實(shí)驗(yàn)用猴腦脊液采集技術(shù)方法的創(chuàng)新

陳 霆，叢 喆，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

實(shí)驗(yàn)用猴腦脊液采集技術(shù)方法的創(chuàng)新

陳 霆，叢 喆，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

腦脊液在艾滋病的研究中有著重要的意義。近年來腦脊液的檢測(cè)逐步成為SIV/SHIV感染猴模型研究和應(yīng)用中的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的采集方法不易學(xué)習(xí)和掌握。針對(duì)上述情況我們優(yōu)化了腦脊液的采集方法，優(yōu)化后的方法明顯縮短穿刺時(shí)間，顯著提高成功率。

腦脊液;腦脊液采集;方法改進(jìn)

腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)為無色透明的液體，充滿在各腦室、蛛網(wǎng)膜下腔和脊髓中央管內(nèi)［1］。由腦室中的脈絡(luò)叢產(chǎn)生，與血漿和淋巴液的性質(zhì)相似。它供應(yīng)腦細(xì)胞一定的營(yíng)養(yǎng)，運(yùn)走腦組織的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的酸堿平衡。并緩沖腦和脊髓的壓力，對(duì)腦和脊髓具有保護(hù)和支持作用。在艾滋病研究中發(fā)現(xiàn)，HIV-1具有嗜神經(jīng)的特點(diǎn)，可依靠突變而獲得親神經(jīng)的特異性變種，HIV可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)長(zhǎng)期存活，并直接感染而造成許多損害，同時(shí)，神經(jīng)組織還可以作為病毒儲(chǔ)存的地方［2］。因此，腦脊液的檢查，包括細(xì)胞涂片染色，病毒分離和培養(yǎng)，載量的測(cè)定，蛋白水平的評(píng)價(jià)等，在艾滋病研究中有著重要的意義，是 SIV/SHIV感染猴模型研究和應(yīng)用中的重要指標(biāo)。

恒河猴腦脊液的采集主要集中在腰椎穿刺采集，特殊情況下可由小腦延髓池或側(cè)腦室穿刺獲取［3］。操作過程中要保證穿刺進(jìn)針的方向和力度，否則很容易損傷脊髓，抽出渾濁的腦脊液或者帶血的腦脊液，影響樣品的質(zhì)量。

傳統(tǒng)方法中，動(dòng)物麻醉后取側(cè)臥位固定(圖1)，使頭部及尾部向腰部盡量彎曲，使腰部拱起。在動(dòng)物背部第七腰椎間隙垂直刺入，當(dāng)有落空感及動(dòng)物的后肢跳動(dòng)時(shí)，表明針已達(dá)椎管內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔［4］)。此時(shí)，觀察是否有腦脊液流出。如果穿刺時(shí)有創(chuàng)傷，CSF可能稍帶血色。收集CSF時(shí)，CSF應(yīng)清澈無血，除非存在蛛網(wǎng)膜下腔出血。如果腦脊液流出不暢，可將針頭旋轉(zhuǎn)90度，因?yàn)獒橆^開口處可能被神經(jīng)根堵塞或者是沒有刺破蛛網(wǎng)膜。

采用傳統(tǒng)的穿刺方法采集腦脊液對(duì)于新人來說不易學(xué)習(xí)和掌握。因?yàn)闆]有專用的動(dòng)物固定裝置，猴子側(cè)臥位不易固定，需要有實(shí)驗(yàn)人員輔助，由此也導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)人員在穿刺時(shí)不易發(fā)力，穿刺針經(jīng)常出現(xiàn)左右晃動(dòng)的情況難以刺穿動(dòng)物皮膚。即使成功刺穿皮膚，在穿透皮下組織和韌帶時(shí)也極易發(fā)生滑動(dòng)，造成穿刺不成功。

針對(duì)上述情況我們做了兩點(diǎn)針對(duì)性改進(jìn)：首先，我們嘗試使用復(fù)方氯胺酮代替鹽酸氯胺酮進(jìn)行麻醉(主要成分是：鹽酸氯胺酮、鹽酸二甲苯噻嗪、鹽酸苯乙哌酯)。鹽酸二甲苯噻嗪為鎮(zhèn)痛性化學(xué)保定藥，比氯胺酮有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及中樞性肌松作用。兩者配伍制成復(fù)方制劑麻醉效果好于鹽酸氯胺酮麻醉效果，麻醉的時(shí)間延長(zhǎng)，且實(shí)驗(yàn)猴的肌肉能夠更好地放松，有利于穿刺針的進(jìn)入。其次，我們調(diào)整了實(shí)驗(yàn)猴的固定姿勢(shì)，不再采用傳統(tǒng)的側(cè)臥位固定，而是讓實(shí)驗(yàn)猴雙腿盤坐(圖2)，上身順勢(shì)趴下，用其雙腿固定上身不會(huì)左右晃動(dòng)，脊椎自然突起，動(dòng)物背部髂骨連線中點(diǎn)稍向下方第七腰椎間隙(第七腰椎與第一薦骨之間)正好處于最高處(圖3)。實(shí)驗(yàn)猴的這種臥姿最大限度地保證了固定的效果，而且實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)猴正上方操作，能更好地發(fā)力。猴子固定好以后，第七腰椎與第一薦骨非常明顯，剪去背毛用3%碘酊和75%酒精嚴(yán)格消毒后，用左手拇指、食指固定號(hào)穿刺部位的皮膚，右手持腰穿刺針垂直刺入(圖4)，可以更加明顯的體會(huì)到落空感及動(dòng)物的后肢跳動(dòng)。當(dāng)有落空感時(shí)，表明針已達(dá)椎管內(nèi)(蛛網(wǎng)膜下腔)。此時(shí)慢慢將猴上身直立，然后抽出穿刺針芯，可見透明的腦脊髓液慢慢滴出(圖1～4見文后彩插3)。

脊髓穿刺技術(shù)經(jīng)過改進(jìn)后，非常利于新手的學(xué)習(xí)和掌握，更加重要的是穿刺時(shí)間明顯縮短，成功率明顯提高。

［1］ Jay A.Levy，著，邵一鳴，譯.艾滋病病毒與艾滋病的發(fā)病機(jī)制［M］.北京：科學(xué)出版社.2010：38-40.

［2］ 王佑春，主編.艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量保證［M］.北京：科學(xué)出版社.2009：66.

［3］ 楊之蘭，肖明英，趙祥，等.側(cè)入法和直入法腰椎穿刺285例臨床觀察［J］.大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，12(5)：28-29.

［4］ 田野，黎蘭芝，陳強(qiáng)，等.提高腰椎穿刺成功率的體會(huì)［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2004，14(20)：1393-1394.

Improvement of the Collection Technique of Cerebrospinal Fluid in Monkeys

CHEN Ting，CONG Zhe，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Cerebrospinal fluid，plasma and lymph have a similar nature，and have important significance in AIDS research.In recent years the detection of cerebrospinal fluid has gradually become an important indicator in research and application of SIV/SHIV infection models in monkeys.The traditional puncture method of cerebrospinal fluid collection is not easy to learn and master.In this paper we report the results of our technical optimization for the collection of cerebrospinal fluid in monkeys.This method has significantly improved the successful rate and much shortened the time spent in collection of cerebrospinal fluid in monkeys.

Cerebrospinal fluid;Fluid collection;Improvement，technique

R33

A

1671-7856(2011)02-0049-02

2010-10-09

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.11

科技重大專項(xiàng)(項(xiàng)目號(hào)2009ZX10004-402)，NIH項(xiàng)目(3 R01 DA020419-02S1)。

陳霆(1985-)，男，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒分子生物學(xué)研究工作。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@sohu.com.