RT-SHIV中國恒河猴適應(yīng)株細(xì)胞水平生物學(xué)特性分析

姚 南，王 衛(wèi)，叢 喆，金 光，陶 真，魏 強(qiáng)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

RT-SHIV中國恒河猴適應(yīng)株細(xì)胞水平生物學(xué)特性分析

姚 南，王 衛(wèi)，叢 喆，金 光，陶 真，魏 強(qiáng)

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021)

目的 體外增值、制備動物感染來源的RT-SHIV病毒中國恒河猴適應(yīng)株，比較PBMCs和CEMx174兩種細(xì)胞制備出病毒的差異，同時用TZM-bl、CEMx174、PBMC三種細(xì)胞滴定測定病毒 TCID50。方法 用 RT-SHIV病毒靜脈感染中國恒河猴，定期采血測定血漿病毒載量，當(dāng)病毒載量達(dá)高峰時采血分離外周血單核淋巴細(xì)胞(PBMCs)，與正常恒河猴PBMCs或CEMx174細(xì)胞共培養(yǎng)，定期測定培養(yǎng)液中的P24抗原水平，當(dāng)病毒復(fù)制達(dá)高峰期時收集培養(yǎng)上清，分裝并凍存;測定病毒RNA載量、P24抗原濃度，滴定病毒的TCID50。結(jié)果 本研究共制備了78 mL PBMCs來源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174細(xì)胞來源的RT-SHIV病毒。RT基因序列和原始序列的相似度為99%，僅在第254和265位的氨基酸發(fā)現(xiàn)突變。RT-SHIV(PBMC)和 RT-SHIV(CEMx174)病毒載量分別為1.641×108copies/mL和 8.375×108copies/mL，P24抗原水平分別為 20.745 ng/mL和 4.28 ng/mL，TZM-bl、CEMx174、PBMC細(xì)胞測定病毒的 TCID50分別為3.16×105TCID50/mL和1×104TCID50/mL，5×102TCID50/mL和5×105TCID50/mL，5×102TCID50/mL和5×103TCID50/mL。結(jié)論 PBMCs細(xì)胞來源制備的病毒較CEMx174制備的病毒具有更高的感染性。

RT-SHIV;TCID50;細(xì)胞培養(yǎng)

為了篩選抗艾滋病藥物及研究耐藥性突變，德國科學(xué)家Klaus Uberla等于1995年首次構(gòu)建了RTSHIV病毒，其主要的構(gòu)建策略是以SIVmac239為主要框架，將 HIVHBc2中的 RT基因替換進(jìn)去，構(gòu)建出包含有 HIV-1 RT基因的 SHIV［1］。美國科學(xué)家Kelly Soderberg在 RT-SHIV的基礎(chǔ)上將 5’LTR的tRNA-Lys3 PBS區(qū)中堿基T定點突變?yōu)镃，構(gòu)建出構(gòu)建出感染能力更強(qiáng) RT-SHIV/TC［2］。本研究旨在制備RT-SHIV/TC中國恒河猴適應(yīng)株，并在細(xì)胞水平上對其生物學(xué)特性進(jìn)行分析和研究，以期為今后開展抗艾滋病藥物的體內(nèi)外篩選及耐藥性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 RT-SHIV

RT-SHIV由NIH AIDS Research and Reference Reagent Program(Dr.Thomas North and Dr.Joseph Sodroski)提供。該RT-SHIV是經(jīng)T-C定點突變修飾后的 RT-SHIV/TC，組織半數(shù)感染量為 3000 TCID50/mL［1-3］。

1.2 實驗動物

雄性恒河猴，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(合格證編號：SCXK(京)2005-2005)，實驗編號G1102V，實驗前體重2.35 kg，經(jīng)IFA法檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1)和猴T淋巴細(xì)胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。靜脈感染RT-SHIV 200 TCID50，定期采血，檢測血漿病毒載量。

1.3 RT-SHIV中國恒河猴PBMCs細(xì)胞適應(yīng)株和CEMx174細(xì)胞適應(yīng)株的大量制備

當(dāng)病毒載量達(dá)到高峰期時，分離外周血單核淋巴細(xì)胞PBMCs，進(jìn)行CD8+T細(xì)胞敲除，剩余的細(xì)胞用含丙酮酸鈉、非必需氨基酸的RMPI-1640生長液培養(yǎng)，并用 SEB(0.5 μg/mL)、IL-2(50 U/mL)進(jìn)行刺激，5%CO237℃孵育。3 d后，分別與同樣處理的正常猴 CD8-PBMC細(xì)胞或 CEMx174細(xì)胞按1：1比例混合共培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變，2～3 d測定上清液中P24抗原濃度;當(dāng)上清液中P24抗原濃度大于1 ng/mL時，收集病毒，分裝，液氮保存。

1.4 TZM-bl細(xì)胞滴定法

RT-SHIV用含0.5%慶大霉素的DMEM完全培養(yǎng)基10倍稀釋，混勻后加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入 100 μL，設(shè) 4 個復(fù)孔。用含 DEAE(15 μg/mL)(Sigma，code No.D9885) 和 Indinavir(1 μmol/L)(由 NIH AIDS ResearchandReferenceReagent Program提供)的DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整TZM-bl細(xì)胞濃度為 1.5 ×105個/mL，每孔加 100 μL，37℃，5%CO2孵育。48 h后棄去 100 μL上清液，加入100 μL Luciferase反 應(yīng) 液 (Promega，CodeNo.E2620)，5 min后取150 μL裂解上清加入黑色 96孔板，讀取吸光值，以細(xì)胞對照平均值的2.5倍設(shè)為感染 cutoff值，經(jīng) Reed-Muench公式計算 TCID50。

1.5 PBMC細(xì)胞滴定法

正常中國恒河猴PBMCs用高濃度的SEB(0.5 μg/mL)1640生長液預(yù)培養(yǎng)3 d。RT-SHIV用含低濃度SEB(0.1 μg/mL)1640生長液10倍系列稀釋，混勻后96孔板中每孔加入 180 μL，再添加 20 μL刺激好的 PBMC(細(xì)胞濃度為 2×107個/mL)，37℃、5%CO2中培養(yǎng)。每個病毒稀釋度重復(fù)4～6孔。24 h后換液150 μL，以后每隔2～3 d換液1次并測定培養(yǎng)上清中的P24抗原水平。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)，適時添加新的預(yù)刺激好的PBMCs。2周后，根據(jù)P24抗原測定結(jié)果計算TCID50。

1.6 CEMx174細(xì)胞滴定法

RT-SHIV用1640完全培養(yǎng)基10倍系列稀釋，混勻后于96孔板中每孔加入180 μL病毒稀釋液，再添加20 μL細(xì)胞(細(xì)胞濃度為2.5×106個/mL)，于37℃、5%CO2中培養(yǎng)。每個病毒稀釋度重復(fù)4～6孔。24 h后換液150 μL，以后每隔2～3 d換液1次，觀察并記錄細(xì)胞病變情況。根據(jù)陽性率計算TCID50。

1.7 RT-SHIV感染恒河猴外周血病毒載量的檢測

TRIzol法提取血漿中病毒 RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)Roche LightCycler熒光定量儀測定血漿病毒RNA載量［4］。

1.8 RT-SHIV P24抗原水平檢測

擴(kuò)增病毒期間，每隔2～3 d取100 μL病毒上清利用Vironostika HIV-1 Antigen試劑盒(梅里埃)測定P24抗原含量，以大于陰性對照值0.07判定為陽性。

1.9 RT-SHIV病毒RT基因擴(kuò)增

TRIzol法提取 RT-SHIV 的病毒 RNA［4］，使用reverse transcriptase XL(Takara，D2620)將病毒 RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，巢式 PCR擴(kuò)增其 RT基因(1670 bp)。引物分別為 RT out： CAGAGGA TTTGCTGCACCTCAATTC， Anti-RT out： CAAT CCATTTGCCAAGTCCCTAGAT;RT：ATTAGCC CTAT TGAGACTGTACCA， Anti-RT： AGCACTGACTAA TTTATCTACTTG。外套擴(kuò)增程序為 94℃ 5 min;94℃ 1 min，50℃ 30 s，68℃ 2 min;68℃ 10 min，30個循環(huán);內(nèi)套擴(kuò)增程序為94℃ 5 min;94℃ 1 min，45℃ 30 s，68℃ 2 min;68℃ 10 min，25 個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 RT-SHIV靜脈感染猴G1102V血漿病毒載量的結(jié)果

感染猴G1102V在感染后10 d血漿病毒載量呈陽性，17 d達(dá)到2.102×106copies/mL，21 d為1.793×106copies/mL。采集21 d的 EDTA抗凝血進(jìn)行RT-SHIV病毒的制備(圖1)。

圖1 RT-SHIV感染猴G1102V全血中病毒載量結(jié)果Fig.1 The viral loads in peripheral blood of G1102V infected with RT-SHIV

圖3 RT基因氨基酸序列比對圖Fig.3 RT amino acid sequence alignment

2.2 RT-SHIV中國恒河猴PBMCs細(xì)胞適應(yīng)株和CEMx174細(xì)胞適應(yīng)株的大量制備

感染猴CD8-PBMC細(xì)胞分別和正常猴CD8-PBMC細(xì)胞或CEMx174細(xì)胞合并培養(yǎng)。在整個培養(yǎng)的過程中，PBMCs和 CEMx174細(xì)胞生長狀態(tài)良好，擴(kuò)增病毒的過程中，兩種細(xì)胞均可見明顯的細(xì)胞融合現(xiàn)象(圖2)，CEMx174細(xì)胞中的融合泡要更多，更大一些。融合出現(xiàn)的時間在CEMx174細(xì)胞中出現(xiàn)的時間較早，于第4天便觀察到，PBMC細(xì)胞上在第9天出現(xiàn)細(xì)胞融合。最終測定兩種來源的RTSHIV病毒(PBMCs來源和 CEMx174來源)的 P24抗原濃度分別為20.745 ng/mL和 4.28 ng/mL，病毒載量為1.641×108copies/mL和8.375×108copies/mL。共制備了 78 mL PBMCs來源的 RTSHIV病毒和85 mL CEMx174細(xì)胞來源的 RT-SHIV病毒(圖2見文后彩插3)。

2.3 RT-SHIV細(xì)胞適應(yīng)株RT基因序列測定

巢氏PCR擴(kuò)增病毒的RT基因并送公司測序。測序結(jié)果顯示PBMCs來源和CEMx174來源的RTSHIV細(xì)胞適應(yīng)株中的RT基因與HIV-1HXB2(NCBI Accession No：K03455.1)的 RT基因的堿基相似度均為99%。堿基翻譯成氨基酸的序列比對中發(fā)現(xiàn)，兩種來源的RT-SHIV其編碼第178位和189位(在整個RT基因編碼的氨基酸中為第254位和265位的氨基酸)的氨基酸有發(fā)生改變，分別產(chǎn)生的氨基酸變化為E(谷氨酸)-K(賴氨酸)，T(蘇氨酸)-I(異亮氨酸)。在 http：//sable.cchmc.org/網(wǎng)站上對該突變病毒的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這兩個氨基酸對突變對RT酶的結(jié)構(gòu)和表達(dá)不產(chǎn)生影響(圖3)。

2.4 RT-SHIV病毒滴定結(jié)果

TZM-bl滴定過程中1：102及以上滴度能觀察到TZM-bl細(xì)胞的明顯細(xì)胞病變現(xiàn)象。CEMx174細(xì)胞進(jìn)行病毒TCID50滴定，可觀察到細(xì)胞的融合現(xiàn)象，PBMC來源的病毒于第2天便出現(xiàn)了病變，最高病變出于1∶105。CEMx174來源的病毒于第5天出現(xiàn)病變，最高病變出到1∶102。PBMC滴定的過程中未發(fā)現(xiàn)病變。具體滴定結(jié)果見表1。

表1 RT-SHIV病毒滴定結(jié)果Tab.1 Results of virus titration of RT-SHIV

3 討論

目前使用的RT-SHIV/TC病毒是由Klaus Uberla.構(gòu)建出來，Kelly Soderberg.在此基礎(chǔ)上改造而成的替換進(jìn)HIV-1 RT基因的嵌合病毒。本研究使用的病毒是由美國NIH申請而來。RT-SHIV病毒在藥物體內(nèi)體外篩選，耐藥性突變研究以及殺微生物劑等方面的應(yīng)用較為廣泛。

CEMx174是由 T淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系 CEMR.3和B淋巴細(xì)胞干細(xì)胞系721.174雜交而成的細(xì)胞系［5］，由于細(xì)胞系的穩(wěn)定性使之適用于 AIDS相關(guān)病毒的研究，CEMx174細(xì)胞表面主要含有 CXCR4受體和其他輔助受體［6］，用他進(jìn)行研究存在一定的局限性。RT-SHIV感染CEMx174細(xì)胞的機(jī)制和SIVmac239感染此細(xì)胞的機(jī)制相似，這是由于 RTSHIV 輔助受體決定基因 env［7］來源于SIVmac239［1］，他 們 可 能 是 通 過 CCR2、BOB(GPR15)、Bonzo(STRL33)或者 GPR1等受體與細(xì)胞表面結(jié)合而感染細(xì)胞［8］。國外文獻(xiàn)報道大量擴(kuò)增 RT-SHIV病毒使用的細(xì)胞均為 CEMx174［9］。PBMCs為外周血單核淋巴細(xì)胞，是含有單個圓核的所有血細(xì)胞的綜合，其主要包括淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，PBMCs細(xì)胞擴(kuò)增病毒是另外一種常規(guī)擴(kuò)增病毒的方法，從中國恒河猴中分離出的猴PBMCs細(xì)胞中含有SHIV感染的宿主細(xì)胞CD4+T淋巴細(xì)胞，而且細(xì)胞上CCR5，CXCR4和其余的一些輔助受體都存在，這點注定他能擴(kuò)增所有的 SIV/SHIV病毒。用來進(jìn)行擴(kuò)增的PBMCs細(xì)胞需要經(jīng)過磁珠分選敲除CD8+細(xì)胞的預(yù)處理，用以消除T淋巴細(xì)胞對病毒的免疫作用，使病毒能夠更快的感染細(xì)胞復(fù)制出病毒。兩種細(xì)胞制備出的RT-SHIV主要區(qū)別在于病毒的包膜蛋白來源不同，我們期望研究該膜蛋白的不同來源對病毒的感染能力的影響。結(jié)果顯示，P24抗原水平檢測中發(fā)現(xiàn)PBMCs來源的病毒的抗原數(shù)是CEMx174來源的4.8倍，分別為20.745 ng/mL和4.28 ng/mL，對兩種病毒的病毒載量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)CEMx174來源的病毒單位體積內(nèi)的病毒核酸量較高，對兩種病毒的TCID50進(jìn)行滴定的過程中發(fā)現(xiàn)PBMCs來源的病毒中的活病毒無論數(shù)量還是毒力均處于較高的水平，其在TZM-bl細(xì)胞和PBMC滴定中高于 CEMx174來源病毒的10倍，在CEMx174細(xì)胞滴定過程中也較后者先出現(xiàn)明顯病變，滴定也高103。因而我們可以得出結(jié)論在相同的條件下使用PBMCs細(xì)胞制備的病毒毒力較CEMx174細(xì)胞制備出的強(qiáng)。包膜來源于PBMC的感染細(xì)胞能力較來源于CEMx174的要強(qiáng)，這其中的機(jī)理有待我們進(jìn)一步的研究。兩種方法比較我們可以知道，使用 CEMx174制備病毒的過程比較簡單，主要原因是CEMx174為穩(wěn)定的細(xì)胞株比較好培養(yǎng)，而PBMC的培養(yǎng)比較繁瑣。對病毒毒力要求不是很高的情況下，比如進(jìn)行細(xì)胞學(xué)方面實驗我們可以考慮用CEMx174細(xì)胞來進(jìn)行病毒的制備。

該次對RT-SHIV病毒的TCID50滴定使用了三種不同的細(xì)胞，TZM-bl來源于Hela細(xì)胞，其表面表達(dá)CD4受體，CXCR4和CCR5輔助受體并攜帶HIV LTR控制的Luc。當(dāng)SHIV感染TZM細(xì)胞時，表達(dá)Tat蛋白，HIV-1 tat蛋白激活熒光素酶基因上游的 LTR，增強(qiáng) luciferase表達(dá)［10］。通過檢測 TZM細(xì)胞中l(wèi)uc的表達(dá)情況，可以確定病毒感染和復(fù)制的效率。CEMx174細(xì)胞也一種穩(wěn)定的細(xì)胞系，CXCR4嗜性的病毒感染該種細(xì)胞后能表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞病變的融合現(xiàn)象，我們可以通過觀察細(xì)胞病變情況來確定其感染情況，必要時也可以通過測定P24輔助判斷。PBMC細(xì)胞從中國恒河猴全血細(xì)胞中分離而來，進(jìn)行病毒滴定的PBMC細(xì)胞要求不要敲出其CD8+細(xì)胞，因為要模擬中國恒河猴感染病毒的情況。觀察這三種滴定方法我們可以看到使用TZM-bl細(xì)胞進(jìn)行滴定的值最為精確，由其滴定出的結(jié)果具有國際通用性，使用CEMx174細(xì)胞進(jìn)行滴定存在一定的主觀性和局限性，而使用PBMC進(jìn)行滴定最能夠模擬中國恒河猴的感染情況，滴定出的結(jié)果在感染動物時最具有參考價值，為進(jìn)行疫苗等相關(guān)的實驗具有很大的借鑒作用。就RT-SHIV的兩種病毒滴定三種細(xì)胞滴定出的結(jié)果存在一致性，都表現(xiàn)出PBMC來源的病毒較CEMx174來源的病毒具有更高的感染性。但每種細(xì)胞表現(xiàn)出的滴度高低具有一定的出入，證明不同來源的相同病毒對這三種細(xì)胞的感染能力不同。以后開展相關(guān)實驗需用實驗用細(xì)胞進(jìn)行滴定，可使結(jié)果更加可行準(zhǔn)確。

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In Vitro Characterization of RT-SHIV Adapted in Chinese Rhesus Monkeys

YAO Nan，WANG Wei，CONG Zhe，JIN Guang，TAO Zhen，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To propagate and titrate the adapted RT-SHIV from Chinese rhesus monkey using TZM-bl，CEMx174 and PBMCs cells，and to compare the possible difference of these viruses which propagated in PBMC and CEMx174，respectively.Methods Rhesus macaques free-living in China were infected with RT-SHIV intravenously.Blood samples were collected regularly and viral loads were monitored.Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were examined when the viral load reached the peak，and were co-cultured with PBMCs from uninfected rhesus or CEMx174 cells.The P24 antigen level from supernatant was monitored regularly.The co-cultured virus was collected，packed andfrozen when the viral replication reaches the peak.The collected viruses as a stock were charactarized with the RNA viral loads，P24 antigen level and titration of TCID50.Results In this study，in tatol of 78 mL of RT-SHIV in monkeys’PBMCs and 85 mL of RT-SHIV was propagated in CEMx174 cells，respectively.The similarity between RT gene sequence and original sequence was 99%，only two mutation of amino acid at 254 and 265.RT-SHIV(PBMC)and RT-SHIV(CEMx174)viral loads were titrated with TZM-bl，CEMx174 and PBMCs，and their results were 1.641 × 108copies/mL and 8.375 ×108copies/mL.respectively，P24 antigenlevel were 20.745 ng/mL and 4.28 ng/mL，respectively，titrations of TCID50in TZM-bl，CEMx174，PBMC were 3.16×105TCID50/mL and 1×104TCID50/mL;5×102TCID50/mL and 5×105TCID50/mL;5×102TCID50/mL and 5×103TCID50/mL，respectively.Conclusions RT-SHIV propagated from PBMCs has higher infective ablity than that from the other cells in vitro.

RT-SHIV;TCID50;cell culture

R373.33;R33

A

1671-7856(2011)02-0031-05

2010-09-29

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.08

“十一五”國家科技重大專項課題 (2009ZX10004-307)，協(xié)和青年基金(RT-SHIV動物模型的建立)。

姚南，男，碩士研究生，從事實驗動物病毒學(xué)研究工作。

魏強(qiáng)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：實驗動物病毒學(xué)。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。