續(xù)時(shí)間、積蓄毒性及藥物結(jié)構(gòu)與毒性強(qiáng)弱關(guān)系、區(qū)別中藥自身原因引起的不良反應(yīng)和非中藥自身原因引起的毒性反應(yīng)等多項(xiàng)內(nèi)容。以馬兜鈴酸引起的腎毒性為例，從病理研究結(jié)果來看，可能是馬兜鈴酸引起腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和成纖維細(xì)胞聚集，并分泌大量細(xì)胞基質(zhì)所致。但這未能闡明馬兜鈴酸毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)，也就無法確定并去除毒性組分。而代謝組學(xué)卻能從整體圖譜水平上闡明中藥對機(jī)體所形成的內(nèi)源性代謝影響和外源性代謝毒性影響，以及生物標(biāo)志物的變化規(guī)律。劉霞等[18]采用1H-NMR代謝組學(xué)方法分析馬兜鈴酸Ⅰ誘導(dǎo)的雄性小鼠急性腎毒性。結(jié)果表明，馬兜鈴酸Ⅰ誘導(dǎo)的急性腎毒性主要來自給藥后抑制了小鼠體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和能量代謝，破壞了體內(nèi)腸道菌群的生態(tài)平衡，改變了腎臟細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，從而引起腎小管損傷。這項(xiàng)基于1H-NMR代謝組學(xué)方法的研究有可能為藥物的毒性機(jī)制研究提供新的思路。

3.4.3 運(yùn)用代謝組學(xué)構(gòu)建中藥標(biāo)準(zhǔn)研究模型的作用 代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)方法，能在鑒別和確證藥理與疾病模型上發(fā)揮作用。成功的疾病治療必須使代謝網(wǎng)絡(luò)中的缺陷部分正?；桓蓴_其他維持健康所必須的代謝途徑的調(diào)控。代謝組學(xué)圖譜能全面反映代謝網(wǎng)絡(luò)途徑的大量化合物，區(qū)別不同種屬、不同品系動(dòng)物模型的代謝狀態(tài)，鑒別人體疾病狀態(tài)的差異，尋找人類疾病、藥效和毒性的適宜動(dòng)物模型，最終給出新藥的藥理藥效和人體毒理方面的綜合數(shù)據(jù)。

中藥作用機(jī)制的研究主要是研究藥物在代謝調(diào)控中所起的作用和如何起作用。這正符合了代謝組學(xué)全面而數(shù)學(xué)化的特點(diǎn)。體內(nèi)藥物代謝的指紋圖譜，不僅可研究藥物本身的代謝變化，更重要的是可研究藥物引起的內(nèi)源性代謝物的變化，從而直接反映體內(nèi)生物化學(xué)過程和狀態(tài)的變化；并通過認(rèn)識體液“代謝指紋圖譜”的變化，尋找或闡明藥物的作用靶點(diǎn)或受體。Wang P等[19]篩選和分析了當(dāng)歸補(bǔ)血煎劑吸收入血的成分及其代謝產(chǎn)物，建立了代謝指紋圖譜，能夠快速篩選出多種活性成分和代謝產(chǎn)物，很好地解釋了當(dāng)歸補(bǔ)血煎劑的作用機(jī)制。Li F等[20]采用超高效液相色譜-質(zhì)譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對淫羊藿的藥效物質(zhì)組學(xué)及其對氫化可的松誘導(dǎo)腎虛證大鼠的代謝物譜的影響進(jìn)行了初步研究，通過比較正常組、模型組及淫羊藿醇提取物給藥組大鼠的血清和尿樣的代謝譜，發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷和朝霍定C可能為淫羊藿的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而對大鼠體內(nèi)基礎(chǔ)代謝物譜、腎陽虛大鼠代謝物譜及給藥淫羊藿后大鼠體內(nèi)代謝物譜進(jìn)行比較研究，尋找與腎陽虛大鼠相關(guān)的生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)淫羊藿可使腎陽虛大鼠網(wǎng)絡(luò)得以修復(fù)，由此探討了淫羊藿補(bǔ)腎的作用機(jī)制。目前，受體學(xué)說已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)的重要理論，在神經(jīng)沖動(dòng)傳遞過程中的化學(xué)遞質(zhì)傳送研究中，應(yīng)用代謝組學(xué)方法可測定給藥動(dòng)物血清中多種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)（Ach、DA、NE、5-TH等）的動(dòng)態(tài)變化，從代謝組分及體內(nèi)代謝過程中代謝物含量變化的實(shí)時(shí)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)具有療效的生物活性標(biāo)志物，從中發(fā)現(xiàn)中藥的某些作用和起效機(jī)制[21]。

4 結(jié)語

如果能用整體性思路的代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)的整體觀念進(jìn)行有效組合，一定能進(jìn)一步加快中醫(yī)藥學(xué)研究的現(xiàn)代化進(jìn)程。如果將系統(tǒng)生物學(xué)方法“導(dǎo)入”中醫(yī)的“證本質(zhì)”及“藏象、病機(jī)”和復(fù)方中藥多層次、多靶點(diǎn)治療的協(xié)同性和方劑對應(yīng)性的整體性研究領(lǐng)域，將有可能探索出循證中醫(yī)學(xué)研究的新方法與新途徑，有望在中醫(yī)藥基礎(chǔ)和臨床研究的思路與方法上有所創(chuàng)新，中醫(yī)藥與以代謝組學(xué)為核心的系統(tǒng)生物學(xué)的結(jié)合將是一個(gè)極富創(chuàng)造性，并可能引領(lǐng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化的重要之舉。

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