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    小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反應(yīng)

    2011-02-01 09:28:46張麗芳林樹柱向志光喬紅偉
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2011年6期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    袁 偉,董 娜,張麗芳,林樹柱,向志光,喬紅偉,秦 川

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌。隨著多重耐藥菌、極度耐藥株的出現(xiàn),艾滋病與結(jié)核共感染人群的增加使得活動(dòng)性結(jié)核病人日益增多[1]??ń槊纾˙CG)用于預(yù)防結(jié)核病已有80多年的歷史,在世屆衛(wèi)生組織免疫接種擴(kuò)大方案中,卡介苗作為目前唯一的結(jié)核病疫苗正在廣泛使用。它雖然可以極好地預(yù)防幼兒粟粒性結(jié)核和結(jié)核腦膜炎,但不能預(yù)防結(jié)核病的最流行形式——成人肺結(jié)核,因此研究更為有效的 TB新型疫苗對(duì)TB的防治有著重要的意義。隨著MTB基因組測(cè)序的完成和比較基因組學(xué)的研究進(jìn)展,人們通過基因工程技術(shù)改造BCG,或研究亞單位疫苗、基因疫苗、載體活疫苗等新型疫苗,或與BCG聯(lián)合建立組合型疫苗,采用基礎(chǔ)-加強(qiáng)型免疫策略等,以解決BCG的免疫力不足,以及其對(duì)成人保護(hù)性差和缺乏清除潛伏菌等問題。

    有效、特異的保護(hù)性抗原是疫苗成功的一個(gè)重要因素,近年來,隨著基因組學(xué)研究的進(jìn)展,不斷的有新抗原被發(fā)現(xiàn)和鑒定,目前,研究較多的結(jié)核桿菌保護(hù)性抗原有M tb8.4、M tb32、TB10.4、MPT64和38kD蛋白(PstS-1)等,國際上正在進(jìn)行臨床研究的結(jié)核病疫苗采用的抗原主要是 Ag85、ESAT-6和M tb72F等。HspX是一種相對(duì)分子質(zhì)量為16000的小分子熱休克蛋白家族,由基因 hspx(rv2031c)表達(dá),屬于結(jié)核菌休眠期調(diào)控子(DosR regulon)。HspX是結(jié)核分枝桿菌在靜止生長(zhǎng)期或低氧狀態(tài)下產(chǎn)生的主要蛋白,有研究表明HspX在結(jié)核分枝桿菌感染后短時(shí)間內(nèi)減緩其在體內(nèi)生長(zhǎng)速度方面可能起到某種關(guān)鍵作用[2]。本研究選擇了結(jié)核重要的保護(hù)性抗原Ag85B和ESAT-6,以及休眠期細(xì)菌特有的抗原HspX,構(gòu)建了 Ag85B-Esat6-HspX重組質(zhì)粒,并將其免疫BALB/c小鼠,對(duì)其免疫原性了進(jìn)行評(píng)價(jià),進(jìn)而為此疫苗的效力學(xué)評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株、質(zhì)粒及蛋白

    凍干皮內(nèi)注射用卡介苗(BCG)購于成都生物制品研究所。pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX和pcDNAHspX質(zhì)粒由本室構(gòu)建并保存。HspX蛋白由本室純化、保存。

    1.2 主要試劑

    去除內(nèi)毒素(endo free)的質(zhì)粒抽提試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品(德國)。小鼠干擾素γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒為美國 Biolegend公司產(chǎn)品。小鼠預(yù)包被ELISPOT試劑盒為深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    BALB/c小鼠(SPF級(jí))購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2006-0009]。鼠齡6~8周,體重18~22 g,自由飲食進(jìn)食,晝夜節(jié)律12 h。

    1.4 動(dòng)物分組及免疫

    采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只小鼠分為4組,每組10只:生理鹽水組 (NS,100μL);BCG組 (1×106CFU/只);pcDNA-HspX組 (pcDNA-HspX,100μg)、pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX 組 (pcDNA-Ag85BEsat6-HspX,100μg)。

    分別在第0、2、4周用質(zhì)粒DNA一側(cè)股四頭肌肌肉注射免疫動(dòng)物(100μg/只),1×106CFU BCG第0周時(shí)在頸部皮內(nèi)免疫動(dòng)物1次。在免疫的第2、4周和最后一次免疫后2周,各組小鼠剪取鼠尾取血,分離血清,檢測(cè)體液免疫指標(biāo)。動(dòng)物在最后一次免疫后2周處死,無菌分離脾臟淋巴細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞免疫指標(biāo)。

    1.5 ELISA法檢測(cè)血清特異性抗體

    HspX蛋白 100μL/孔(5μg/m L)包被酶標(biāo)板,4℃過夜。1%牛血清白蛋白封閉30 m in,PBST溶液300μL/well洗板5次×3 m in/次。用PBST溶液1∶500稀釋血清樣品后,100μL/well加入酶標(biāo)板,37℃孵育1 h。再次洗板后,加入100μL/well的1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鼠IgG,然后加入100μL/well TMB顯色液,室溫避光反應(yīng)15 min顯色后,加入50μL/well終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng),450 nm處檢測(cè)吸光度(A)值。

    1.6 特異性IFN-γ和IL-2的誘導(dǎo)和測(cè)定

    用含10%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106/m L,800μL/well加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,同時(shí)每孔加入80μL HspX蛋白,置5%CO2孵箱中37℃培養(yǎng)72 h后,收集培養(yǎng)液,5000 rpm離心5 m in,取上清液,-20℃凍存?zhèn)錂z。IFN-γ和IL-2含量的檢測(cè)用ELISA方法,以IFN-γ和IL-2的標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算二者的含量。

    1.7 EL ISPOT法檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)

    IFN-γ的水平與結(jié)核病的保護(hù)性免疫反應(yīng)相關(guān),應(yīng)用ELISPOT方法檢測(cè)免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞針對(duì)特異性抗原分泌IFN-γ的能力。小鼠最后一次免疫2周后無菌分離脾臟,應(yīng)用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞受到 HspX蛋白刺激后 IFN-γ的表達(dá)。ELISPOT板預(yù)先用 IFN-γ抗體包被過夜,無菌摘除脾臟,研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。將終濃度為5×106/m L的淋巴細(xì)胞100μL/well加入96孔ELISPOT板中,并分別給予HspX蛋白(10μg/m L)刺激,并設(shè)陰性對(duì)照,加培養(yǎng)基、不加刺激物;陽性對(duì)照,用 PMA(1 ng/ m L)刺激,共同孵育24 h后,按ELISPOT操作說明依次加入檢測(cè)抗體等試劑,洗板、顯色,計(jì)數(shù)斑點(diǎn)數(shù)。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析,將疫苗免疫組結(jié)果與生理鹽水組進(jìn)行比較。P<0.05表示差異具有顯著性。

    2 結(jié)果

    2.1 質(zhì)粒純度和含量的測(cè)定

    抽提的質(zhì)粒DNA在260 nm處與280 nm處的A值比值均在1.80以上,且經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析,并沒有發(fā)現(xiàn)RNA的污染。

    2.2 免疫小鼠血清抗HspX-IgG的測(cè)定

    圖1 免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特性性抗體水平(*P<0.05)Fig.1 Serological responses against special antigen in immunized mice(*indicates P<0.05)

    用HspX抗原刺激后,ELISA法檢測(cè)總IgG抗體結(jié)果顯示(見圖1),隨著免疫時(shí)間的增加,免疫小鼠的抗體水平持續(xù)增加,DNA免疫小鼠在最后一次免疫后2周的抗體水平最高,融合基因組(即 pAEH組)免疫小鼠血清總IgG OD值均高于其他三組(P<0.05)。同時(shí),單純 HspX質(zhì)粒 DNA免疫組(即pHspX組)與BCG組或生理鹽水組相比,也產(chǎn)生了較高水平的IgG(P<0.05),表明潛伏期抗原能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。

    2.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性 IFN-γ的分泌水平

    BCG及各 DNA疫苗免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)過 HspX抗原刺激后,可以引起特異性IFN-γ的分泌,但NS組小鼠IFN-γ分泌不明顯(圖2)。融合基因組與 BCG組、pHspX免疫組比較,差異有顯著性(P<0.05),表明 pcDNA-Ag85BEsat6-HspX免疫小鼠后產(chǎn)生特異性的 IFN-γ水平最高。

    圖2 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生的IFN-γ水平 (* P<0.05)Fig.2 The level of IFN-γinduced in splenolymphocytes of the immunized m ice.(* indicates P<0.05)

    2.4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IL-2的分泌水平

    融合基因免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞所誘生的IL-2含量也最高,為84.63±8.76 pg/m L,高于 BCG組的 37.65±2.72 pg/m L(P<0.05)和 pHspX免疫組的42.42 ±3.61pg/m L(P<0.05)(圖3)。

    2.5 ELISPOT檢測(cè)結(jié)果

    融合基因組經(jīng) HspX抗原(10μg/m L)體外刺激后分泌IFN-γ顯著升高,與pHspX組或BCG組比較,差異有顯著性(P<0.05);同時(shí),pHspX組經(jīng)HspX抗原(10μg/mL)體外刺激后分泌IFN-γ也明顯升高,與 NS組比較差異有顯著性(P<0.05)。陽性對(duì)照組(PMA刺激)分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)目和水平均較高且一致,陰性對(duì)照組(不刺激)僅見極少量的IFN-γ分泌(圖4)。

    圖3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞誘生的IL-2水平(* P<0.05)Fig.3 The level of IL-2 induced in splenolymphocytesof the immunized mice.(* indicates P<0.05)

    3 討論

    DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗。DNA疫苗不僅可引起體液免疫反應(yīng),而且能誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答,尤其是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng),被認(rèn)為在病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體感染的防治中具有更大的優(yōu)勢(shì)。DNA疫苗僅由DNA(如質(zhì)粒)或RNA(如mRNA)組成,疫苗抗原的編碼基因插入適當(dāng)?shù)恼婧思?xì)胞質(zhì)粒DNA的始動(dòng)子及終止密碼之間,它可在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制,而不能在人類宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。此質(zhì)??捎纱竽c桿菌培養(yǎng)中純化而得到。DNA被肌肉細(xì)胞攝取進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),在此抗原基因被轉(zhuǎn)錄,mRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并被翻譯為蛋白質(zhì),表達(dá)特定的抗原,導(dǎo)致免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

    編碼單一結(jié)核分枝桿菌抗原的DNA疫苗的保護(hù)效應(yīng)一般都不及BCG,提高DNA疫苗效應(yīng)的方法除繼續(xù)篩選更為有效的保護(hù)性抗原以外,還包括多種單一抗原成分的DNA疫苗的聯(lián)合免疫,與分子佐劑如細(xì)胞因子、共刺激分子等聯(lián)合使用以及改進(jìn)免疫接種方式、途徑和程序等。Ag85B和Esat6都是結(jié)核分枝桿菌的早期培養(yǎng)液分泌蛋白中具有較強(qiáng)免疫保護(hù)作用的抗原成分之一,分別含有多個(gè)不同T細(xì)胞的表位,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫。

    抗原85復(fù)合體是一組具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白[3]。最早在結(jié)核桿菌和BCG的生長(zhǎng)期早期培養(yǎng)濾液中發(fā)現(xiàn),在菌體表面也有少量分布。經(jīng)SDS-PAGE和等電聚焦分析可分為3個(gè)組分即Ag85A、B、C,大小分別為31、30、30.5(×103),由3個(gè)不同的基因編碼。其中有免疫作用的主要為Ag85A和B,Ag85A比Ag85B分泌得多,而 Ag85B在細(xì)菌表面分布較多。范雄林等[4]在小鼠模型上將不同結(jié)核保護(hù)性抗原的 DNA疫苗進(jìn)行了免疫原性及保護(hù)效力的比較,發(fā)現(xiàn)Ag85B是比較理想的候選抗原。另外,在感染結(jié)核或麻風(fēng)菌與卡介苗免疫的小鼠及人體上,Ag85復(fù)合體不僅可以刺激產(chǎn)生體液免疫,而且可激發(fā)較強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫,引起CD8+T細(xì)胞增殖和IL-2、GMCSF及IFN-γ等細(xì)胞因子水平的上升。

    EAST6即6KD早期分泌性抗原性蛋白,是從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)濾液(ST-CF)中純化分離出的一種低分子量的分泌性蛋白,具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性。EAST6僅存在于結(jié)核桿菌群及少數(shù)幾種致病性分枝桿菌中,在90%以上的非致病性分枝桿菌中缺乏編碼該蛋白的基因(除勘薩斯分枝桿菌、海水分枝桿菌和蘇加分枝桿菌外),而且在所有BCG中也均缺乏。ESAT6是免疫記憶效應(yīng)性 T細(xì)胞的主要靶抗原之一,可在再次感染的早期,誘導(dǎo)其迅速增值和釋放高水平的 IFN-γ,有效的激活巨噬細(xì)胞來控制結(jié)核病感染[5]。王清民等[6]對(duì)融合泛素的Esat6核酸疫苗進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該 DNA疫苗不僅增強(qiáng)了細(xì)胞免疫反應(yīng),而且對(duì)結(jié)核感染提供了很好保護(hù)。

    隨著人們對(duì)潛伏感染的認(rèn)識(shí),休眠期結(jié)核桿菌開始受到重視。休眠期結(jié)核桿菌為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境部分基因表達(dá)上調(diào)。Leyten EM等[7]用25種 DosR Regulon編碼的休眠期抗原進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與結(jié)核病人相比,健康的結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)陽性者外周血單個(gè)核細(xì)(PBMC)能識(shí)別更多的休眠期抗原,并產(chǎn)生更強(qiáng)烈的IFN-γ反應(yīng)。HspX抗原可以被致敏的T細(xì)胞識(shí)別,刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ,具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性。

    機(jī)體抗TB免疫主要依賴于T細(xì)胞及一些相關(guān)細(xì)胞因子的協(xié)助。對(duì)MTB的細(xì)胞胞免疫應(yīng)答是以T細(xì)胞為介導(dǎo)、以巨噬細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞的免疫反應(yīng)。有效的抗MTB免疫反應(yīng)包括巨噬細(xì)胞吞噬MTB以及處理與遞呈抗原,T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別與結(jié)合以及因受刺激而增殖與分化、細(xì)胞因子釋放、巨噬細(xì)胞激活和殺菌等步驟。IL-2通過T淋巴細(xì)胞增長(zhǎng)因子和激活巨噬細(xì)胞釋放 IFN-γ消滅MTB,而IFN-γ在機(jī)體的抗MTB感染中發(fā)揮著重要作用,它可激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,使其發(fā)揮殺菌作用。IFN-γ主要由TB患者體內(nèi)的 CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞產(chǎn)生[8]。

    本研究將休眠期抗原與生長(zhǎng)早期抗原聯(lián)合使用,成功構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒,并將該重組質(zhì)粒肌肉注射于小鼠,進(jìn)行免疫學(xué)評(píng)價(jià)。一方面,經(jīng)過特異性抗原的刺激后,隨著免疫時(shí)間的延長(zhǎng),免疫小鼠的總IgG抗體水平持續(xù)增加,并于最后一次免疫后2周達(dá)到高峰。并且在第4周和第6周時(shí),DNA疫苗免疫組OD值均高于BCG組,表明融合基因能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)并能保持良好的持久性;另一方面,融合基因免疫小鼠后脾淋巴細(xì)胞誘生的 IFN-γ和 IL-2產(chǎn)量也均高于BCG免疫小鼠,表明該融合基因可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時(shí),誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放IFN-γ的能力通常被用來作為評(píng)價(jià)候選疫苗是否誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究中ELISPOT檢測(cè)結(jié)果表明,應(yīng)用 HspX抗原體外刺激后,融合基因組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ的水平最高,說明該融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。

    總之,Th1型的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)控制MTB的感染起著重要的作用,而且IFN-γ和IL-2都是重要的Th1型細(xì)胞因子,并已被證明在抗MTB的治療中具有一定作用[9]。本研究構(gòu)建的 Ag85B-Esat6-HspX融合基因疫苗,目的就是希望其誘導(dǎo)的免疫向著有利于控制MTB感染的Th1型的應(yīng)答方向發(fā)展,同時(shí)也為今后該疫苗的效力學(xué)評(píng)價(jià)提供一些理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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