納米載體材料毒理學(xué)效應(yīng)及其作用機制研究進展Δ

黃琴琴，王永祿，李學(xué)明（南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京市 211816）

納米（Nanometer，nm）是一種度量微觀粒子的長度單位（1 nm為10－9m），相當(dāng)于10個氫原子并排起來的長度。當(dāng)一種物質(zhì)被不斷切割至一定程度，其粒徑小至納米量級即為納米材料。由于其獨特的性質(zhì)，如小尺寸效應(yīng)、表面-界面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)等，使納米材料在光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)性質(zhì)方面具備了與大體積固體顯著不同的特性。同時，也正是這些特性，使納米載藥系統(tǒng)（Nanoparticle drug delivery system，NDDS）顯示出諸多優(yōu)勢[1]。目前，作為藥物載體的納米材料有金屬納米顆粒（如超順磁性氧化鐵（SPION）[2]、納米金[3]）、生物降解性高分子納米顆粒（如殼聚糖[4]、聚酰胺（PAMAM）樹狀體[5]）及生物活性納米顆粒（如納米羥基磷灰石[6]、碳納米管（CNT）[7]）等。但是，隨著納米醫(yī)藥研究和應(yīng)用的不斷深入，有關(guān)納米載體材料潛在的安全性問題開始受到人們的關(guān)注?！稓W洲呼吸雜志》最早報道了納米顆粒在人體肺部蓄積后產(chǎn)生的傷害[8]；2006年美國環(huán)保機構(gòu)發(fā)現(xiàn)防曬霜中的納米二氧化鈦（TiO2）可導(dǎo)致鼠的腦死亡[9]；北京納米科技研究中心近期關(guān)于單壁碳納米管作為藥物載體的研究也顯示其對線粒體具有較強的毒性作用[10]。有研究在對SPION、樹狀體、介孔二氧化硅微粒、納米金和碳納米管這幾類載體材料進行藥物傳遞研究時，發(fā)現(xiàn)它們對體內(nèi)細(xì)胞和組織都存在一定的損害作用[9，11]。隨著載體材料在NDDS中應(yīng)用的日益頻繁，人類與納米物質(zhì)接觸的機會增多，途徑也日趨多樣化，因此，了解納米載體材料的特殊性質(zhì)及其對人體的作用機制，減小載體的毒副反應(yīng)、增強用藥安全性顯得尤為迫切和重要[9]。本文在國內(nèi)、外的研究工作基礎(chǔ)之上，對納米載體材料的毒理學(xué)效應(yīng)及其作用機制進行了綜述。

1 體內(nèi)毒性來源與作用機制

納米尺度僅相當(dāng)于頭發(fā)絲直徑的萬分之一，一個紅血細(xì)胞的直徑大約是7 μm，體內(nèi)許多生物分子包括一些蛋白質(zhì)，其粒徑最小可達(dá)到1 nm。在這樣的微觀世界里，材料的性質(zhì)發(fā)生了許多變化，從而導(dǎo)致其在生物體內(nèi)的生理行為與常規(guī)物質(zhì)有很大的不同，有些本身無毒的材料在納米世界中便可能會變得不安全。據(jù)研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，納米載體材料由于尺寸小，與常規(guī)物質(zhì)相比更容易透過血腦屏障、血睪屏障、胎盤屏障等，容易透過生物膜上的空隙進入細(xì)胞內(nèi)；同時，由于納米載體材料比表面積很大，其在體內(nèi)的毒性作用的方式更為多樣。因此，理解納米載體材料的細(xì)胞攝入機制，掌握其與細(xì)胞之間的相互作用方式以及所造成的細(xì)胞毒性機制，對于保證納米材料在人類環(huán)境中的安全性十分重要，也有助于納米載體材料在生物醫(yī)藥應(yīng)用中的優(yōu)化研究。

1.1 毒性主要來源

國家納米科學(xué)中心納米生物效應(yīng)實驗室主任趙宇亮對納米載體材料的毒性作了精辟的總結(jié)[12]：納米材料作為藥物載體在體內(nèi)產(chǎn)生的生物效應(yīng)包括正面和負(fù)面，其中負(fù)面效應(yīng)就會導(dǎo)致特殊的生物毒性；而決定其生物效應(yīng)的因素非常多，如劑量、結(jié)構(gòu)、尺寸、表面電荷、表面修飾、表面積、聚集狀態(tài)、晶型等，即使采用同一種載體材料，因其尺寸大小不同，生物效應(yīng)也會相差很大。

（1）納米結(jié)構(gòu)被證明具有特定的電學(xué)、光學(xué)及磁學(xué)性質(zhì)，這些性質(zhì)與其特殊的物理尺寸相關(guān)，一旦這種納米結(jié)構(gòu)被破壞，就可能會導(dǎo)致不可預(yù)知的特殊的毒性作用[13]。而且，不同形狀或者結(jié)構(gòu)的納米載體材料會產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)，例如碳納米管會很容易穿透細(xì)胞膜，使細(xì)胞溶解。

（2）納米結(jié)構(gòu)的表面性質(zhì)會涉及很多催化和氧化反應(yīng)，如果這些反應(yīng)導(dǎo)致了細(xì)胞毒性，那這種毒性將比一般的載體材料產(chǎn)生的毒性更嚴(yán)重，因為相比之下，納米物質(zhì)的比表面積更大[13]。納米載體材料的表面修飾物對載藥體系在體內(nèi)的被攝取和毒性也有一定的影響。

（3）構(gòu)成NDDS的一些金屬或者化合物，如果本身就具有毒性，那其在體內(nèi)降解之后將會產(chǎn)生類似的毒性，如，鎘硒化合物的納米粒會釋放有毒的正二價鎘離子（Cd2+），因為納米粒較高的比表面積會導(dǎo)致其粒子部分離子釋放[14]。

（4）納米載體由于粒徑極小，會黏附在細(xì)胞膜上，并通過一定的方式（如內(nèi)吞）進入細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞結(jié)合并在其中貯留，即使這種顆粒具有很低的化學(xué)活性（體內(nèi)不易降解或不與其他間質(zhì)化合物作用），也會影響細(xì)胞的作用機能。尤其是粒徑小于100 nm的顆粒，極易發(fā)生絮凝現(xiàn)象，使血管栓塞，同時納米結(jié)晶的穩(wěn)定性、均一性、電學(xué)和光學(xué)表現(xiàn)、細(xì)胞攝入和靶向性質(zhì)都會發(fā)生一定的改變，這就增加了納米載體材料在體內(nèi)的潛在毒性。

1.2 NDDS與細(xì)胞之間的相互作用

目前相關(guān)研究人員多數(shù)認(rèn)為，納米藥物載體進入細(xì)胞的主要方式是內(nèi)吞作用（Endocytosis），具體可分為3種類型：吞噬（Phagocytosis）、胞飲（Pinocytosis）和受體介導(dǎo)胞吞（Receptor-mediated endocytosis）[15]。經(jīng)細(xì)胞攝取的途徑一般取決于載體的性質(zhì)，如粒徑、形狀、表面電荷等，例如PAMAM樹狀體進入細(xì)胞的內(nèi)吞途徑取決于其表面特性，其中陰離子樹狀體主要經(jīng)小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進入體內(nèi)，而陽離子及中性樹狀體的吸收則依賴非特化細(xì)胞的內(nèi)吞作用。納米粒的攝取還受到細(xì)胞種類的影響，例如肺部的巨噬細(xì)胞所能夠識別和攝入的納米載體顆粒不同于骨髓中的巨噬細(xì)胞。此外，納米載體材料與細(xì)胞之間的作用還會受到血漿蛋白的影響，一旦載體接觸到血漿，NDDS就會被其蛋白所包覆[16]。

1.3 毒性作用機制

與粒徑較大者相比，納米載體材料粒徑極小，與體內(nèi)蛋白質(zhì)、病毒等物質(zhì)尺寸相似，且表面積很大，故較容易進入和分布于細(xì)胞中。在與細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)接觸并相互作用后，納米載體材料容易引發(fā)毒副效應(yīng)。目前，關(guān)于載體材料在體內(nèi)分子水平上產(chǎn)生的納米毒性，可用自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生這一理論解釋。

1.3.1 自由基的產(chǎn)生引發(fā)氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指機體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（Reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過多，使氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)或增強炎癥反應(yīng)的過程中扮演了關(guān)鍵的角色，作用方式為對轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB）、催化蛋白質(zhì)-1以及炎癥中涉及的激酶進行增量調(diào)節(jié)[17]。

而自由基的產(chǎn)生來源主要有：吞噬細(xì)胞對外來物質(zhì)的反應(yīng)、抗氧化劑量的不足、過渡金屬、環(huán)境因素以及一些納米載體材料本身的物理化學(xué)特性。若體內(nèi)潛在自由基不易清除并在組織中有所貯留，納米載體材料會使得諸如肝脾這樣的器官成為氧化應(yīng)激發(fā)生的主要靶點，產(chǎn)生肝毒性和脾毒性。

ROS作為主要的自由基，其產(chǎn)生機制可用還原型谷胱甘肽（GSH）理論解釋：在正常線粒體環(huán)境中，ROS產(chǎn)生頻率低，很容易被像GSH的抗氧化劑和抗氧化酶中和，但是在ROS產(chǎn)生過量的情況下，機體抗氧化劑大量消耗，導(dǎo)致GSH耗盡同時氧化型谷胱甘肽（GSSG）積聚的狀態(tài)，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。研究[18]發(fā)現(xiàn)，顆粒尺寸越小，巨噬細(xì)胞越難將其排出體外——尺寸減小導(dǎo)致納米材料會產(chǎn)生不連續(xù)的晶面，使得結(jié)構(gòu)缺陷增加，這些缺陷可能會提供新的生物作用點。大多數(shù)納米載體材料表現(xiàn)出毒性是由于材料的電子活性點（給電子或受電子基團）能與氧分子發(fā)生作用，形成超氧陰離子（O2－·），并通過歧化反應(yīng)產(chǎn)生額外的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷。

線粒體和細(xì)胞核被認(rèn)為是納米載體材料在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生毒性的主要作用點，像包覆的嵌段共聚物膠束、碳納米管這樣的納米載體有可能會集中在線粒體，從而導(dǎo)致一系列的反應(yīng)：編程性細(xì)胞死亡、ROS的生成、脫氧核糖核酸（DNA）的損傷、細(xì)胞周期性停滯及遺傳突變，編程性細(xì)胞死亡是毒性發(fā)生的一種來源[19]。據(jù)中科院研究人員的研究[20]可知，各種尺寸和化學(xué)組成的納米粒優(yōu)先到達(dá)線粒體，線粒體是具有氧化還原活性的細(xì)胞器，很可能產(chǎn)生大量ROS引起超載或影響機體抗氧化劑防御機制，它的產(chǎn)生是納米材料引起炎癥和毒性的一個主要因素。

1.3.2 影響毒性的主要因素。不管是對生物體系還是對單個細(xì)胞，納米載體材料的進入都會產(chǎn)生一些不利的影響，其程度與納米載體的物理化學(xué)性質(zhì)如粒徑、表面電荷、表面修飾等多種因素有著非常密切的關(guān)系。目前，普遍觀點認(rèn)為，本身無毒害的載體材料在制成納米級別物質(zhì)后就會變得具有一定毒性作用，且粒徑越小，其體內(nèi)效應(yīng)就更為活躍，帶來的毒性也更強。有研究[21]解釋其原因很有可能是隨著比表面積的增大，納米載體材料在體內(nèi)的各種性質(zhì)會越發(fā)突出和明顯。相關(guān)研究[22]表明，粒徑對于納米毒性的影響大于載體材料本身，若粒徑處于20～50 nm，載體可進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)及細(xì)胞中；另外，位于肺泡表面的巨噬細(xì)胞很難識別出小于70 nm的顆粒，故此粒徑范圍的載體材料容易進入肺間質(zhì)，從而增加了對肺部的潛在毒性。有研究[23]以2種不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)的納米TiO2為模型，考察了其在不同粒徑下被細(xì)胞所吸收的速率，結(jié)果顯示細(xì)胞對納米顆粒的吸收主要取決于粒徑大小，而非TiO2的晶體結(jié)構(gòu)。

另有文獻(xiàn)[18]報道，微粒的表面電荷亦會影響納米顆粒與細(xì)胞的結(jié)合作用。文中介紹了PAMAM樹狀結(jié)晶對體內(nèi)的毒性，這種納米結(jié)構(gòu)的物質(zhì)一旦進入體內(nèi)循環(huán)，帶正電荷的樹狀結(jié)晶以及陽離子樹狀體會與血液中的成分發(fā)生作用，破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶解。

有研究[24]以聚苯乙烯為模型材料，考察了粒徑和表面電荷對血液凝固、血小板活化、補體活化、白細(xì)胞活化、溶血、細(xì)胞膜損傷等的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小粒徑?jīng)]有血液相容性，易引起溶血和炎癥，對人體血液的影響也不呈線性；表面電荷相對較低者會引起補體活化，而且大于60 nm且?guī)в胸?fù)電荷的顆粒相對于更小的微粒而言，其血液毒性更低；另外，引起血液凝固和血小板活化的原因不單歸結(jié)于電荷或是粒徑，因為疏水性和材料本身構(gòu)成也同樣對其有影響。

此外，納米載體材料的表面修飾可影響其在體內(nèi)的細(xì)胞攝入和組織分布，某些功能化修飾基團可以延長載體在血液中的循環(huán)時間，若接上靶向配體還可降低藥物在組織和細(xì)胞中的非靶向分布，從而提高藥物靶向性和治療效果。據(jù)報道[25]，將牛血清白蛋白（BSA）固定在納米顆粒的表面可以阻礙成纖維細(xì)胞對其的吸收。在另一項研究[23]中，5 μm和5 nm的TiO2顆粒經(jīng)BSA包覆后，就很難與體內(nèi)細(xì)胞結(jié)合。研究[15]還發(fā)現(xiàn)，若在樹狀體表面用聚乙二醇（PEG）修飾，可顯著降低其體內(nèi)毒性。

在NDDS中，納米載體材料的尺寸、化學(xué)成分、表面積、表面電荷、修飾基團等多個因素都可影響藥物在體內(nèi)的生物效應(yīng)，而且不同的載體類型，如量子點、樹狀結(jié)晶、聚合物膠束，其產(chǎn)生的毒理效應(yīng)也不盡相同，這為今后的毒性分析工作提供了巨大的挑戰(zhàn)平臺和發(fā)展空間。

2 給藥方式與NDDS毒性的關(guān)系

根據(jù)給藥方式的不同，NDDS在體內(nèi)能夠產(chǎn)生的毒性形式主要有：血液毒性（Hematological toxicity）、肺毒性（Pulmonary toxicity）、腎毒性（Nephrotoxicity）、肝毒性（Hepatotoxicity）和脾毒性（Splenic toxicity）等。

當(dāng)一種劑型的納米藥物進入體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)后，其在組織中的分布一方面取決于組織灌流量，另一方面也取決于載體的粒徑和表面性質(zhì)：大于5 μm的微粒會被肺的毛細(xì)血管床捕獲，而小微粒易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬——小于150 nm的納米粒靶向骨髓，小于250 nm的納米粒靶向體循環(huán)，大于250 nm的納米粒靶向脾；并且大微粒消除比小微?？?。此外，帶正電的微粒易被肝吞噬，帶負(fù)電荷的微粒則易被肺吞噬，且ζ電位越高，吞噬越少。

2.1 吸入

納米藥物被吸入人體后，主要分布在肺、肝、心、腎、脾以及腦中，在體內(nèi)呼吸道的平均t1/2高達(dá)700 d，經(jīng)巨噬細(xì)胞的吞噬在肺泡內(nèi)進行清除。一般而言，帶負(fù)電荷的微粒易被肺吞噬，而且極性微粒不易被吞噬。有些清除過程會因為微粒粒徑的不同而呈現(xiàn)差異。紐約羅切斯特大學(xué)的研究者讓老鼠在含有直徑為20 nm聚四氟乙烯顆粒的空氣中停留15 min，大多數(shù)實驗鼠在隨后4 h內(nèi)死亡；而另一組大鼠暴露在含直徑為120 nm聚四氟乙烯顆粒的空氣中，則安然無恙[26]。

2.2 靜脈注射

藥物分布主要是經(jīng)過血管及淋巴系統(tǒng)，出現(xiàn)在結(jié)腸、肺、骨髓、肝、脾和淋巴中：處于1～20 nm內(nèi)的納米粒，在體內(nèi)的循環(huán)時間較長，可減緩藥物由脈管向細(xì)胞外系空間的滲漏，有實驗結(jié)果顯示[27]，靜脈注射24 h后，以硅為載體的納米粒停留在肝和脾的巨噬細(xì)胞中，且200 nm微粒要多于50、100 nm，而在腦和肺中則沒有；另外，納米粒主要通過肝、脾的巨噬細(xì)胞從系統(tǒng)循環(huán)中清除掉。實驗還發(fā)現(xiàn)，疏水性納米藥物在體內(nèi)會被血清包裹，受到調(diào)理素的作用，最終為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（如脾、肝、淋巴系統(tǒng)）中的特化細(xì)胞所清除。但如果在疏水顆粒表面用親水性表面活性劑包裹使其親水性增加，則可有效延長其在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中的作用時間。

2.3 口服

納米藥物以口服的方式進入體內(nèi)后，主要分布在腎、肝、脾、肺、腦和胃腸道中。一些納米?？纱┻^胃腸道屏障，進入系統(tǒng)循環(huán)，從而被吸收，并最終迅速在糞便和尿液中排出。然而有些微粒在首關(guān)效應(yīng)時會聚集在肝臟中，造成一定的肝臟毒性。有研究[28]考察了大鼠口服給藥的情況下，3種粒徑狀態(tài)（25、80、155 nm）的TiO2在大鼠組織內(nèi)的分布，實驗顯示TiO2主要分布在肝、脾、腎、腦以及肺部，且25、80 nm微粒組在雌性鼠的肝臟中的分布較155 nm組高很多，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）/天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）和低密度脂蛋白（LDH）等生化指標(biāo)還證明了TiO2微粒對雌性鼠有更嚴(yán)重的傷害。而目前關(guān)于納米藥物在胃腸道中的清除的研究還很少，有待進一步探索。

3 結(jié)語

NDDS在靶向性給藥、緩釋藥物、提高難溶性藥物與多肽藥物的生物利用度、降低藥物毒副作用等方面具備良好的應(yīng)用前景，但是，它進入生物體系后的安全性問題已逐步引起國內(nèi)、外專家的關(guān)注和研究。盡管通過降低給藥濃度、修飾載體表面基團等方式可有效控制和降低納米藥物載體在體內(nèi)的毒性作用，但是除了納米載體材料本身的一些物理化學(xué)性質(zhì)之外，不同的載藥形式及不同尺寸范圍的脂蛋白等都會影響NDDS與體內(nèi)細(xì)胞的作用，導(dǎo)致不同程度的毒性反應(yīng)。因此，綜合分析納米載體材料毒性的影響因素，只有充分掌握其在體內(nèi)的作用機制，為NDDS安全評估工作提供科學(xué)依據(jù)，才可使其更安全地應(yīng)用于人類。

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