貝類毒素監(jiān)測的動(dòng)物試驗(yàn)優(yōu)化及替代方法

程樹軍，黃 韌，劉慧智

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室，廣州 510623;2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣州 510642)

貝類毒素監(jiān)測的動(dòng)物試驗(yàn)優(yōu)化及替代方法

程樹軍1，黃 韌2，劉慧智1

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心食品實(shí)驗(yàn)室，廣州 510623;2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所，廣州 510642)

貝類毒素嚴(yán)重威脅水產(chǎn)品的質(zhì)量，而且給人類健康帶來潛在危害。由于其結(jié)構(gòu)多樣、作用機(jī)制復(fù)雜，貝類毒素監(jiān)控計(jì)劃通常使用動(dòng)物方法，不僅成本高、定量難，而且不符合“3R”的要求。運(yùn)用減輕動(dòng)物痛苦和減少數(shù)量的優(yōu)化方法，開發(fā)新的基于毒性作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)分析的細(xì)胞功能檢測法、免疫學(xué)方法、化學(xué)分析法和生物傳感器方法，這些動(dòng)物試驗(yàn)替代方法的研究提高了貝類毒素監(jiān)測的有效性，經(jīng)過科學(xué)驗(yàn)證和認(rèn)可后可用于監(jiān)控目的。

貝類毒素;動(dòng)物實(shí)驗(yàn);替代方法

貝類毒素，也稱海洋生物毒素，主要由藻類或浮游植物產(chǎn)生，蓄積于濾食性軟體貝殼類動(dòng)物的組織內(nèi)，例如蚌、扇貝、蛤蚌、牡蠣等，不僅嚴(yán)重威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖，而且人類食用了受污染的貝類動(dòng)物會(huì)帶來嚴(yán)重的健康危害［1］。世界許多國家建立了貝類毒素監(jiān)控計(jì)劃，多數(shù)推薦采用經(jīng)典的動(dòng)物試驗(yàn)，這些方法存在明顯的不足和局限，而且不符合3R的原則，因而開發(fā)更加敏感、特異、快速和高通量的貝類毒素檢測新技術(shù)已成為該領(lǐng)域的重點(diǎn)。

1 貝類毒素分類及基本毒性

根據(jù)貝類毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為8類，分別是岡田軟海綿酸 (okadaic acid，OA)，扇貝毒素(pectenotoxin，PTX)，石房蛤毒素(saxitoxin，STX)，原多甲藻酸(azaspiracid，AZA)，短裸甲藻毒素(brevetoxin，BTX)，環(huán)狀亞胺(cyclic imines)，軟骨藻酸(domoic acid，DA)和蝦夷扇貝毒素(yessotoxin，YTX)。根據(jù)毒性作用機(jī)制可分為4類，分別是腹瀉性貝毒(DSP)、麻痹性貝毒(PSP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)和遺忘性貝毒(ASP)。STX及其衍生物屬于麻痹類毒素，DA屬于遺忘毒素，腹瀉類貝類毒素包括OA和翅甲藻毒素(DTX)，AZA、PTX和YTX屬于親脂毒素。

腹瀉性貝毒(DSP)可分成三類：聚醚類毒素(如OA和DTX)、大環(huán)聚醚內(nèi)酯毒素(如PTX)和融合聚醚毒素(如YTX)。DSP毒素主要引起腹瀉，通常癥狀不嚴(yán)重，對小鼠的半致死量為 LD50為50 μg/kg，但岡田軟海綿酸(OA)是強(qiáng)烈的致癌因子。歐盟2002/225/EC對此類毒素設(shè)定了最高限量水平：其中OA/DTX和PTX的總量不能超過160 μg OA eq/kg;YTX及其衍生物不能超過1 mg YTX eq/kg;AZA不能超過160 μg AZA eq/kg。麻痹性貝毒(PSP)大致分為三類：氨基甲酸酯類毒素，包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素和膝溝藻毒素(GTX1-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?包括 GTX5、GTX6);脫氨甲?；惗舅?包括 dcSTX、dcneoSTX、dcGTX1-4)。麻痹性貝毒主要作用是阻斷細(xì)胞納離子通道，造成神經(jīng)系統(tǒng)傳輸障礙而生產(chǎn)麻痹作用。PSP的LD50在(3～10)×10-9μg/kg之間，我國和歐盟均規(guī)定上市貝類麻痹性貝毒必須低于800 μg/kg貝肉，相當(dāng)于4 Mu/g。神經(jīng)性貝毒(NSP)主要由短裸甲藻產(chǎn)生，目前已分離多達(dá)13種毒素，包括BTX-A，B和半短裸甲藻毒素B(hemibrevetoxins B)等。NSP可以引起魚類的大量死亡，人類食用后產(chǎn)生以神經(jīng)麻痹為主要特征的中毒癥狀。遺忘性貝毒(ASP)的主要成分是軟骨藻酸，它是一種強(qiáng)烈的神經(jīng)毒性非蛋白氨基酸，能導(dǎo)致短期記憶功能長久損害，LD50為10 μg/kg，2009年，歐盟提出 ASP的允許含量水平為 20 mg DA/kg［2］。

2 貝類毒素監(jiān)測的動(dòng)物試驗(yàn)及優(yōu)化方法

2.1 經(jīng)典動(dòng)物試驗(yàn)

1937年Sommer等建立了監(jiān)測PSP的小鼠生物法(MBA法)，MBA法是AOAC和歐盟指令91/492/EEC指定的檢測方法，并且已經(jīng)使用了50多年，檢測限值近似40 μg STXeq/100 g貝殼組織，是目前最高殘留限量的(MRL)50%。其原理是將待檢樣品的酸性提取液直接進(jìn)行小鼠腹腔內(nèi)注射，記錄死亡時(shí)間，如果＜5 min，則要稀釋提取物直到死亡時(shí)間達(dá)到5～7 min。結(jié)果用“小鼠單位(MU)”表示，其定義是使一只20 g重的小鼠在腹腔注射后15 min內(nèi)死亡的毒素含量即為一個(gè)鼠單位，而1 Mu的毒素含量相當(dāng)于0.18 g的 STX(石房蛤毒素)，可以通過乘以轉(zhuǎn)換系數(shù)從小鼠單位MU轉(zhuǎn)換到μg STX當(dāng)量，但由于不同品種的小鼠的敏感性不同，這個(gè)數(shù)值會(huì)有波動(dòng)，實(shí)際應(yīng)用中每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的Mu校正數(shù)值。

DSP毒素的MBA檢測法沒有統(tǒng)一的方案，前處理方式(提取溶劑)和檢測樣品(整個(gè)生物體或肝胰臟)對檢測效果影響很大。小鼠生物法的最低檢出限量是0.5 Mu/g，換算為 DSP的毒力約為220 μg/kg，報(bào)告結(jié)果需2 d時(shí)間。每個(gè)試驗(yàn)選3只小鼠，腹腔注射5 g HP-eq或25 g WB-eq，如果有兩只死亡可以判定陽性結(jié)果。大鼠生物鑒定法(RBA)也可以用來檢測DSP中的OA/DTXs和AZAs。

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn)

MBA檢測法相對快速、可靠，在目前還有很多毒素結(jié)構(gòu)未明和機(jī)制不清楚的情況下，有可能根據(jù)動(dòng)物出現(xiàn)的異常癥狀檢測未知毒素(如某些親脂毒素)的整體反應(yīng)，并且無需投入昂貴分析儀器。

動(dòng)物試驗(yàn)也有明顯缺點(diǎn)［3］：①檢測樣品鹽度較高干擾測定結(jié)果，因而真實(shí)毒力水平可能被低估，如對于PSP的檢測，實(shí)際毒素濃度范圍可能是檢測結(jié)果的1.5～2.5倍;②檢測結(jié)果存在實(shí)驗(yàn)室間偏倚，而且無法自動(dòng)化和高通量;③實(shí)驗(yàn)需要大量高標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以死亡為終點(diǎn)，給動(dòng)物帶來痛苦;④由于鋅的天然蓄積(尤其是蚌)可能對PSP的檢測存在假陽性［3］;⑤小鼠品系和性別可能對結(jié)果有影響;⑥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人類的相關(guān)性備受質(zhì)疑，如對于DSP的檢測，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是用OA/DTXs毒素對小鼠的腹腔注射毒性反映其對人的經(jīng)口毒性關(guān)系，不僅未考慮OA/DTXs等親脂性毒素的其他作用途徑和機(jī)制，而且小鼠腹腔毒性與人的經(jīng)口毒性可能不盡相同;⑦M(jìn)BA方法檢測親脂毒素缺少專一性，無法區(qū)別究竟哪一種毒素導(dǎo)致了毒性效應(yīng)，因而假陰性和假陽性都會(huì)發(fā)生。⑧對于DSP的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，不管是小鼠MBA和大鼠RBA試驗(yàn)均未經(jīng)過驗(yàn)證，歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CEN)也沒有對貝類毒素檢測的動(dòng)物試驗(yàn)制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要是以 Yasumoto開發(fā)的DSP毒素檢測方法為基礎(chǔ)建立的，但是即使不同實(shí)驗(yàn)室使用相同方案，也還有許多不同因子影響檢測結(jié)果。而且RBA只能用于OA和AZA類毒素的檢測［4］。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和減少

Dennison開發(fā)了PSP試驗(yàn)的麻醉小鼠模型，試驗(yàn)過程中保持小鼠處于麻醉狀態(tài)［5］，減輕了動(dòng)物的痛苦，來自STX的檢測數(shù)據(jù)表明麻醉可能會(huì)增加PSP MBA方法的靈敏度，比知覺模型可靠。

英國貝類毒素國家參考實(shí)驗(yàn)室建立了減少動(dòng)物數(shù)量的方法，將標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的動(dòng)物數(shù)量從3只減少到2只，因?yàn)閺慕y(tǒng)計(jì)分析表明，只使用2只小鼠的實(shí)驗(yàn)可以為超過99%的樣品檢測提供明確的結(jié)果。只有在試驗(yàn)出現(xiàn)1只小鼠死亡1只小鼠存活的情況下，才增加第3只小鼠用于確認(rèn)。

Asp建議去除 PSP MBA方法中的稀釋步驟使動(dòng)物數(shù)量減少，作者認(rèn)為沒有必要將高濃度的毒素樣品稀釋，直到小鼠的存活時(shí)間在5～7 min范圍內(nèi)，因?yàn)镸BA試驗(yàn)的目的是為了保護(hù)消費(fèi)者免于PSP的傷害，縱使注射未稀釋的高濃度毒素樣品時(shí)會(huì)降低檢測的精密度，但是只要注射的樣品超過了動(dòng)物的耐受水平，檢測的精確性并不是那么重要［6］。

3 動(dòng)物試驗(yàn)替代方法

3.1 細(xì)胞檢測方法

細(xì)胞檢測方法的原理是利用貝類毒素與敏感測試系統(tǒng)(細(xì)胞成份)的相互作用，通過檢測細(xì)胞反應(yīng)定量檢測毒素水平，細(xì)胞檢測法建立在對毒素作用機(jī)制充分認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上。測試系統(tǒng)可以是細(xì)胞系統(tǒng)也可以是無細(xì)胞系統(tǒng)，但應(yīng)含有識(shí)別毒素的靶分子結(jié)構(gòu)。如石房蛤毒素(STX)和BTX可對Na+通道產(chǎn)生抑制作用，根據(jù)這一原理，可以通過檢測STX對毒毛花苷/藜蘆預(yù)處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的存活情況，也可以檢測STX對藜蘆預(yù)處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中膜電位的變化［7］?？捎弥苯颖壬?、熒光分析或膜電位染色，采用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行高通量檢測［8］。岡田酸(OA)類毒素可特異性抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)，利用這一機(jī)制可開發(fā)各種定量檢測方法，檢測極限可達(dá)0.2 nmol/L，如采用直接比色、熒光分析和電化學(xué)檢測等，測試系統(tǒng)可采用紅細(xì)胞(PP2A較敏感)，也可采用無細(xì)胞的特異性酶底物(如對氨基苯基磷酸鹽)。扇貝毒素(YTX)素對磷酸二酯酶(PDE)活性具有增強(qiáng)作用，后者直接作用于環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)生次級(jí)反應(yīng)，基于此機(jī)制，建立了以培養(yǎng)的上皮細(xì)胞中e-鈣粘蛋白的測量為基礎(chǔ)的PDE活性生物化學(xué)分析方法，采用多孔滴定板快速(1 h)熒光分析技術(shù)，可應(yīng)用于大量樣品的篩選［9］。

3.2 免疫學(xué)方法

通過制備貝類毒素的抗體，然后檢測抗體與化合物的特異性結(jié)合，利用這一免疫學(xué)原理可建立檢測貝類毒素的系列試驗(yàn)，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、橫向流動(dòng)免疫測定(LFIA)和基于表面等離子體共振的生物傳感器試驗(yàn)(SPR)。免疫學(xué)方法的使用可替代部分動(dòng)物試驗(yàn)用于樣品的初篩。因?yàn)橥ǔＶ挥性趩我欢舅卮嬖诓⑶移淇贵w特異性高的情況下，樣品中毒素濃度的測量與它的毒性直接相關(guān)(如DA毒素的檢測)。而在其它情況下，免疫學(xué)方法只能用于樣品的篩選或定性方法，不能作為定量方法。

檢測ASP可采用橫向流動(dòng)免疫色譜法(LFIC)、ELISA法和SPR生物傳感器技術(shù)。檢測石房蛤毒素(STX)可采用抗體法和受體錨定法2種方法，其中側(cè)向橫流免疫色譜(LFIC)的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒已完成協(xié)作試驗(yàn)，有望通過 AOAC的認(rèn)可。采用這類LFIC試劑盒(如 MIST AlertTM)檢測 PSP，可以在不到20 mim時(shí)間內(nèi)得到40 μg/100 g的檢測極限，非常方便現(xiàn)場試驗(yàn)和終產(chǎn)品檢測。神經(jīng)性貝毒(NSP)的檢測目前已有ELISA方法檢測短祼甲藻毒素，并被美國官方認(rèn)可。

3.3 化學(xué)分析方法

以液相色譜(LC)分離原樣或凈提取物為基礎(chǔ)，然后用物理化學(xué)方法進(jìn)行特異性毒素檢測，例如用紫外線(LC-UV)、熒光法(LC-FL)或質(zhì)譜分析法(LC-MS)檢測毒素，這樣完全不使用動(dòng)物就可實(shí)現(xiàn)毒素的定量檢測。2007年，采用超高壓液相色譜(VHPLC)-MS/MS檢測法實(shí)現(xiàn)了僅用6.6 min分析21種親脂類毒素［10］，借助于靈敏度不斷提高的檢測設(shè)備，更快速和高通量的檢測方法有望不斷建立。由于這些方法對化合物檢測的特異性，化合物中單一物質(zhì)的單獨(dú)濃度的原始數(shù)據(jù)必須用轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換成毒素當(dāng)量?；瘜W(xué)方法是目前歐盟等法規(guī)檢測貝類毒素的定量分析方法(如 HPLC檢測ASP)，缺點(diǎn)是需要高純度標(biāo)準(zhǔn)品，而對于大多數(shù)毒素，合成或提純標(biāo)準(zhǔn)品非常困難。

3.4 生物傳感器方法

在對毒素作用機(jī)制充分了解的基礎(chǔ)上，以生物化學(xué)和傳感技術(shù)為基礎(chǔ)建立生物傳感器方法，利用生物活性物質(zhì)(如酶、抗體、抗原、細(xì)胞等)作識(shí)別元件，配以適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換器所構(gòu)成的分析工具。這項(xiàng)技術(shù)適用于貝類毒素的高通量的快速檢測，如利用 OA類毒素對蛋白磷酸酶2A(PP2A)產(chǎn)生特異性抑制作用的特點(diǎn)，Campas等2007年開發(fā)了一種用于OA的電化學(xué)檢測酶傳感器，這種傳感器建立在固定該毒素的PP2A酶的抑制作用和由酶引起脫磷酸化作用之后才具有電化學(xué)活性的酶基質(zhì)的基礎(chǔ)上［11］。使用石英晶體微天平(QCM)來測定 OA，采用直接競爭法結(jié)合化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)以提高檢測的靈敏度。對于神經(jīng)性貝毒(NSP)檢測的檢測也有類似的方法，如利用PbTx-3對胞外動(dòng)作電位的效應(yīng)，開發(fā)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)生物傳感器檢測PbTx-3，檢測限在緩沖溶液中為296 pg/mL，在稀釋25倍的海水中為430 pg/mL。

表1 貝類毒素監(jiān)測的動(dòng)物試驗(yàn)及替代方法Tab.1 Animal testing and alternative methods for shellfish toxins monitoring

4 前景展望

近年來，以歐洲食品安全局為代表的機(jī)構(gòu)投入了大量資金用于貝類毒素檢測方法的研發(fā)，許多具有前景的非整體動(dòng)物的替代方法被提出或進(jìn)入驗(yàn)證階段(表 1)［3］。

目前歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CEN)完成標(biāo)準(zhǔn)化的貝類毒素分析方法主要是以液相色譜技術(shù)為基礎(chǔ)的化學(xué)分析法，如檢測貝類 DA毒素的LC-UV方法，檢測貝殼類OA毒素的前置柱衍生作用加熒光檢測的LC-FL方法，檢測貝殼類STX和dc-STX毒素的前置柱衍生作用加熒光檢測的LC-FL方法，檢測貝殼類OA毒素的有后置柱衍生作用加熒光檢測的LC-方法等。然而由于動(dòng)物試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和差異性等方面的局限，雖然監(jiān)管部門都將MBA方法列為監(jiān)測計(jì)劃的檢測方法，但CEN沒有對貝類毒素檢測的動(dòng)物試驗(yàn)制訂統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

顯然，尋找替代動(dòng)物試驗(yàn)的方法仍是貝類毒素監(jiān)控檢測技術(shù)研發(fā)的熱點(diǎn)，雖然已有一些替代方法被推薦作為食品法典委員會(huì)的參照方法或被官方認(rèn)可用于監(jiān)管目的，但仍有許多問題需要解決，如大多數(shù)細(xì)胞檢測法或化學(xué)分析法只能針對某一特定類別毒素的分析，使其應(yīng)用范圍受到一定限制;免疫學(xué)方法雖然能進(jìn)行多樣品的同時(shí)檢測，但靈敏度和檢測限還不能滿足監(jiān)控要求;替代方法的穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，生物傳感器方法中生物識(shí)別元件的再生及可重復(fù)利用問題并未得到根本解決［12］。隨著貝類毒素作用機(jī)制了深入了解和檢測技術(shù)的進(jìn)步，在3R原則的推動(dòng)下，很多替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法應(yīng)用于海洋產(chǎn)品的質(zhì)量檢測和納入生態(tài)環(huán)境監(jiān)控計(jì)劃是非常有前景的。

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Optimization of Animal Testing and Alternative Methods for Shellfish Toxin Monitoring

CHENG Shu-jun1，HUANG Ren2，LIU Hui-zhi1
(1.Food Lab of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Guangzhou 510623，China;2.Guangdong Laboratory Animal Monitoring Institute，Guangzhou 510620)

Objective Shellfish toxins are not only threatening to quality of marine aquatic products but also become a potential threat to human health.As the structure diversity and function mechanism complexity，the monitoring programs of shellfish toxins using animal models are costly，difficult to quantitate and not meet 3R principles.There is a pressing need to develop new methods to reduce quantity of used animals and to relieve animal distress.Recently，many new assays based on action mechanisms have been developed including functional，immunological，chemical analysis and biosensor methods.These methods promote the efficacy of shellfish toxin monitoring，and will be accepted by administration for regulation programs provided these approaches be scientifically validated and standardized.

Shellfish toxin，monitoring;Animal test;Alternative method

R185;R332

A

1671-7856(2011)02-0051-05

2010-09-20

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.12

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B060300013)。

程樹軍(1971)，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動(dòng)物試驗(yàn)替代方法及標(biāo)準(zhǔn)化。