實(shí)驗(yàn)鼠群的健康監(jiān)測(cè)管理

龐萬勇，賀爭(zhēng)鳴，何 誠，朱德生，趙德明

（1.賽諾菲研發(fā)中心藥物安全評(píng)價(jià)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，北京 100022；2.中國食品藥品檢定院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理處，北京 100050；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；4.北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，北京 100876）

近幾十年來，實(shí)驗(yàn)鼠種群的總體健康水平得到了顯著的提高，但還是有很多對(duì)人類和/或動(dòng)物健康以及對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究有影響的病原體在實(shí)驗(yàn)鼠群中流行。實(shí)驗(yàn)小鼠大概占到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)的80～90％，尤其基因工程鼠的使用成對(duì)數(shù)增長。疾病的發(fā)生和流行受到遺傳學(xué)、環(huán)境因素（如飼料、墊料、傳染病等）等的影響?；蚬こ淌笠?yàn)槠溥z傳改變所以其免疫狀況和對(duì)傳染性疾病和其它疾病的易感性和臨床表現(xiàn)都可能和其它普通的實(shí)驗(yàn)鼠不一樣。因此基因工程鼠群的健康管理更復(fù)雜更具挑戰(zhàn)性。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況會(huì)直接或間接地影響到科學(xué)研究，所以對(duì)任何實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施而言，動(dòng)物健康質(zhì)量控制規(guī)劃，或簡(jiǎn)單稱之為動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)，都是很重要的。

1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的必要性

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康狀況會(huì)影響到其在科研中的使用，對(duì)科研本身、人類健康（如人畜共患?。┖蛯?shí)驗(yàn)動(dòng)物種群都有可能造成影響。實(shí)驗(yàn)大、小鼠的傳染性病原體一般不會(huì)造成明顯的臨床疾病，但多造成亞臨床感染，個(gè)別病原體的強(qiáng)毒株除外。亞臨床感染雖然不引起明顯的臨床病癥和死亡，但是這些感染對(duì)生理學(xué)、免疫學(xué)、甚或形態(tài)學(xué)的影響都可能影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、真實(shí)性和可重復(fù)性。例如小鼠肝炎病毒感染，在免疫學(xué)方面，因?yàn)椴《驹诰奘杉?xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞內(nèi)增殖所以會(huì)影響到這些細(xì)胞的功能、可激活自然殺傷細(xì)胞并誘導(dǎo)干擾素的生成、可造成免疫刺激或抑制（因感染時(shí)機(jī)不同而異）、減少脾細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞因子的生成、永久性地降低皮膚移植排斥反應(yīng)、并在疾病恢復(fù)后永久性降低T細(xì)胞依賴性的抗體應(yīng)答。在微生物學(xué)方面，降低對(duì)病毒如仙臺(tái)病毒和鼠肺炎病毒的易感性、增強(qiáng)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抵抗性。在生理學(xué)方面，改變肝臟酶的水平和蛋白合成、改變外周血計(jì)數(shù)、增強(qiáng)單核細(xì)胞的促凝血活性、降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)生率。在腫瘤學(xué)方面，改變腫瘤傳代間隔和腫瘤侵襲性、污染移植性腫瘤等。亞臨床感染需要用靈敏的和精確的監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行確定。實(shí)驗(yàn)鼠群健康管理的一個(gè)首要目標(biāo)就是確定種群中存在或不存在某些特定的病原體，所以健康監(jiān)測(cè)有時(shí)可稱為微生物監(jiān)測(cè)。

現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)鼠群存在的有些傳染性病原可能是因?yàn)榕c人類接觸或由野生鼠污染所致，所以一種或多種新的或已從種群中凈化出去的病原體重新入侵的風(fēng)險(xiǎn)依然存在。因此建立并執(zhí)行全面的種群健康監(jiān)測(cè)對(duì)于確保人類健康、動(dòng)物健康福利、以及實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果的有效性和可重復(fù)性是非常重要的。

2 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)規(guī)程的建立

首先要做好風(fēng)險(xiǎn)分析。實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)需要了解在其設(shè)施里飼養(yǎng)和使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有哪些品種及其健康狀況如何、有無和有哪些基因工程鼠、過去/現(xiàn)在和未來會(huì)有什么研究項(xiàng)目涉及到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和生物材料的使用、實(shí)驗(yàn)設(shè)施的類型（屏障或普通環(huán)境、以及人流、物流、動(dòng)物流和氣流等）、生物安全措施（包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的遴選、不同種屬的和不同來源的動(dòng)物分開飼養(yǎng)、隔離檢疫、生物材料的微生物污染監(jiān)測(cè)、蟲害控制措施等）、既往健康問題、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的動(dòng)物健康狀況、引入新動(dòng)物或生物材料的頻度、（單位內(nèi)外的）動(dòng)物運(yùn)輸情況等。然后還要通過文獻(xiàn)查詢、專家咨詢等途徑了解當(dāng)前在實(shí)驗(yàn)鼠群所流行的疾病，主要側(cè)重于傳染性疾病，特別是相關(guān)品系或基因工程鼠對(duì)相關(guān)疾病的易感性、病理學(xué)、臨床表現(xiàn)和對(duì)科研的影響。這樣才能分析出傳染性病原體入侵實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的隱患大小，以及入侵后是否能和如何限制或根除感染。

其次是要對(duì)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目即病原進(jìn)行選擇。在選擇病原之前，應(yīng)該了解選擇病原進(jìn)行監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)或理由。理論上講，應(yīng)該選取可影響到科研以及動(dòng)物和人的健康的病原（如人畜共患病病原）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，尤其是那些如果檢測(cè)到以后可以采取措施控制最好是能根除的病原?？梢岳斫鉃槿绻仨毐O(jiān)測(cè)的病原監(jiān)測(cè)結(jié)果為陽性，但是又沒有將其根除的辦法，則可不再監(jiān)測(cè)或減少監(jiān)測(cè)頻度（如果依據(jù)法律法規(guī)必須強(qiáng)制性監(jiān)測(cè)的話）。另外也應(yīng)該考慮到所涉及動(dòng)物的微生物等級(jí)。例如，悉生動(dòng)物應(yīng)該檢測(cè)所有的外源性微生物。無特定病原體動(dòng)物應(yīng)該按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)（在中國主要的依據(jù)是現(xiàn)行版的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國家標(biāo)準(zhǔn)）來監(jiān)測(cè)，如不應(yīng)該有外寄生蟲、多細(xì)胞的體內(nèi)寄生蟲、以及致病性的腸道原蟲。另外不應(yīng)該有大多數(shù)外源病毒感染或沒有針對(duì)它們的抗體，因?yàn)椴《径技纳诩?xì)胞內(nèi)會(huì)影響細(xì)胞的代謝和功能并影響機(jī)體的防御機(jī)制。對(duì)細(xì)菌的監(jiān)測(cè)要依動(dòng)物的免疫狀況而定，如無免疫缺陷的動(dòng)物只要沒有少數(shù)的“原發(fā)性”細(xì)菌病原就可適用于絕大多數(shù)的研究，但對(duì)于免疫缺陷動(dòng)物而言則還要監(jiān)測(cè)那些條件性病原菌甚至于監(jiān)測(cè)“正常菌群”中的個(gè)別細(xì)菌，因?yàn)樗鼈兛赡芤鹈庖呷毕輨?dòng)物的疾病。關(guān)于應(yīng)該監(jiān)測(cè)或不監(jiān)測(cè)哪些病原，國際上現(xiàn)在尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這也是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)商和使用單位之間經(jīng)常討論的一個(gè)熱點(diǎn)問題。相關(guān)病原的監(jiān)測(cè)與否請(qǐng)參考相關(guān)指南，如美國國立衛(wèi)生研究院出版的由日美科學(xué)家編撰的“Manual of Microbiologic Monitoring of Laboratory Animals”、歐洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)盟（FELASA）的相關(guān)指南、美國密蘇里大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病診斷實(shí)驗(yàn)室（RADIL）和美國Charles River Laboratories的相關(guān)網(wǎng)站，可作為參考。北美的大多數(shù)研究機(jī)構(gòu)對(duì)常見的病毒至少每季度監(jiān)測(cè)一次，然后每年度進(jìn)行完全的病毒監(jiān)測(cè)，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行選擇性監(jiān)測(cè)。對(duì)寄生蟲的監(jiān)測(cè)，一般是每季度作內(nèi)部監(jiān)測(cè)，或使用第三方實(shí)驗(yàn)室做年度檢測(cè)。歐洲的情況也大體差不多，或者說對(duì)核心的重要的病原的監(jiān)測(cè)在國際上都比較一致。每個(gè)單位應(yīng)該建立一份具有單位特色的清單，列出實(shí)驗(yàn)設(shè)施里不應(yīng)該有的或者說應(yīng)該排除的病原，即應(yīng)該進(jìn)行監(jiān)測(cè)的病原清單。這種清單，不是一成不變的，而應(yīng)該是與時(shí)俱進(jìn)的，因?yàn)椴粩嘤行碌牟≡霈F(xiàn)也會(huì)有老的病原發(fā)生新的變化。因?yàn)橛泻芏嚓P(guān)于病毒致病性及其對(duì)科研影響的文獻(xiàn)，所以病毒的清單一般比較好建立。雖然有的病毒可能不致病，但通行的共識(shí)是實(shí)驗(yàn)鼠群不應(yīng)該有病毒感染。一個(gè)問題就是有無必要對(duì)一些已經(jīng)早就從實(shí)驗(yàn)鼠群根除的病毒，如小鼠胸腺病毒、鼠多瘤病毒等，進(jìn)行監(jiān)測(cè)。比較保險(xiǎn)的做法是進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但監(jiān)測(cè)頻率可依監(jiān)測(cè)陰性結(jié)果而酌情遞減。關(guān)于寄生蟲，對(duì)其是否對(duì)研究有影響及影響大小知之甚少。但寄生蟲的檢出可揭示動(dòng)物種群的清潔狀況差，或揭示屏障體系有疏漏或與野鼠有直接或間接的接觸（如非致病性鞭毛蟲如毛滴蟲），因此常常應(yīng)該監(jiān)測(cè)寄生蟲并從種群中凈化出去。有關(guān)細(xì)菌的選取則很復(fù)雜，與病毒不同的是，我們經(jīng)常通過評(píng)估其能否導(dǎo)致病變或臨床癥狀的能力來認(rèn)定細(xì)菌對(duì)于實(shí)驗(yàn)鼠的重要性，這是因?yàn)槲覀儗?duì)大多數(shù)細(xì)菌對(duì)宿主造成其它影響和干擾研究的“潛能”知之甚少。而且，目前對(duì)于眾多的嚙齒類動(dòng)物的細(xì)菌如嗜肺巴氏桿菌和巴氏桿菌屬的其它成員（如鼠放線桿菌、鼠流感嗜血桿菌）的分類和鑒定的認(rèn)識(shí)尚有諸多不足，所以難免造成誤判，而且由于對(duì)它們的特性了解不多，因此妨礙了凈化效率。有研究表明鼠的某些生長因子依賴性的巴氏桿菌與副流感嗜血桿菌密切相關(guān)（因此其傳播可能源于人類）。尚不清楚是否可以將這些細(xì)菌從實(shí)驗(yàn)鼠群中根除，因?yàn)槠琳显O(shè)施生產(chǎn)的鼠會(huì)接觸到人類，因此有再感染的風(fēng)險(xiǎn)。另外人類是大腸桿菌、克雷伯氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌等的宿主，所以也會(huì)有人將這些細(xì)菌傳播給鼠的可能性。有些細(xì)菌可能在實(shí)驗(yàn)鼠群中不常見，如念珠狀鏈桿菌，許多設(shè)施都監(jiān)測(cè)該菌，這是因?yàn)樵摼鹨环N叫做鼠咬熱的人畜共患病，而且可作為衡量是否有野大鼠污染的標(biāo)志。再如卡氏肺孢子蟲在實(shí)驗(yàn)大鼠群中存在，而且并不少見，是所謂的“大鼠呼吸病毒”病的真正病原。先前該病原主要通過組織病理學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)，現(xiàn)在可以通過血清學(xué)和PCR監(jiān)測(cè)了。

第三要考慮監(jiān)測(cè)的頻度。微生物監(jiān)測(cè)的頻度應(yīng)該適宜，以便及時(shí)地發(fā)現(xiàn)設(shè)施里是否有不應(yīng)該有的病原。監(jiān)測(cè)的頻度主要取決于所要監(jiān)測(cè)的種群的用途、某一或某些病原或污染物對(duì)該種群的重要性、病原侵入的風(fēng)險(xiǎn)以及經(jīng)費(fèi)上的考慮。例如FELASA建議對(duì)重要病原至少每季度監(jiān)測(cè)一次。大多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)商則監(jiān)測(cè)得更頻繁些，如每4～6周一次。在經(jīng)常引入新動(dòng)物的設(shè)施，與不常有新進(jìn)動(dòng)物的設(shè)施相比較，則監(jiān)測(cè)頻度可能要適度地提高。一般性的原則是高頻度的小樣本監(jiān)測(cè)（如每4～6周檢測(cè)3～5個(gè)動(dòng)物）比低頻度的大樣本監(jiān)測(cè)（如每3個(gè)月監(jiān)測(cè)10個(gè)動(dòng)物）更可靠。對(duì)于常見的或?qū)ρ芯坑袊?yán)重影響的病原如冠狀病毒、細(xì)小病毒、肺炎支原體、蟯蟲等應(yīng)該頻繁監(jiān)測(cè)，如每季度甚至每月一次；而對(duì)于不常見的病原如小鼠巨細(xì)胞病毒、仙臺(tái)病毒、漢坦病毒等則不必頻繁監(jiān)測(cè)，如可每半年甚至每年一次。對(duì)于隔離器中飼養(yǎng)的無菌動(dòng)物或悉生動(dòng)物來說，應(yīng)該更頻繁地監(jiān)測(cè)細(xì)菌（環(huán)境微生物）而不是病毒和寄生蟲，因?yàn)橐坏┢琳铣霈F(xiàn)問題，細(xì)菌侵入的風(fēng)險(xiǎn)更大。例如可在一年中的第1、2和3季度送哨兵鼠的血清進(jìn)行常見病原的血清學(xué)檢測(cè)，在第4季度則送檢活體哨兵鼠進(jìn)行全面的檢測(cè)。

第四要考慮健康監(jiān)測(cè)的內(nèi)容和范疇。如果動(dòng)物種群中至少有一個(gè)動(dòng)物存在有某病原體，那么健康監(jiān)測(cè)的目的就是在抽的樣本中檢測(cè)出有該病原的存在。反之亦然，即如果在抽樣中沒檢測(cè)出病原則種群中不存在該病原。健康監(jiān)測(cè)體系包含以下范疇：對(duì)種群中的動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)或?qū)ι诒鴦?dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)，后者可稱為哨兵鼠計(jì)劃，也是我們通常所說的（狹義的）健康監(jiān)測(cè)。其次，是對(duì)新引進(jìn)的動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)或作檢疫監(jiān)測(cè)。第三是對(duì)將用于鼠的生物材料進(jìn)行監(jiān)測(cè)。單位一般都有一個(gè)實(shí)驗(yàn)鼠的健康準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)，即供應(yīng)商所提供的健康報(bào)告應(yīng)該包括必檢的項(xiàng)目和不能有特定病原的存在。

新引進(jìn)動(dòng)物的監(jiān)測(cè)：?jiǎn)挝豢梢远嘤嗁徱欢〝?shù)量的鼠，在接收后立即安樂死進(jìn)行檢測(cè)或送到第三方實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以便核實(shí)供應(yīng)商的健康報(bào)告，減少污染設(shè)施的風(fēng)險(xiǎn)。需要注意的是，該做法必須通過單位的倫理審查委員會(huì)的審核批準(zhǔn)才能實(shí)施?，F(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商一般都有較完備的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃，一般都可提供不同的屏障或房間的健康報(bào)告。一般可以通過嚴(yán)格評(píng)估選定一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商，開始合作時(shí)可能需要核實(shí)其健康報(bào)告，但良好的互信的合作關(guān)系建立后可不執(zhí)行此計(jì)劃或抽檢即可。如果動(dòng)物來自科研院所則情況有所不同，其健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃各不相同，所以以防萬一可以采用此方法進(jìn)行核實(shí)。

檢疫期監(jiān)測(cè)：絕大多數(shù)情況下，來自高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商的、用有高效濾膜的運(yùn)輸盒運(yùn)輸?shù)?、且運(yùn)抵時(shí)運(yùn)輸盒完整的實(shí)驗(yàn)鼠對(duì)設(shè)施里的動(dòng)物造成污染的風(fēng)險(xiǎn)很低，一般不需要隔離而可直接運(yùn)至設(shè)施內(nèi)的動(dòng)物房。在這種情況下，接收時(shí)應(yīng)該仔細(xì)檢查運(yùn)輸盒是否完整、拒收運(yùn)輸盒有破損的動(dòng)物、細(xì)心地拿放運(yùn)輸盒并對(duì)其表面進(jìn)行消毒，以減少其表面污染對(duì)設(shè)施所造成的危害。對(duì)于其他來源的實(shí)驗(yàn)鼠，一般其生產(chǎn)質(zhì)量控制、裝運(yùn)等都不太嚴(yán)格，執(zhí)行適宜的檢疫可能很重要。這些動(dòng)物可能多為特殊的模型/基因工程小鼠，因此其提供方的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃可能是針對(duì)這些特定的動(dòng)物的，可能不能完全符合接收設(shè)施的健康監(jiān)測(cè)規(guī)程。而且這些動(dòng)物多為“稀缺”動(dòng)物，所以對(duì)其接收和接收后的檢疫工作等應(yīng)該進(jìn)行精心準(zhǔn)備。檢疫期通過前應(yīng)該視它們?yōu)榭梢傻母腥驹?，因此?yīng)該遵循檢疫期的相關(guān)操作規(guī)程。檢疫期的動(dòng)物和別的動(dòng)物應(yīng)該隔離開，最好是房間水平的隔離，但如果空間有限可使用隔離器等設(shè)備。另外，如果對(duì)動(dòng)物供應(yīng)商的品質(zhì)不懷疑，但對(duì)動(dòng)物的運(yùn)輸有疑慮，可對(duì)動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)以排除運(yùn)輸過程中的污染。如果使用血清學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，則不能在接收時(shí)立即安樂死動(dòng)物監(jiān)測(cè)，可將其置于檢疫期一定時(shí)間后再監(jiān)測(cè)。因?yàn)閯?dòng)物如果在運(yùn)輸過程中感染/污染，至少需要大約一周的時(shí)間才能產(chǎn)生抗體。也可在到達(dá)后第3天，從每只鼠采集糞便樣本（注意盡量“無菌”操作），每10個(gè)動(dòng)物的樣本混合后可采用PCR的方法檢測(cè)常見的腸道病原?；蛘邚拿恳粍?dòng)物采集糞樣、口腔拭子或鼻/肺沖洗物、和無毛動(dòng)物的皮膚拭子，10只動(dòng)物的樣本按不同的類型分別混合，進(jìn)行鼠常見傳染病原的PCR檢測(cè)。也可采糞樣、肛周膠帶粘貼取樣、毛發(fā)等進(jìn)行寄生蟲的檢測(cè)。

生物材料的監(jiān)測(cè)：生物材料如細(xì)胞培養(yǎng)物和腫瘤組織/細(xì)胞等的微生物污染可危及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施的生物安全以及對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究造成負(fù)面影響。所有的生物材料在接種實(shí)驗(yàn)鼠之前都應(yīng)該進(jìn)行檢測(cè)以確定沒有外源性微生物（主要是鼠的一些傳染病病原體）污染?？赏ㄟ^將生物材料接種鼠，4～6周后檢測(cè)是否有相關(guān)抗體產(chǎn)生。現(xiàn)多用PCR的方法檢測(cè)。

直接從種群中隨機(jī)抽取動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)：嚙齒類動(dòng)物體型小、能采集的血樣少，所以不可能用大動(dòng)物（如豬、犬、猴等）的疾病監(jiān)測(cè)方法諸如采血樣檢測(cè)等來進(jìn)行動(dòng)物群體健康監(jiān)測(cè)。一般的鼠群的健康監(jiān)測(cè)都得安樂死動(dòng)物并采集足夠的血樣和組織樣品?？芍苯与S機(jī)從動(dòng)物群中選取動(dòng)物作為群體的代表來檢測(cè)。用這種監(jiān)測(cè)模式不需要在種群中引入哨兵鼠，因此可以避免通過哨兵鼠而引入感染。另外的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)時(shí)在需要進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)，一般可立即從種群中選取所需要數(shù)目的鼠進(jìn)行采樣，而使用哨兵鼠時(shí)則需要把哨兵鼠置于種群中一定的時(shí)間以確保其獲得機(jī)會(huì)來暴露給種群中存在的病原并產(chǎn)生感染。直接抽取動(dòng)物檢測(cè)的前提是選取的動(dòng)物已經(jīng)盡可能地暴露給了存在于種群中的病原微生物。例如可以使用開放性籠蓋的鼠籠、甚或采用與哨兵鼠相似的“臟墊料”法，即轉(zhuǎn)移最可能有感染的墊料至預(yù)先選定的鼠籠。如果使用血清學(xué)方法監(jiān)測(cè)，則選取的動(dòng)物必須能產(chǎn)生抗體。因?yàn)榛蚬こ淌蟮拿庖邔W(xué)狀況未知或很難確定，所以選取基因工程鼠進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)有很多的不確定因素，即這些動(dòng)物能否產(chǎn)生有效的抗體水平。如果某些動(dòng)物有免疫缺陷，則不適于血清學(xué)檢測(cè)（可造成假陰性結(jié)果），但如果運(yùn)用得當(dāng)，采用直接檢測(cè)病原的方法如PCR、細(xì)菌學(xué)和寄生蟲學(xué)，則也能很好地應(yīng)用免疫缺陷動(dòng)物來進(jìn)行動(dòng)物種群的健康監(jiān)測(cè)，因?yàn)檫@些免疫缺陷的動(dòng)物對(duì)寄生蟲和細(xì)菌的抵抗力較弱，一般可長時(shí)間的乃至終生的保持活動(dòng)性感染。選取動(dòng)物時(shí)應(yīng)該在一個(gè)動(dòng)物房?jī)?nèi)多點(diǎn)取樣，以盡可能的監(jiān)測(cè)出僅在局部分布（如某個(gè)籠架）的感染，這也因房間通風(fēng)方式以及使用的籠具體系等的不同而異。如果一個(gè)動(dòng)物房?jī)?nèi)有不同的品系或封閉群的動(dòng)物，則應(yīng)該各選取其代表動(dòng)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在動(dòng)物年齡的選擇上，應(yīng)該盡量選取年幼的和老的動(dòng)物，但要避免使用年齡過大的動(dòng)物，因?yàn)榧纳x多寄生于年幼鼠，而年老的鼠則有最大的可能暴露給設(shè)施內(nèi)的微生物從而產(chǎn)生血清陽轉(zhuǎn)。但是年老的特別是無免疫缺陷的鼠可能對(duì)感染其的病原產(chǎn)生了免疫反應(yīng)進(jìn)而部分或全部地把大多數(shù)的寄生蟲或病毒等都清除了，所以這些鼠用直接檢測(cè)病原的方法來檢測(cè)的話很可能會(huì)是陰性的。太小的鼠因?yàn)槠淠冈纯贵w的存在可能也會(huì)影響到血清學(xué)的檢測(cè)。對(duì)于繁殖種群而言，最好的是選取因年老而淘汰的種鼠和過剩的斷奶鼠。例如，選擇4～5周齡的鼠檢測(cè)腸道原蟲最好、8～10周齡檢測(cè)蟯蟲最好、10～12周齡監(jiān)測(cè)卡氏肺孢子蟲最好，但是超過幾月齡的鼠則對(duì)細(xì)小病毒不易感。健康監(jiān)測(cè)的目的是準(zhǔn)確地檢測(cè)出在一個(gè)種群中是否有某（些）病原體的存在（即在某種群中至少有一例陽性），而不是準(zhǔn)確地確定感染或疾病的流行率（即多少動(dòng)物感染了）。理論上講，樣本的量是依賴于種群中的病原的流行率的。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的原理和公式，有不同的作者或機(jī)構(gòu)制定了樣本大小的指南，如可用log（1-置信度）/log（1-預(yù)期的流行率）來計(jì)算樣本大小。例如，一個(gè)鼠群某病原的流行率估計(jì)為30％，置信度為95％時(shí)，則樣本量為8～10；若流行率為10％，則需要25～30個(gè)樣本。另外可參考現(xiàn)行的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》國家標(biāo)準(zhǔn)。顯而易見，對(duì)于流行率低的病原，如果使用獨(dú)立通風(fēng)籠具則使病原傳播率更低，因此需要采集的樣本數(shù)量很大，所以大多設(shè)施采用哨兵鼠來進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)。

使用哨兵鼠進(jìn)行鼠群健康檢測(cè)：現(xiàn)在的實(shí)驗(yàn)鼠設(shè)施多使用小隔離器、層流架、獨(dú)立通風(fēng)籠具等使得疾病傳播率很低（流行率多低于30％）而且流行或分布不均一。另外從動(dòng)物群中抽取動(dòng)物要做到真正隨機(jī)的話則不影響到科研究很難。這些都使得隨機(jī)抽取動(dòng)物進(jìn)行健康監(jiān)測(cè)的方法不太適用?？梢栽谑笕褐蟹胖蒙诒?，盡可能地讓這些鼠暴露給動(dòng)物設(shè)施中的微生物，然后通過檢測(cè)這些鼠來反推出種群的健康狀況或者其微生物感染狀況?？蓮纳诒蟛裳⑷?、甚至安樂死來進(jìn)行檢測(cè)，而不干擾在研的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。原則上哨兵動(dòng)物應(yīng)該是免疫健全的年輕成年鼠（多為6～8周），多在3～5周齡時(shí)引入并在種群中放置足夠長的時(shí)間以讓這些哨兵鼠充分地暴露給種群中和/或動(dòng)物房間中的病原，一般為至少4～6周，以便檢測(cè)抗體和寄生蟲。也應(yīng)避免使用太老的動(dòng)物作為哨兵鼠，因?yàn)榭赡軐?dǎo)致血清學(xué)假陰性。哨兵鼠的品系/封閉群的選擇也要慎重。使用和所要檢測(cè)的種群相同品系的動(dòng)物較好如可以多購買幾只作為哨兵鼠使用，因?yàn)檫@樣可以避免因哨兵鼠而引入感染的風(fēng)險(xiǎn)。但也要考慮到所要檢測(cè)動(dòng)物的免疫學(xué)狀況，如免疫有缺陷的動(dòng)物就不適用這一方法。一般選用封閉群的鼠作為哨兵鼠，如CD小鼠和SD大鼠，因?yàn)樗鼈儗?duì)病原易感但不發(fā)病、能產(chǎn)生很好的免疫學(xué)應(yīng)答，而且價(jià)格不貴。有些近交系的鼠對(duì)有些病原部分或完全不易感，因此應(yīng)該酌情避免使用，例如C57BL/6對(duì)小鼠細(xì)小病毒MPV不易感、SJL對(duì)小鼠肝炎病毒的呼吸道株（多器官親嗜性）不易感等。還有DBA/2小鼠的抗體應(yīng)答緩慢，也應(yīng)避免使用。引入哨兵鼠的風(fēng)險(xiǎn)也有很多。例如，要考慮到由哨兵鼠本身的感染而污染/感染其它動(dòng)物的可能性。但這種風(fēng)險(xiǎn)可以通過對(duì)哨兵鼠來源的慎重選擇而降低，例如可從高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商購買動(dòng)物作為哨兵鼠（并確定沒有針對(duì)要檢測(cè)的病原的抗體）。也可以在將哨兵鼠引入種群之前對(duì)新購進(jìn)哨兵鼠進(jìn)行適宜的隔離檢疫，以弄清其微生物狀況。可以使用設(shè)施里生產(chǎn)的鼠，但一般不提倡，因?yàn)檫@樣會(huì)涉及到很多額外的生物安全問題。有種做法是盡量只使用來源自隔離器中飼養(yǎng)的微生物學(xué)狀況清楚的動(dòng)物，如可使用無免疫缺陷的雜合子的裸鼠來作為哨兵鼠。

哨兵鼠都是以間接的方式來暴露給病原，如通過采集種群中其它鼠使用過的墊料即臟墊料，特別是疑似感染的動(dòng)物的臟墊料，放置到哨兵鼠籠。這種方法是標(biāo)準(zhǔn)的方法，適用于獨(dú)立通風(fēng)籠具飼養(yǎng)的鼠、免疫缺陷鼠等的健康監(jiān)測(cè)。但也可使用直接接觸法來感染哨兵鼠，即將哨兵鼠和種群中其它的鼠合養(yǎng)（也就是直接接觸），多適用于檢疫期，這樣做的風(fēng)險(xiǎn)在于哨兵鼠可感染其它的鼠或造成遺傳學(xué)污染或打斗，而且很難采集很多籠的鼠進(jìn)行檢測(cè)。這種情況下，可選用毛色上和種群中的其它動(dòng)物不同的哨兵鼠。臟墊料法也存在諸多缺陷，例如纖毛相關(guān)呼吸道桿菌和乳酸脫氫酶增高癥病毒就不通過臟墊料傳播，仙臺(tái)病毒和螺旋桿菌則不能很好地通過墊料傳播。通常的做法是在每次換墊料時(shí)，盡可能多的把種群中動(dòng)物的臟墊料（每籠取5～15mL）轉(zhuǎn)到哨兵鼠籠。一般不添加新的墊料，因?yàn)樾碌膲|料會(huì)稀釋臟墊料中可能含有的病原，使其達(dá)不到最低感染劑量。一個(gè)折中的辦法是，如果使用筑巢材料作為一種豐富環(huán)境的措施，則可放置新的筑巢材料于哨兵鼠籠。動(dòng)物排毒會(huì)隨著病毒感染過程的推進(jìn)而減弱直至感染結(jié)束。采樣作血清學(xué)檢測(cè)的時(shí)間和哨兵鼠最后接觸臟墊料的時(shí)間應(yīng)該間隔2～3周（3～4周可能更好），因?yàn)閷?duì)于大多的病原來說，哨兵鼠需要7～14d的時(shí)間來產(chǎn)生抗體。但是針對(duì)鼠諾瓦克病毒的血清陽轉(zhuǎn)則可能需要8周的時(shí)間。然而，哨兵鼠放置在種群中的時(shí)間不宜超過3個(gè)月，主要是因?yàn)槭髮?duì)小鼠細(xì)小病毒這個(gè)小鼠最常見的病毒的易感性隨年齡增長而下降。

哨兵鼠和其所“代表”的種群動(dòng)物的比例也要適當(dāng)，但是沒有相關(guān)的正式指南。如1個(gè)有2～3只哨兵鼠的籠子可用來檢測(cè)50～80籠的動(dòng)物。依據(jù)所希望保持的微生物學(xué)狀態(tài)、飼養(yǎng)方式、籠具系統(tǒng)等的不同，這個(gè)比例會(huì)有不同。大多獨(dú)立通風(fēng)籠具在籠架的每側(cè)都放置一哨兵鼠籠。應(yīng)該平衡一下風(fēng)險(xiǎn)和費(fèi)用的關(guān)系。例如，如果1個(gè)哨兵鼠籠代表50～80籠鼠，如果哨兵鼠檢測(cè)陽性，為找出是哪籠鼠除了問題則可能需要對(duì)50～80個(gè)籠的動(dòng)物分別檢測(cè)。如果同樣的50～80籠鼠，設(shè)置兩籠哨兵鼠，如果其中一籠檢測(cè)陽性，則只需要檢測(cè)其所代表的那25～40籠鼠。一般每季度采樣檢測(cè)，這種安排最適于血清學(xué)檢測(cè)。因同年齡的鼠放在一個(gè)籠子里，其微生物狀態(tài)會(huì)大致一致，所以不用對(duì)哨兵鼠籠的所有動(dòng)物都進(jìn)行檢測(cè)，一般每籠檢測(cè)一只。在樣本（哨兵鼠和/或血清等）送檢后，即可引入新的哨兵鼠，這些新的動(dòng)物可以去接觸已有的感染并作為橋梁來承上啟下即對(duì)那些上批哨兵鼠尚未發(fā)生血清陽轉(zhuǎn)的病原產(chǎn)生免疫應(yīng)答。當(dāng)結(jié)果出來時(shí)，可對(duì)“老”的哨兵鼠實(shí)施安樂死，一來可以去驗(yàn)證那些陽性結(jié)果，二來可以采樣用于檢測(cè)其它感興趣的但尚未檢測(cè)的病原（即未列在上次檢測(cè)計(jì)劃中的病原等）。因?yàn)榭赡懿皇撬械纳诒蠖紩?huì)對(duì)小鼠細(xì)小病毒發(fā)生血清陽轉(zhuǎn)，所以要注意的是如每籠哨兵鼠只檢測(cè)一只可能會(huì)降低微生物監(jiān)測(cè)的靈敏度，但這樣做可省錢，或者對(duì)剩余的哨兵鼠只進(jìn)行細(xì)小病毒檢測(cè)。

哨兵鼠籠的放置位置應(yīng)考慮盡量增大這些動(dòng)物的感染機(jī)會(huì)。如和種群中的動(dòng)物接近、放在籠架底層、離出風(fēng)口近等。另外可固定在某些位置，這樣能引起飼養(yǎng)人員和科研人員的注意。哨兵鼠多為雌性，一來可減少動(dòng)物的打斗，二來可避免對(duì)種群因計(jì)劃外的交配而造成遺傳學(xué)污染。

哨兵鼠計(jì)劃有以下內(nèi)在的缺陷：一是對(duì)微生物的檢測(cè)是間接的（即不是對(duì)種群中的動(dòng)物直接檢測(cè)）而且有時(shí)間上的滯后。制約因素有哨兵鼠必須易感、種群中的動(dòng)物是否處在排毒的活動(dòng)期、某些病原在環(huán)境中易滅活（所以要使用新鮮臟墊料）、哨兵鼠能否暴露給足夠量的病原（臟墊料的量要夠而且要混合均勻）、哨兵鼠必須血清陽轉(zhuǎn)或開始排毒（滯后1～8周）等。二是如果哨兵鼠檢測(cè)為陽性，則不易判斷其感染的來源。感染可能源自哨兵鼠本身、哨兵鼠經(jīng)由其它意外的途徑（如飲水、飼料、試驗(yàn)處理、籠具清洗等）而感染，而且感染可能來自任何一個(gè)該哨兵鼠所代表的鼠籠。

3 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的方法

實(shí)驗(yàn)鼠群健康檢測(cè)所涉及的方法學(xué)有很多，如剖檢前的檢查（如環(huán)境檢測(cè)數(shù)據(jù)、飼養(yǎng)管理情形、種群的大小、動(dòng)物品種、遺傳學(xué)背景、免疫學(xué)狀況、動(dòng)物標(biāo)識(shí)等）、大體剖檢、血清學(xué)、細(xì)菌培養(yǎng)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)如PCR、寄生蟲學(xué)檢查、組織病理學(xué)、和其它的一些診斷方法。最常用的還是血清學(xué)和PCR。詳盡的方法學(xué)恕不詳述。要注意的是對(duì)樣本及樣本的處理過程進(jìn)行適宜的質(zhì)控、以及陰、陽性對(duì)照的合理使用。

4 實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的樣本采集原則

因擬定使用的檢測(cè)方法的不同和/或檢測(cè)的病原的不同采集的樣本也有所不同。如采用血清學(xué)方法，則要采集血液分離血清。血清可用PBS進(jìn)行適度稀釋，如1份血清加入4份PBS。如對(duì)生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的鼠進(jìn)行健康檢測(cè)，則血清應(yīng)該進(jìn)行滅活如加熱滅活。另外，對(duì)生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，可使用經(jīng)福爾馬林固定的組織/糞便樣品等來進(jìn)行PCR檢測(cè)、寄生蟲檢測(cè)和組織病理學(xué)檢測(cè)。

合并樣品（把不同動(dòng)物的樣品混合在一起作為一個(gè)樣品檢測(cè)）可減少需要檢測(cè)的樣本數(shù)量，從而可以減少費(fèi)用。但是需要滿足以下兩個(gè)條件。一是檢測(cè)的方法要足夠靈敏（即可檢測(cè)出僅存在于混合樣品中的某一樣品中的微量微生物或其成分），一般適用于PCR和寄生蟲糞檢，不適用于血清學(xué)。二是在經(jīng)濟(jì)上要合理，即假設(shè)要混合X個(gè)樣品成一個(gè)混合樣，只有少于（X-1）/X的混合后樣品為陽性時(shí)，在經(jīng)濟(jì)上才是合理的。例如有100個(gè)樣品，10個(gè)混為一個(gè)（即上述公式中的X），即有10個(gè)混合樣。如果混合樣一旦為陽性，則可能需要檢測(cè)其混合前的每一樣品。按照這樣的推理，如果有（10-1）/10即10個(gè)混合樣中有9個(gè)為陽性，則總共的檢測(cè)次數(shù)為100，和不混合樣品一樣。如果10個(gè)樣中有8個(gè)為陽性，則總共的檢測(cè)次數(shù)為90，比較經(jīng)濟(jì)。

最好是和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系，咨詢?nèi)绾稳蛹皹悠诽幚淼葐栴}。運(yùn)送活體動(dòng)物和相關(guān)樣本應(yīng)該按照國際國內(nèi)的相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行。

另外，如果鼠群中有動(dòng)物死亡，也可多剖檢和診斷，這可以作為常規(guī)健康檢測(cè)計(jì)劃的一個(gè)很有益的補(bǔ)充甚至組成部分。

5 實(shí)驗(yàn)鼠種群健康檢測(cè)結(jié)果的解讀及應(yīng)對(duì)措施

應(yīng)該由負(fù)責(zé)該動(dòng)物種群健康的相關(guān)專家來解讀健康檢測(cè)結(jié)果，看是否有異常的或意外的結(jié)果。如果沒有異常結(jié)果，可以按照相關(guān)要求對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)管理或?qū)?bào)告進(jìn)行歸檔。如果檢出陽性，建議在采取措施之前，聯(lián)系診斷實(shí)驗(yàn)室，確定陽性結(jié)果以及其可能的意義，然后啟動(dòng)相應(yīng)的應(yīng)對(duì)措施。診斷實(shí)驗(yàn)室可以給出他們對(duì)陽性結(jié)果的看法，如屬強(qiáng)陽性還是弱陽性、是否某檢測(cè)方法常有假陽性結(jié)果、或者說某病原很少見所以其檢測(cè)結(jié)果為陽性的意義不大等。另外診斷實(shí)驗(yàn)室還可就如何最快最好確證陽性結(jié)果提供建議。在對(duì)某陽性結(jié)果采取措施之前，要將檢測(cè)結(jié)果知會(huì)單位內(nèi)部的動(dòng)物倫理審查委員會(huì)和其他相關(guān)的部門和人員。單位要及時(shí)地對(duì)健康檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行匯總和分析，進(jìn)而可以對(duì)監(jiān)測(cè)計(jì)劃進(jìn)行修訂，如增/減檢測(cè)的病原、對(duì)個(gè)別病原增/建檢測(cè)頻率、采用新的檢測(cè)方法等。

總之，沒有一成不變的健康監(jiān)測(cè)計(jì)劃，也沒有一個(gè)放諸四海而皆準(zhǔn)的健康監(jiān)測(cè)規(guī)程。讀者在了解上述的一些有關(guān)實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)的基本原理之后，在制訂監(jiān)測(cè)計(jì)劃時(shí)，可參考前文有關(guān)“如何建立實(shí)驗(yàn)鼠群健康監(jiān)測(cè)規(guī)程”一節(jié)的內(nèi)容，充分用好互聯(lián)網(wǎng)等資源，對(duì)國內(nèi)外一些著名大學(xué)、科研機(jī)構(gòu)的相關(guān)資料進(jìn)行仔細(xì)研究和推敲，結(jié)合我國的實(shí)情，建立并在實(shí)踐中逐步完善富有單位特色但確實(shí)行之有效的實(shí)驗(yàn)鼠群健康管理體系。

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［7］Clifford CB.2011.Emerging rodentdiseases.13thCurrent Laboratory Animal Sciences Seminar.VA，USA.

［8］Clifford CB.2009.Cost-effective Health Surveillanceof laboratory rodents.23rd Charles River Short Course on Laboratory Animal Sciences.Boston，MA，USA.

［9］Shek WR.2011.Current Challenges to Accurate Microbiologic Surveillance of Research Animals.25th Charles River Short Course on Laboratory Animal Sciences.Boston，MA，USA.

［10］Shek WR，Heanderson KS，Clifford CB.2011.Emerging Diagnostic Approaches.25th Charles River Short Course on Laboratory Animal Sciences.Boston，MA，USA.

［11］趙德明，龐萬勇.2011.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的獸醫(yī)作用.（賀爭(zhēng)鳴，李根平，李冠民，陳振文，王祿增主編.2011.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科學(xué).科學(xué)出版社［M］.489-498.