豚鼠甲流H1N1感染模型的建立及激素甲強龍對感染干預(yù)作用的探討

占玲俊，鮑琳琳，鄧 巍，張鵬俊，呂 琦，馬春梅，曹 彬，秦 川

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市朝陽醫(yī)院呼吸疾病研究所，北京 100020)

豚鼠甲流H1N1感染模型的建立及激素甲強龍對感染干預(yù)作用的探討

占玲俊1，鮑琳琳1，鄧 巍1，張鵬俊2，呂 琦1，馬春梅1，曹 彬2，秦 川1

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市朝陽醫(yī)院呼吸疾病研究所，北京 100020)

目的 建立豚鼠的甲流感染模型并評價激素甲強龍對感染的干預(yù)作用。方法 將4～6周齡雌性SPF級豚鼠(200～300)g分為4組：正常對照組，模型組，甲強龍1組和甲強龍2組，除對照組外，豚鼠經(jīng)乙醚麻醉后進行滴鼻接種A/California/7/2009(CA7)病毒，分別于攻毒后3 d和5 d給予激素甲強龍，大劑量3 d后1/4劑量給3 d，檢測豚鼠感染的多項指標，觀察期為14 d。結(jié)果 成功建立了豚鼠的甲流感模型;甲強龍1組豚鼠肺部炎癥減輕較模型組和甲強龍2組明顯，存活率較這兩組均降低，甲強龍2組肺部炎癥較模型組減輕，而較甲強龍1組重，豚鼠的存活率較這兩組均無差異。結(jié)論 豚鼠能感染A/California/7/2009(CA7)病毒，感染后5 d比感染后3 d開始給予激素的干預(yù)效果好。

甲流;模型，豚鼠;甲強龍

近年來，豚鼠作為流感的易感動物應(yīng)用越來越多，主要用于流感的感染和傳播機制研究［1-3］。甲流的小鼠和雪貂感染模型已相繼建立［4，5］，豚鼠對甲流H1N1是否易感，并進行多種動物的比較研究，值得探討。

流感感染常引起病毒性肺炎，并能繼發(fā)細菌性肺炎，嚴重威脅患者生命。病毒感染性肺炎的治療不但要在感染早期積極抗病毒，而且要注意預(yù)防機體出現(xiàn)過亢的炎癥反應(yīng)。在重癥感染中，炎癥反應(yīng)參與了這一過程并發(fā)揮了重要作用，而激素類藥物迄今仍是最有效的緩解炎癥藥物，作為肺部感染的輔助治療受到了廣泛關(guān)注。但是激素在不同程度流感感染中的治療作用，特別是其應(yīng)用指征、治療劑量以及給藥時相和療程等方面一直存在爭議。

因此，本研究中我們利用本室已有的甲流毒株建立豚鼠甲型H1N1動物模型，探討糖皮質(zhì)激素甲強龍對甲型H1N1流感的病毒性肺炎的干預(yù)作用，為臨床上甲型H1N1流感的病毒性肺炎和繼發(fā)感染性肺炎提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

H1N1病毒株為 A/California/7/2009，其 HA效價都為 1∶32，CA7106TCID50/0.2 mL。SPF 級雌性哈氏天竺豚鼠，4～6周齡，體重(200～300)g，由中國藥品生物制品檢定所提供。犬腎MDCK傳代細胞系本所儲存細胞，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。0.01 mol/L，pH 7.2，PBS配制成0.1%的豚鼠紅細胞懸液，4℃保存。RVC-II型獨立送風隔離籠具 Tecniplast公司;RNeasy mini kit購自Qiagen公司;AMV反轉(zhuǎn)錄酶及 RNA酶抑制劑購自 Promega公司;Taq plus DNA聚合酶及dNTP購自TaKaRa公司，ABI power SYBR Green Mix購自ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠的感染和給藥：實驗在本所的ABSL-3實驗室中進行。將20只4～6周齡雄性豚鼠按體重均衡的原則分為正常對照組、模型組、甲強龍1組和甲強龍2組。每組5只，每籠2～3只。標記后分別稱重。病毒液的滴度為106TCID50。將豚鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉后，滴鼻接種病毒，每只豚鼠150 μL/每鼻孔，共 300 μL，對照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。獨立送風隔離籠具中正常飼養(yǎng)。實驗的觀察期為14 d。甲強龍1組和2組的豚鼠分別于感染后3 d和5 d開始連續(xù)使用激素甲強龍，采用腹腔注射的方法，先用8.75 mg/kg/d的大劑量3 d后改用2.12 mg/kg/d的1/4量3 d。

1.2.2 臨床觀察和取樣：每日觀察記錄豚鼠的活動狀態(tài)及臨床表現(xiàn)，存活情況，0、3、5、8、14 d 稱量體重。取豚鼠感染后的鼻腔灌洗液，分0、3、5和8 d采樣。無菌采集瀕死和處死豚鼠的臟器：心、肝、脾、肺、腎、小腸、氣管和腦，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 豚鼠鼻腔灌洗液和臟器病毒滴度的測定：鼻腔灌洗液100 μL直接接種于單層培養(yǎng)MDCK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每個樣品接種4個重復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中37℃靜止培養(yǎng)，觀察記錄各孔細胞病變(CPE)情況，連續(xù)觀察 2～3 d。按照 Reed-Muench方法計算灌洗液中病毒的TCID50。

用DMEM液按1∶10(M/V)將豚鼠臟器研磨成乳劑，5 000 r/min離心10 min，上清液加雙抗(青霉素、鏈霉素各 1 000 IU/mL)4℃過夜，7 000 r/min，離心20 min，取上清液，-70℃保存。組織上清液10×連續(xù)稀釋至10-8，接種于單層培養(yǎng)MDCK細胞的96孔細胞培養(yǎng)板上，每個稀釋度接種4個重復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱中37℃靜止培養(yǎng)，觀察記錄各孔細胞病變(CPE)情況，連續(xù)觀察 2～3 d。按照 Reed-Muench方法計算感染豚鼠臟器病毒的TCID50。

1.2.4 病理學(xué)檢查：無菌取瀕死豚鼠的臟器心、肝、脾、肺、腎、小腸、氣管和腦，用甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)HE染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.2.5 Real time RT-PCR檢測：根據(jù)中國CDC公布的甲流H1N1流感病毒HA基因序列設(shè)計一對引物：SW-H1 F786：5’-AATAACATTAGAAGCAACTG G-3’;SW-H1 R920：5’-AGGCTGGTGTTTATRGCA CC-3’。擴增片段的大小為153 bp。按RNeasy minikit方法提取RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄。將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，加至20 μL Power SYBR Green定量 PCR 反應(yīng)體系中，瞬時離心后置 StepOne定量 PCR儀進行擴增。擴增條件：94℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s變性，52℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，35循環(huán)，72℃延伸7 min，95℃ ，15 s，60℃，1 h，95℃，15 s。標準品的制作方法見參考文獻［1，7］。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法：豚鼠的體重變化用體重百分比表示，即以豚鼠當天體重減去其第0天的體重的差值作分子，以第0天的體重作分母，記錄為平均體重變化百分比±標準差，數(shù)值采用每組的平均數(shù)。豚鼠的存活率即存活只數(shù)與該組原總只數(shù)的百分比值。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

正常對照組，模型組，甲強龍1組和2組豚鼠的毛發(fā)，活動度未見明顯異常，甲強龍1組有3只豚鼠出現(xiàn)體重下降，有2只極度消瘦，其中1只于感染后7 d死亡，另1只于感染后第8天瀕死給予解剖(表1)。體重變化情況見圖1。

2.2 鼻腔灌洗液和組織臟器的病毒分離

感染后每天取豚鼠的鼻腔灌洗液，瀕死或處死的豚鼠做病毒滴度培養(yǎng)，用Reed-Muench法計算樣品中病毒含量(TCID50/0.02 mL)。模型組和甲強龍1組和2組的鼻腔灌洗液能分離到病毒，而組織臟器中均未分離到活病毒(表2)。

2.3 感染豚鼠的鼻腔灌洗液和臟器的real time RT-PCR檢測結(jié)果

鼻腔灌洗液和各臟器樣品進行流感病毒定量RT-PCR擴增，鼻腔灌洗液中能擴增出病毒(圖2)，而組織臟器中未擴增出病毒。

表1 豚鼠的存活情況Tab.1 Survival of the guinea pigs

2.4 感染小鼠病理變化結(jié)果

感染的小鼠除肺臟以外，其他組織均無病變。肺組織病理結(jié)果如下：對照組無病變。模型組中有2例(2/5)為重度肺炎，3例(3/5)為彌漫性間質(zhì)性肺炎。肺病理切片可見肺靜脈及肺泡壁毛細血管明顯擴張充血，部分肺靜脈壁及周圍組織明顯水腫，局部支氣管及肺泡上皮細胞壞死、脫落，肺泡腔內(nèi)可見大量滲出和漏出的紅細胞、水腫液、炎細胞及壞死脫落的上皮細胞碎屑。甲強龍1組中4例未見明顯異常，1例(1/5)有重度肺炎。甲強龍2組有1例(1/5)彌漫性間質(zhì)性肺炎，4例(4/5)局灶性間質(zhì)性肺炎。病理切片可見局灶性支氣管周圍炎細胞浸潤，肺間隔增寬(圖3，見彩插2)。

圖1 豚鼠感染后體重變化百分比Fig.1 Percentage of postinfection weight changes of the guinea pigs

3 討論

小鼠和雪貂的甲流模型相繼建立，但是豚鼠的甲流模型罕有報道。豚鼠作為流感的實驗動物有其獨有的優(yōu)勢：豚鼠是實驗動物，遺傳背景相對清楚;豚鼠能感染人源和禽源A型流感病毒如H5N1，H1N1，H3N2，模擬哺乳動物感染流感病毒［1，3］。由于豚鼠的成本較低，占有空間小，相關(guān)免疫和生化試劑易獲得，因此豚鼠逐漸替代雪貂進行較大規(guī)模的動物易感性和抗病毒治療等機制的研究;豚鼠是模擬流感傳播的理想動物模型［1］。

豚鼠感染甲流106TCID50后，模型組，甲強龍1組和2組的鼻腔灌洗液能分離到活病毒，并且結(jié)果與的病毒載量吻合，提示豚鼠能感染上CA7 H1N1，豚鼠的甲流模型成功建立。

病理結(jié)果顯示：模型組肺臟病變的程度重且范圍廣，在感染后第3天給予甲強龍后，病變明顯減輕或消失;在感染后第5天給予甲強龍后，病變亦減輕，但減輕程度不如甲強龍3天給藥組。病理結(jié)果雖然提示有病理損傷，但是綜合病毒分離和病毒載量的結(jié)果可以看出肺部的病理損傷極有可能不是病毒的直接作用引起，而是間接的免疫損傷。

激素治療后，相比較模型組，肺部炎癥都有減輕，但是感染后3 d開始使用激素，雖然可以減輕肺部炎癥，但可能會影響機體的整體機能，最后導(dǎo)致消瘦死亡。而感染后5 d開始使用激素雖然肺部炎癥減輕不如甲強龍1組，但對豚鼠整體機能影響不明顯?？梢姡瑢τ陔嗍?，早用激素弊大于利，而稍晚用激素，利大于弊。這對于臨床上重癥病毒性肺炎的治療的劑量和時相有一定的指導(dǎo)意義。

但是，模型組臨床表現(xiàn)未出現(xiàn)異常，未出現(xiàn)感染死亡現(xiàn)象;甲強龍1組，于感染后5 d激素使用3 d后體重明顯下降，并有2只出現(xiàn)嚴重消瘦，其中一只在感染后7 d瀕死并予解剖，一只于感染后8 d死亡;激素治療2組，無異常臨床表現(xiàn)，無感染致死的豚鼠。組織臟器中并未分離到活病毒，病毒載量結(jié)果也為陰性，提示病毒的感染較輕，并未直接引起組織病變。

可見，本實驗構(gòu)建的豚鼠感染癥狀較輕，監(jiān)測的指標未見明顯異常，后期的實驗可以考慮加大攻毒劑量，并且增加檢測指標，比如體溫等，并且此次病理檢測多在流感的恢復(fù)期，需增加急性期采樣檢測。本實驗由于是初步探討甲強龍對豚鼠甲流H1N1模型和的干預(yù)作用，所以每組的動物數(shù)量不夠大，后期的實驗可以加大每組動物只數(shù)。另外，可以根據(jù)實驗?zāi)康慕⒅匕Y流感，以及在此基礎(chǔ)上建立繼發(fā)性細菌性肺炎，并評價激素甲強龍在治療中的時相和療效。

表2 豚鼠鼻腔灌洗液的病毒分離(n=5)Tab.1 Virus isolation of nasal wash collected from the guinea pigs

圖2 豚鼠感染后鼻腔灌洗液的病毒定量結(jié)果Fig.2 Real time PCR quatification of the virus in nasal wash collected from infected guinea pigs

［1］ Lowen AC，Mubareka S，Tumpey TM，et al.The guinea pig as a transmission model for human influenza viruses［J］.PNAS，2006，103(26)：9988-9992.

［2］ Matsuoka Y，1 Lamirande EW，Subarao K，et al.The ferret model for influenza［J］.Current Protoc Microbiol，2009，15G.2.1-15G.2.29.

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［4 ］ Munster VJ，de Wit E，van den Brand JMA，et al.Pathogenesis and transmission of swine-origin 2009 A(H1N1)influenza virus in ferrets［J］.Science，2009，325(5939)：481-483.

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［6］ Bao LL，Xu LL，Zhan LJ，et al.Challenge and polymorphism analysis of the novel A(H1N1)influenza virus to normal animals［J］.Virus Res，2010，151(1)：60-65.

［7］ 鮑琳琳，孫惠惠，占玲俊，等.A/California/7/2009與 A/California/4/2009病毒感染力比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(1)：6-9.

Establishment of a Guinea Pig Model of Influenza A(H1N1)Virus Infection and Effect of Methylprednisolone Intervention

ZHAN Ling-jun，BAO Lin-lin，DENG Wei，ZHANG Peng-jun，LV Qi，MA Chun-mei，CAO Bin，QIN Chuan
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.Beijing Chaoyang Hospital，Beijing Institute of Respiratory Medicine，Capital Medical University，Beijing 100020，China)

Objective To establish a guinea pig model of influenza A/California/7/2009(CA7)virus infection and evaluate the intervention with hormone methylprednisolone for viral pneumonia due to this infection.Methods Female Hartley strain guinea pigs(200-300 g)were divided into four groups： control，model，methylprednisolone group 1 and methylprednisolone group 2.The animals were anesthetized by inhalation of ether and inoculated intranasally inoculated with 0.3 mL of virus CA7.Methylprednisolone was administered beginning at postinfection day 3 or 5，recommended dose lasting for 3 days and then quarter of recommended dose for another 3 days.The animals were observed daily for 14 days for clinicalsigns of infection and survival.Results The guinea pig model for A/California/7/2009(CA7)virus infection was established successfully.The lung inflammation of methylprednisolone group 1 was alleviated compared with that of both model group and methylprednisolone group 2，but the survival rate was lower compared with that of both two groups.The lung inflammation of methylprednisolone group 2 was alleviated in comparison with that in the model group but aggravated compared with that of methylprednisolone group 1，while the survival rate was not affected.Conclusion Guinea pigs can be infected with influenza A virus A/California/7/2009，and it is better to administer methylprednisolone on dpi 5 than dpi 3.

Influenza A virus，A(H1N1);Guinea pig，model;Methylprednisolone

R373;R33

A

1671-7856(2011)02-0016-04

2010-09-18

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.04

科技重大專項-艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治：2009ZX10004-402;衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項項目：200802036;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費：DWS200810，國家自然科學(xué)基金重點項目：81030032。

占玲俊，助理研究員，研究方向：病毒的感染與免疫。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：chuanqin@vip.sina.com。