MicroRNA在阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制中的作用

梁春聯(lián)，秦 川

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

阿爾茨海默病（A lzheimer＇s disease，AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的神經(jīng)退行性疾病。主要病理特征為皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT），老年斑沉積（senile plaque，SP）等。

miRNA是一類長約22個核苷酸的內(nèi)源性小分子RNA，由基因組轉(zhuǎn)錄生成。迄今為止，已鑒定的miRNA多達(dá)上千種（miRBase version 13.0，http：// m iRNA.sanger.ac.uk），調(diào)控機(jī)體約90％以上的基因表達(dá)，據(jù)推測，人體組織細(xì)胞內(nèi)的每一個生理過程幾乎均受miRNA的調(diào)控［1］。miRNA調(diào)控紊亂可能是人體多種疾病發(fā)生的潛在因素，其中，m iRNA在神經(jīng)生物學(xué)及神經(jīng)退行性疾病中的作用也日益為研究人員所關(guān)注，本文就m iRNA與神經(jīng)退行性疾病AD發(fā)生的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 miRNA的生物合成

miRNA編碼基因在基因組中有多種存在形式：單拷貝、多拷貝或基因簇等。在哺乳動物體內(nèi)，80％的miRNA位于基因的內(nèi)含子區(qū)，而這些基因大多由RNA聚合酶Ⅱ聚合生成，因此，RNA聚合酶Ⅱ相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控m iRNA的時空特異性表達(dá)模式。此外，還有一些miRNA位于基因間隔區(qū)，其轉(zhuǎn)錄活化由自身的啟動子介導(dǎo)。m iRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成原始轉(zhuǎn)錄本 miRNA（prim iRNA），在細(xì)胞核內(nèi)pri-miRNA經(jīng)屬于RNaseⅢ家族Drosha酶剪切生成長度約70nt核苷酸的發(fā)夾前體m iRNA（pre-miRNA），隨后pre-m iRNA被核轉(zhuǎn)運(yùn)受體exportin-5由細(xì)胞核運(yùn)送至胞漿，后在Dicer酶的作用下，被切割成19～23 bp的成熟的miRNA，成熟的m iRNA同RNA沉默誘導(dǎo)復(fù)合物（RISC）結(jié)合，通過不完全互補(bǔ)配對作用于mRNA的3＇UTR區(qū)，抑制mRNA的翻譯或促使其脫腺苷酸化而加速降解。經(jīng)數(shù)據(jù)庫預(yù)測，一種m iRNA可調(diào)控上百種靶基因的表達(dá)，反之，一種 mRNA也可同時接受若干種miRNA的協(xié)同調(diào)控。此外，miRNA尚可調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及與其前體pre-miRNA剪切相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而在m iRNA與其靶基因之間形成一個反饋調(diào)控機(jī)制，由此可見機(jī)體 miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性［2］。

2 m iRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能

人和嚙齒類動物的腦組織富含miRNA的表達(dá)，相對于其它器官而言，腦組織中表達(dá)的miRNA種類更多，水平也更高。Sempere等［3］通過 Northern雜交發(fā)現(xiàn)了小鼠及人腦中特有的 m iRNA：miR-9，-124a，-124b，-135，-153，-183，-219。小鼠及人腦中富含的7種miRNA：miR-9，-125a，-125b，-128，-132，-137，-139，然而，人和老鼠胎腦的m ir表達(dá)模式可能有所不同。

腦miRNA的表達(dá)受到精細(xì)的調(diào)控，在腦發(fā)育過程中，m iRNA的表達(dá)有一定的時序性。如：Mir-9，-125b，181a在胚胎發(fā)育初期低表達(dá)，隨著發(fā)育過程的演進(jìn)表達(dá)增加，在出生后逐漸減少。此外，腦組織不同類型細(xì)胞有著不同的miRNA表達(dá)譜，如：有些m iRNA（m iR-124，m iR-128）在神經(jīng)元細(xì)胞中優(yōu)勢表達(dá)，有些miRNA（miR-23，miR-26，miR-29）僅在星形膠質(zhì)細(xì)胞中或少突膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)［4］。miRNA在胚胎腦組織發(fā)育中的作用已得到了充分證實，早期即通過Dicer酶缺失突變體證實了m iR-430家族在斑馬魚及小鼠腦組織形態(tài)發(fā)生中起著重要作用［5］。

隨著研究的進(jìn)展，miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中的的作用進(jìn)一步得到了細(xì)化，而對某種特異性miRNA生理功能的深入研究也逐步顯示出miRNA與神經(jīng)退行性疾病的潛在相關(guān)性，如：miR-134可影響樹突棘的形成［6］，m iR-124、m ir-132與軸突的生長有關(guān)［7，8］，而軸突生長不良及突觸結(jié)構(gòu)的喪失均為AD發(fā)生的早期事件。此外，m iRNA還參與細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控［9，10］，而AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元的丟失與細(xì)胞周期紊亂及凋亡水平的增加緊密相關(guān)。另Lukiw［11］等還發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)m ir-146a表達(dá)增加與其體內(nèi)炎癥及應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。由此可見，miRNA可能通過多條途徑影響AD的發(fā)生與發(fā)展。

3 AD患者腦內(nèi)m iRNA表達(dá)譜的改變

早期對miRNA在神經(jīng)退行性疾病中的作用主要是通過缺失Dicer的細(xì)胞或動物模型進(jìn)行的，如：敲除Dicer酶的小鼠海馬樹突棘可發(fā)生與AD相似的變化［12］。然而，敲除 Dicer是一種很粗略的實驗方法，因為其可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)所有miRNA成熟障礙，此外，敲除 Dicer的動物模型所呈現(xiàn)出的表型不僅僅是m iRNA缺失的后果，因為除m iRNA的剪切成熟之外，Dicer還有其它的功能，如：參與小干擾RNA的合成、維持異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等。但這些研究結(jié)果至少表明腦內(nèi)m iRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的一個潛在因素。

鑒于腫瘤發(fā)生中m iRNA表達(dá)譜研究所取得的重大收獲，眾多科研人員也展開了對散發(fā)性AD患者腦內(nèi) miRNA表達(dá)譜的研究。Lukiw等［13］使用DNA芯片及Northern雜交的方法對胚胎、健康成年人及 AD患者腦內(nèi)海馬區(qū)12種腦組織相關(guān)的miRNA的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AD患者腦內(nèi)miR-9，miR-125b，miR-128的表達(dá)升高，而miR-124a的表達(dá)降低。之后，Hebert［14］等對同齡對照及散發(fā)性AD患者大腦顳葉皮質(zhì)區(qū)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示AD患者腦內(nèi)有13種miRNA的表達(dá)顯著降低，經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)在這13種m iRNA中，有 7種具有與 AD相關(guān)的靶基因，即： m ir-15a，29b-1，9，19b與BACE1的3＇UTR有結(jié)合位點(diǎn)；mir-let-7，101，15a.106b與 APP3＇UTR有結(jié)合位點(diǎn)；m ir-9與PS 1的3＇UTR有結(jié)合位點(diǎn)。

對AD患者疾病早期腦及腦脊液中miRNA表達(dá)譜的分析顯示，除已知的作用機(jī)制外，miRNA還可通過一些新的途徑來影響AD的發(fā)生，如：氧化應(yīng)激、胰島素抵抗、天然免疫等。研究發(fā)現(xiàn)［15］，AD患者海馬區(qū) mir-423的表達(dá)上調(diào)，小腦 mir-98的表達(dá)下調(diào)，而這兩種 m iRNA均可調(diào)控異檸檬酸脫氫酶（IDH2）的表達(dá)，IDH2表達(dá)的降低與氧化應(yīng)激的耐受性有關(guān)，這部分說明了腦不同部位對AD病理損傷的易感性（AD的病理損傷主要發(fā)生在海馬、皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)，而小腦相對較輕）。另外，該研究還發(fā)現(xiàn)在AD患者腦脊液中有6種m iRNA呈差異性表達(dá)，這提示miRNA有望成為疾病診斷的一種新的生化標(biāo)記。目前，對患者腦脊液中 Aβ、總tau蛋白及磷酸化tau蛋白等分子的含量的檢測表明其具有高度的可重復(fù)性，然而，miRNA能否同上述指標(biāo)一起作為AD早期診斷的分子標(biāo)記物，尚有待進(jìn)一步的研究。

最近，有研究人員通過芯片對AD患者大腦皮質(zhì)m iRNA及mRNA的表達(dá)譜同時進(jìn)行了檢測［16］。在差異表達(dá)的miRNA及mRNA中，有些miRNA與靶基因 mRNA負(fù)相關(guān)，這些 m iRNA多參與調(diào)控RNA的剪切及翻譯延長。而意外的是有些參與調(diào)控碳水化合物、脂肪酸代謝以及蛋白質(zhì)重構(gòu)的m iRNA的表達(dá)與其靶基因mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)，這與傳統(tǒng)的m iRNA對靶基因的負(fù)調(diào)控作用相悖，然而，結(jié)合細(xì)胞周期阻滯時miRNA可活化靶基因表達(dá)的報道［17］，研究人員推測 m iRNA對靶基因的活化作用可能不僅是促進(jìn)其翻譯，還可能與增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)。這些研究拓展了人們對m iRNA功能的認(rèn)識，說明了在不同的細(xì)胞狀態(tài)和不同生理病理環(huán)境下miRNA可能具有不同的調(diào)節(jié)作用。2010年另有篇文獻(xiàn)報道［18］對早期 AD患者顳葉皮質(zhì)區(qū)灰質(zhì)和白質(zhì)miRNA的表達(dá)譜分別進(jìn)行了檢測，并對差異表達(dá)的m iRNA與AD病理特征-神經(jīng)纖維纏結(jié)及老年斑的相關(guān)性進(jìn)行了對比分析，表明灰質(zhì)區(qū)一系列miRNA（如：mir-15，107及mir-29家族）的下調(diào)與老年斑的數(shù)量緊密相關(guān)，即：灰質(zhì)miRNA的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致AD病理改變的因素之一。

綜上，迄今為止盡管已有多篇文獻(xiàn)報道AD患者腦內(nèi)miRNA表達(dá)譜的改變，然而，其結(jié)果之間缺乏一致性。這歸因于在腦m iRNA表達(dá)譜的分析中，技術(shù)方法的重要性，如：組織標(biāo)本的來源、處理、病理損傷的程度、RNA的分離、芯片檢測技術(shù)及后續(xù)的數(shù)據(jù)分析等。需注意的事項有：①取材部位，腦組織由多種細(xì)胞類型構(gòu)成，而不同細(xì)胞類型中miRNA的表達(dá)譜不同，因此，取材差異會導(dǎo)致標(biāo)本的細(xì)胞成分發(fā)生變化從而影響試驗結(jié)果的可靠性；②標(biāo)本來源，需注意女性患者和男性患者的疾病特征及 miRNA表達(dá)譜均有不同。③操作過程中miRNA的降解也是需要考慮的重要因素。

4 m iRNA調(diào)控AD致病基因的表達(dá)

至今，已有多篇文獻(xiàn)報道 BACE1的表達(dá)受miRNA的調(diào)控。Wang等報道［19］，與同齡對照相比，AD患者腦內(nèi)mir-107的水平顯著降低，此外，他們檢測到在BACE1 mRNA的3＇UTR區(qū)存在有mir-107的結(jié)合位點(diǎn)，在疾病進(jìn)展中，隨著 m ir-107的降低，BACE1蛋白水平呈增高趨勢。同年，Hebert［14］也報道發(fā)現(xiàn)mir-29a，mir-29b-1，mir-9能夠在體外調(diào)節(jié)BACE1的表達(dá)、β內(nèi)分泌酶的活性及Aβ肽的產(chǎn)生。對臨床伴有BACE1蛋白水平異常增高的 AD患者腦內(nèi) mir-29a，mir-29b-1的檢測發(fā)現(xiàn)其表達(dá)顯著降低。值得注意的是上述兩項研究均表明： miRNA的降低并不與腦組織特定區(qū)域的疾病易感性相關(guān)，即：AD患者腦內(nèi)運(yùn)動皮層區(qū)m ir-107的表達(dá)、小腦mir-29a/b的表達(dá)也是減少的，這說明雖然這兩種m iRNA降低可誘發(fā)BACE1高表達(dá)，但其并非導(dǎo)致腦特定區(qū)域?qū)膊∫赘械囊蛩亍oissonneault等［20］通過細(xì)胞試驗證實 mir-298、mir-328也可調(diào)控BACE1的表達(dá)，而AD模型小鼠海馬區(qū)miRNA的檢測結(jié)果顯示mir-298、mir-328的表達(dá)降低，表明其抑制作用的喪失是導(dǎo)致BACE1蛋白表達(dá)增加的因素之一。

除BACE1外，APP也是m iRNA靶向調(diào)控分子之一。據(jù)數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析，APP mRNA3＇UTR區(qū)存在多個miRNA的潛在結(jié)合位點(diǎn)。研究表明［21］m iR-106a，miR-520c可負(fù)向調(diào)控APP的表達(dá)，細(xì)胞水平實驗表明，miR-106a，miR-520c過表達(dá)時可使 APP蛋白水平降低約 50％左右。另有研究報道［22］，miR-106b也可調(diào)節(jié)APP的表達(dá)，同時，該研究人員還發(fā)現(xiàn)AD患者顳葉皮質(zhì)區(qū)m iR-106b的表達(dá)降低可能為AD發(fā)病的誘因之一。最近，有文獻(xiàn)報道［23］mir-101可調(diào)控APP的表達(dá)，原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞試驗表明，m ir-101的表達(dá)與 APP蛋白水平負(fù)相關(guān)，并證實其可能為炎性細(xì)胞因子 IL-1B影響APP蛋白水平的機(jī)制之一。同時，對 AD模型鼠（SAMP8）的研究發(fā)現(xiàn)其 mir-16的表達(dá)顯著降低［24］，體內(nèi)外試驗均表明mir-16高表達(dá)可顯著降低APP的蛋白水平，表明模型鼠體內(nèi) APP的聚集與m ir-16的表達(dá)降低相關(guān)。

值得注意的是，盡管目前對于m iRNA在AD發(fā)病機(jī)制中作用的探討已取得了一定的進(jìn)展，但相關(guān)方面的研究還存在有一定的局限性：1）動物模型在疾病發(fā)病機(jī)制中的研究具有重要的價值，然而鑒于人體功能的特異性及復(fù)雜性，其結(jié)果并不能直接類推到人體內(nèi)。2）每種m iRNA可靶向調(diào)控多種基因的表達(dá)，集中研究針對一種靶基因的作用雖有利于研究工作的進(jìn)行，但這無疑忽視了m iRNA改變后的總體效應(yīng)，即：上百種靶蛋白表達(dá)的改變，而這些改變的靶蛋白如何協(xié)同調(diào)控機(jī)體的功能尚有待進(jìn)一步的研究。3）組織細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)有多種miRNA，這些m iRNA協(xié)調(diào)一致共同發(fā)揮作用，聚焦單一m iRNA的作用就如同針對單一靶蛋白研究一樣，會混淆其生物效應(yīng)的真實性。4）目前研究中多通過轉(zhuǎn)染使細(xì)胞高表達(dá)某種miRNA，繼而研究其功能，然而，人為的高表達(dá)miRNA會使其與細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)的 m iRNA發(fā)生競爭（如：使內(nèi)源性 m iRNA與RISC的結(jié)合幾率降低），導(dǎo)致內(nèi)源性miRNA靶基因的表達(dá)增加。

此外，在研究m iRNA在AD發(fā)病機(jī)制中作用時，還有問題尚需探討：導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)miRNA異常表達(dá)原因是什么?其改變是疾病發(fā)生的誘因還是繼發(fā)事件?研究人員推測其合理的解釋有兩方面：1）隨著機(jī)體的老化及功能狀態(tài)的減退，m iRNA的合成及加工成熟發(fā)生障礙，miRNA表達(dá)水平改變成為疾病的誘發(fā)因素。2）其它始動因素導(dǎo)致疾病的發(fā)生，神經(jīng)元毒性蛋白生成并影響miRNA的表達(dá)，繼而其靶蛋白表達(dá)發(fā)生改變（如：APP、BACE1），而反過來，靶蛋白含量的改變又可進(jìn)一步影響m iRNA的表達(dá)，從而形成惡性循環(huán)促進(jìn)疾病的演進(jìn)及發(fā)展。

Lukiw等［25］通過實驗對這一推論給與了驗證：用硫酸鋁鐵處理原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞ROS的產(chǎn)生。7天后對細(xì)胞中m iRNA進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)生ROS的細(xì)胞中出現(xiàn)一系列表達(dá)上調(diào)的miRNA：miR-9、miR-125、miR-128，而如前所述這些m iRNA在AD腦中表達(dá)上調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)說明氧化應(yīng)激可通過改變miRNA的表達(dá)來影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能和退行性變的發(fā)生。最近，又有文獻(xiàn)報道［26］Aβ肽可影響細(xì)胞及體內(nèi)m iRNA的表達(dá)。將原代培養(yǎng)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng) Aβ肽處理后，檢測其miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)47％的miRNA表達(dá)降低，18％的 miRNA表達(dá)增加，其中，下調(diào)最顯著的m iRNA的表達(dá)（m ir-409-3p、361、20b、181c、148b）可降低4倍左右，而對 APP23模型鼠海馬區(qū)miRNA的檢測也在體內(nèi)證明了這一點(diǎn)。

結(jié)語及展望

隨著研究的進(jìn)行，新的m iRNA不斷的被分離鑒定出來，對已鑒定的m iRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、正常功能及疾病狀態(tài)時表達(dá)模式的研究將具有重要的意義。而鑒于腦組織的多細(xì)胞類型成分及解剖和功能結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜性使得這一工作的開展具有一定的難度，但聯(lián)合使用原位雜交及其它技術(shù)（如免疫組化）來鑒定細(xì)胞類型及組織區(qū)域表達(dá)方式可望為其提供幫助。

鑒于miRNA在AD發(fā)病機(jī)制中作用的逐步揭示，通過寡核苷酸抑制或高表達(dá)miRNA有望成為疾病治療的新途徑，然而，其實際應(yīng)用尚面臨著一定的挑戰(zhàn)：1）一種miRNA可在多大程度上調(diào)控哪些蛋白的表達(dá)有待探討；2）細(xì)胞內(nèi)miRNA自身的表達(dá)調(diào)控及反饋調(diào)控機(jī)制尚不明了；3）如何克服血腦屏障在腦內(nèi)抑制或高表達(dá)miRNA有待新的技術(shù)支持，此外，相關(guān)的生物利用度及毒性也是需要考慮的問題。

基于miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、分化及突觸生成等方面的研究成果，miRNA在AD中的研究價值日益凸顯，篩選與疾病相關(guān)的m iRNA及其靶基因和相應(yīng)的蛋白表達(dá)的改變?nèi)詫⑹窃擃I(lǐng)域的研究焦點(diǎn)。隨著年齡的老化及細(xì)胞分裂的進(jìn)行，機(jī)體m iRNA的合成、代謝及功能也有可能會發(fā)生一系列的變化，而對這一過程的深入了解將有助于其在AD等老年性疾病中作用的探討。此外，基因3＇UTR區(qū)的多態(tài)性也可能與AD患者腦內(nèi)Aβ肽聚集等病理變化相關(guān)，因為 3＇UTR的多態(tài)性有可能會增加或減少miRNA的靶向作用位點(diǎn)，因此，進(jìn)一步鑒定致病基因（如：APP等）3＇UTR區(qū)m iRNA結(jié)合位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性將有望為AD發(fā)病機(jī)制提供新的詮釋。

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