B亞型SHIVSF162p3中國恒河猴小劑量多次陰道黏膜感染

叢 喆，劉 浩，朵建英，王 衛(wèi)，蔣 虹，高 虹，楊志偉，Sylvain Fleury，魏 強，秦 川

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

B亞型SHIVSF162p3中國恒河猴小劑量多次陰道黏膜感染

叢 喆1，劉 浩1，朵建英1，王 衛(wèi)1，蔣 虹1，高 虹1，楊志偉1，Sylvain Fleury2，魏 強1，秦 川1

(1.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

目的 模擬HIV性傳播感染特點進行中國恒河猴陰道黏膜小劑量多次感染研究，為我國艾滋病疫苗有效性評價提供新的模型構建思路。方法 選用20-30TCID50劑量的SHIVSF162p3病毒陰道黏膜途徑感染六只成年雌性中國恒河猴，共感染13次，每次攻毒間隔4～7 d。采取測定血漿病毒載量和外周血CD4+∶CD8+。結果 6只中國恒河猴經13次病毒攻擊后，經檢測均建立系統(tǒng)性感染，血漿病毒載量呈陽性;CD4+∶CD8+均有下降。結論成功建立了中國恒河猴陰道黏膜小劑量多次感染模型，為艾滋病研究提供了新的更接近于自然感染狀態(tài)的模型建立模式。

猴-人免疫缺陷病毒(SHIV);模型，動物;黏膜感染

近年來，我國艾滋病流行趨勢和特點發(fā)生了很大改變。2007年數據顯示，性傳播已經成為最主要的傳播途徑。嚴峻的流行形式和流行特點迫切需要研制出安全有效的艾滋病黏膜疫苗。隨著艾滋病感染機制的深入研究，提倡建立模擬自然感染方式的動物模型進行候選疫苗的安全性、有效性以及免疫策略評價。因此，進行模擬HIV性傳播特點的恒河猴黏膜感染研究顯得非常迫切和重要。本文用致病性SHIVSF162p3按小劑量多次感染的方法經陰道途徑連續(xù)接種中國恒河猴，分析感染模型病毒學、細胞學以及免疫學等方面的變化特點，為今后利用此黏膜模型進行艾滋病早期感染和發(fā)病機制以及疫苗和殺微生物劑有效性評價等研究提供相關實驗數據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

恒河猴 6 只，實驗編號分別為 1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6。購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所(一級動物，合格證編號:SCXK(京)2005-0005)，用商品化膨化飼料飼養(yǎng)。體重4～6 kg。實驗前經體檢無異常，經血清學間接免疫熒光抗體檢查法(IFA)檢查排除猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D型病毒(SRV-1、2、5)和猴 T淋巴細胞性 I型病毒(STLV-1)的感染。猴免疫缺陷病毒(SIV)易感性密切相關的4種基 因 (Mamu-A*01、Mamu-A*02、Mamu-B*08、Mamu-B*17)篩查結果為陰性［1］。

1.2 感染毒株

感染毒株為SHIVSF162p3，由美國 NIH提供，中國恒河猴PBMCs滴定病毒原液 TCID50滴度為1×104TCID50/mL。

1.3 感染方法［2］

將麻醉好的實驗猴放在操作臺上，動物采取俯臥位，后肢抬高，暴露陰道口。用2 mL預冷的無菌PBS清洗陰道。再將稀釋好的適當濃度的病毒液1 mL緩慢推入。實驗猴保持此姿勢30 min。

1.4 感染劑量和SHIVSF162p3感染猴血樣的采集和處理

感染采取小量多次的方法，共感染13次。前6次使用20TCID50的SHIVSF162p3，后7次使用30TCID50的 SHIVSF162p3，間隔 4 ～ 7 d，即分別在 0、7、11、16、20、23、27、31、37、45、50、57 d 和 64 d 進行陰道感染。在每次感染前及13次感染結束后，即71、85、98、114、126、140、154、168、182、203、217 d 及 246 d采EDTA抗凝血3 mL，分別測定外周血 CD4+/CD8+比值及血漿病毒載量。

1.5 SHIVSF162p3感染猴血漿病毒載量的測定［3］

提取EDTA抗凝血漿中病毒 RNA，使用 SYBR green I實時熒光定量 RT-PCR方法測定血漿病毒載量。

1.6 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值及絕對數測定［4］

CD3-PerCP(BD，552851)、CD4-FITC(BD，550628)、CD8-PE(BD，557086)抗體標記 EDTA抗凝全血中淋巴細胞，流式細胞儀(Calibur FACS)測定CD4+/CD8+比值。根據 Facs Calibur測定的CD4+/CD8+比值、血常規(guī)結果，計算出 CD4+細胞絕對數。

2 結果

2.1 SHIVSF162p3感染猴外周血血漿病毒載量

6只實驗猴都先后出現了血漿病毒載量。1-1感染后27 d出現載量，37 d達到高峰(6.498×107copies/mL)，57 d載量檢測陰性消失，但在85 d載量再次出現，直至246 d載量一直都維持在105copies/mL左右。1-2病毒載量出現最早，初次感染后的23 d達到5.665×105copies/mL，27 d達到高峰(2.1×107copies/mL)，隨后下降，至57 d檢測呈陰性，共持續(xù)了4周時間，并且一直到第246 d都持續(xù)陰性。1-3和1-4的載量變化與2號相似，只是載量出現時間稍晚，1-3的載量出現在37 d，高峰期在45 d，也達到了107copies/mL的水平，但只維持了2周的時間;1-4比1-2晚4 d出現載量，出現時載量也已達到105copies/mL的水平，高峰期出現在31d(4.72×106copies/mL)，維持了3周左右的載量。不同的是，它們分別在感染后154 d和203 d出現一過性小幅反彈，載量水平只在103～104copies/mL之間。1-5和1-6的載量出現最晚，均出現在感染后50 d，并且不連續(xù)，沒有明顯的高峰，始終維持在104～106copies/mL的水平(圖1)。

2.2 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+/CD8+比值

圖1 SHIVSF162p3小劑量多次陰道途徑感染恒河猴血漿病毒載量結果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

6只實驗猴的CD4+/CD8+比值在某一段時間內均有一個急劇下降的過程，總體有一個下降的趨勢。1-1在感染后37 d CD4+/CD8+比值迅速從感染后31 d的1.51下降到0.50，并且持續(xù)走低，到300 d時，已降低到0.35。1-2和1-4總體沒有太大的變化，但分別在感染后31 d和37 d有一個下降過程。1-2由27 d的3.89直降到1.55，其后又迅速回升，始終徘徊在3.0附近;1-4由2.72直降到1.69，并維持在這個水平上，只在182 d有一個小幅波動。1-3和1-5變化基本相同，分別在感染后45 d和64 d降到最低，并且出現倒置，其中 1-5甚至降到0.5以下，其后反彈并一直維持在0.8-1.0之間。1-6與1-3、1-5趨勢相同，變化幅度小，沒有出現倒置，始終維持在1.0以上，最低值1.02出現在85 d(圖2)。

圖2 SHIVSF162p3小劑量多次陰道途徑感染恒河猴外周血CD4+/CD8+比值Fig.2 Changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-original rhesus macaques infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

2.3 SHIVSF162p3感染猴外周血CD4+T細胞絕對數

所有實驗猴的CD4+細胞絕對數在感染50 d內都基本保持穩(wěn)定，在1 000個/μL全血上下浮動，隨后均有逐步下降，但下降幅度不大，最低值始終在600以上(具體數據未顯示)。只有1-1下降幅度較大，到感染后274 d時，已降到293個細胞/μL猴血(圖 3)。

圖3 SHIVSF162p3陰道途徑感染恒河猴1-1外周血CD4+T細胞絕對數的變化Fig.3 The CD4+T cell counts(per 1 μL blood)in the Chinese-origin rhesus macaque 1-1 infected IVAG with repeated low dose of SHIVSF162p3

3 討論

流行病學調查顯示，近年來，在世界范圍內性傳播是HIV-1感染的主要原因并且這種傳播趨勢仍呈上升狀態(tài)。因此，陰道途徑感染的恒河猴模型更能符合艾滋病感染的新趨勢并成為當今關注的熱點。在靈長類動物中，緊貼子宮陰道上皮的黏膜固有層中存在大量的郎格漢斯細胞(Langhans cell)，而這種細胞只表達CCR5受體而不表達CXCR4受體。因此，作為單一CCR5受體特異性的SHIVSF162p3病毒的生物學優(yōu)勢顯現出來，成為目前國際上應用比較多的黏膜途徑感染用SHIV病毒。而小劑量多次感染也由于更接近人的自然感染狀態(tài)，成為目前一種比較新穎的攻毒策略。

本研究中我們使用 Cecilia教授提供的SHIVSF162p3，并采用小劑量連續(xù)多次陰道感染的策略，感染6只中國恒河猴，共攻毒13次，前6次劑量為20TCID50，后 7次為 30TCID50，比 Cecilia教授等使用的50TCID50要低一倍左右［5］。第一只動物陽轉是在第6次攻毒后，到13次攻毒結束后，6只實驗猴已全部被感染。所有實驗猴的病毒載量高峰都達到了106copies/mL～107copies/mL，并且病毒載量的峰值和CD4+/CD8+的低值之間是一一對應的，尤其是出現較早的1-1到1-4，這和 Cecilia等人采用小劑量連續(xù)多次陰道感染印度恒河猴的實驗數據是基本相同的，只是載量的峰值略高一個數量級(Cecilia教授感染印度恒河猴的載量高峰在105copies/mL～106copies/mL之間)。并且除1-1以外，其它實驗猴外周血中CD4+T細胞絕對數沒有大的變化，這一點也與Cecilia教授觀察到的結果相同。但1-1出現的持續(xù)的CD4+T細胞絕對數的下降，并且接近200個/μL這一現象還是很值得我們注意。通常情況下我們認為R5嗜性的SHIV并不如CXCR4嗜性的病毒那樣容易引起CD4+T細胞的耗竭［4］，尤其是在中國恒河猴中。1-1出現這樣的現象是何種因素造成的，還需要我們進一步的觀察與分析。

與小劑量多次攻毒所產生的多載量峰值的現象不同，Lily等［6］人采用一次大劑量(103.7TCID50SHIVSF162p3)陰道攻毒后，4只恒河猴病毒載量峰值都達到了106copies/mL～108copies/mL，其中兩只猴病毒載量 set-point值維持在(105～107)copies/mL直至死亡，它們的外周血CD4+T細胞絕對數也出現較明顯的下降。尸檢結果表明兩只恒河猴均死于SAIDS。這個結果從一個側面說明了 SHIVSF162p3具有較強的致病性。

本次研究中，我們沒有使用NIH提供的病毒的TCID50來進行中國恒河猴的SHIVSF162p3的攻毒，而是使用中國恒河猴PBMCs進行了重新滴定。這樣一方面了解了病毒對中國恒河猴PBMCs細胞的感染特性，同時也消除了運輸途中，可能的溫度變化導致病毒毒力的降低。在小劑量攻擊的模型中，由于病毒劑量小，所以滴定的微小誤差可能導致模型的成敗。因此TCID50結果的準確對小劑量攻擊模型來說是至關重要的。

SHIVSF162p3小劑量連續(xù)多次陰道感染模型除了可以較好的模擬HIV-1疾病過程，也很適合進行以包膜為基礎的疫苗效用可行性評估。當然，這并不意味著這一病毒無懈可擊。由于R5-SHIVSF162p3所包含的HIV片段為歐美流行株HIV B亞型片段，而目前中國HIV流行株絕大多數為C亞型［7］，所以這并不完全適合評價針對我國HIV流行特點設計的艾滋病疫苗。但是，通過對R5-SHIVSF162p3的構建和生物學研究，為構建適合評價我國艾滋病疫苗的SHIV病毒提供了借鑒。

［1］劉秀英，叢喆，侯俊，等.中國恒河猴 Mamu-A*01基因篩查及其對抗原肽p11C的特異性CTL反應［J］.中國實驗動物學報，2008，16(2):100－104.

［2］馮育芳，王衛(wèi)，許琰，等.SIVmac251不同途徑感染恒河猴急性期實驗研究［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，17(2):80－83.

［3］叢喆，李兆忠，魏強，等.SYBR Green I實時熒光定量 RTPCR測定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷貝數方法的建立［J］.中國實驗動物學報，2006，14(4):271－275.

［4］王衛(wèi)，劉強，許琰，等.SHIV-KB9感染中國恒河猴有效濃度的確定［J］.中國比較醫(yī)學雜志，2007，17(2):67－71.

［5］Harouse JM， GettieA， Cheng-MayerC， etal. Mucosal transmission and induction of simian AIDS by CCR5-specific simian/human immunodeficiency virus SHIVSF162P3［J］.J Virol，75(4):1990– 1995.

［6］Tsai L，Trunova N，Cheng-Mayer C，et al.Efficient repeated low-dose intravaginal infection with X4 and R5SHIVs in rhesus macaque:Implications for HIV-1 transmission in humans［J］.Virology，2007，362(1):207– 216.

［7］Wu Z，Sun X，Sullivan SG，et al.Public health.HIV testing in China［J］.Science，2006，312(5779):1475-1476.

Efficient Repeated Low-Dose Intravaginal Infection with SHIVSF162p3in Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，LIU Hao1，DUO Jiang-ying1，WANG Wei1，JIANG Hong1，GAO Hong1，YANG Zhi-wei1，Sylvain Fleury2，WEI Qiang1，QIN Chuan1
(1.Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.Mymetics Corporation，CH 1066 Epalinges，Switzerland)

ObjectiveNonhuman primate models are increasingly used in the screening of candidate AIDS vaccines and immunization strategies for advancement to large-scale human trials.The predictive value of such macaque studies is largely dependent upon the fidelity of the model system in mimicking human immunodeficiency virustype 1(HIV-1)infection in terms of viral transmission，replication，and pathogenesis.The aim of this study was to establish a Chineseorigin rhesus monkey model of CCR5-specific chimeric simian/human immunodeficiency virus(SHIVSF162p3)infection，induced by repeated low-dose intravaginal infection，and explore whether this new chimeric model could be more efficient inAIDS vaccine research.MethodsTotally 6 female Chinese-origin rhesus monkeys were enrolled in this study.All animals were intra-vaginally challenged 13 times with 1 mL of a phosphate buffered virus solution containing the heterologous SHIVSF162p3，with 20 TCID50for the first 7 challenges and 30 TCID50for the remaining 6 challenges.Challenges were done every 4-7 days.Whole blood was collected and plasma virus was quantified by real-time SYBR green RT-PCR and T cell subsets were determined by flow cytometry analysis.ResultsSystemtic infection was successfully established in 6 Chinese-origin rhesus macaques after 13 challenges.The peak of viral loads was between 106copies/mL to 108copies/mL，wherease their CD4+/CD8+ratio was decreased.Conclusions The results of this study provide a firm basis for establishing a Chinese rhesus macaques model of SHIV infection by repeated low dose of SHIVSF162p3，a route more close to natural way of AIDS infection.This model would be very useful for HIV-1 subtype B vaccine and pathogenesis studies.

SHIV;Animal model;vaginal transmission;Chinese-origin rhesus monkey

R33

A < class="emphasis_bold"> 【文章編號】1

1671-7856(2011)02-0044-05

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.02.10

國家十一五科技重大專項課題 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金(DWS 201009)。

叢喆，碩士，主管技師，從事實驗動物病毒分子生物學和模型研究工作。

秦川，教授，博士生導師，研究方向:分子病理學，疾病模型。E-mail:Qinchuan@pumc.edu.cn。

2010-10-08