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    WIP1對小鼠B細胞及T細胞發(fā)育的影響

    2011-02-01 09:28:44陳陟陽張俊伶馬小茗易微微陳顯達石桂英鞠振宇
    中國比較醫(yī)學雜志 2011年6期
    關鍵詞:小鼠

    陳陟陽,張俊伶,馬小茗,易微微,陳顯達,石桂英,鞠振宇

    (中國醫(yī)學科學院,北京協(xié)和醫(yī)學院,醫(yī)學實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,北京 100021)

    W IP1(wild-type p53-induced phosphatase)是一種核蛋白,為絲氨酸/蘇氨酸特異蛋白磷酸酶2C型家族(serine/threonine specific protein phosphatase type 2C,PP2C)中的一員,由 PPM1D (protein phosphatase magnesium-dependent 1 delta)基因編碼,介導眾多DNA損傷應急信號通路[1]。W IP1表達非常廣泛,通過 RT-PCR證實在小鼠胚胎和成體幾乎各個臟器組織均有 W IP1 mRNA的表達,包括乳腺、子宮、卵巢、腎上腺、皮膚、肝臟和睪丸等組織均檢測到該基因的表達,特別在睪丸中表達量明顯增高。缺失WIP1的小鼠能夠正常生產(chǎn),但是卻顯示出一系列的產(chǎn)后缺陷,主要體現(xiàn)在雄性小鼠發(fā)育不全,生殖器官萎縮,W IP1-/-雄性小鼠的睪丸發(fā)育不全,生育力下降及生命期限縮短。缺失 WIP1小鼠表現(xiàn)出對病原體易感性增強[2]。WIP1基因在許多人類癌癥,特別是乳腺癌中過表達,而敲除PPM1D基因的小鼠能夠抵抗乳腺癌的發(fā)生,暗示W(wǎng) IP1可能是一個致癌基因[3,4]。在 APCmin腸癌小鼠模型中,W IP1基因缺失通過促進小腸干細胞的凋亡,調(diào)控小腸干細胞穩(wěn)態(tài),有效抑制腫瘤生成[5]。在小鼠胸腺發(fā)育中,由于W IP1基因缺失導致 P53的持續(xù)激活,致使T細胞發(fā)育障礙[6]。.在神經(jīng)系統(tǒng)中,WIP1通過P53依賴途徑調(diào)控神經(jīng)干祖細胞的自我更新[7]。此外在對衰老的研究中WIP1基因同樣引起關注,伴隨著衰老的進行W IP1基因的表達降低,導致胰島 β細胞自我更新及增值能力下降[8]。綜合前期結(jié)果提示,W IP1基因參與細胞增殖、凋亡等眾多信號通路,對DNA損傷修復[9]、癌癥的發(fā)生、細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[10]及抗衰老起重要的作用。然而,目前還沒有研究報道過W IP1基因?qū)撬鐱細胞發(fā)育的影響。為了研究W IP1基因是否直接參與調(diào)控成年小鼠B細胞及T細胞的發(fā)育,我們利用基因敲除小鼠及流式細胞術為工具研究W IP1基因?qū)Τ赡晷∈驜細胞及T細胞發(fā)育的影響。

    1 材料和方法

    1.1 PCR方法鑒定W IP1-/-小鼠基因型

    小鼠在出生10 d用剪趾法標記,收集剪下的組織,裂解組織提取基因組DNA,PCR鑒定基因型,反應條件:94℃預變性3 min;變性94℃ 30 s,退火61℃30 s,延伸72℃ 30 s,40個循環(huán);72℃延伸10 min。鑒定 引 物 為 Wip1 WT primer1: 5'-GACAGTCCTGTGCCAAAATGCT-3';Wip1 WT primer2:5'-GGTGACTTGATTGGTGGTGTAGA-3';Wip1 KO primer A: 5'-GCAGGGCTGTTTGTGGTGCT-3';Wip1 KO primer B:5'-GCATGCTCCAGACTGCCTT-3',W IP1 -/-產(chǎn)物長度176 bp,WT產(chǎn)物長度236 bp,PCR試劑購自上海生工生物技術有限公司,中國(圖1)。

    1.2 流式細胞術分析

    1.2.1 骨髓單細胞懸液制備:實驗使用成年3月齡129小鼠,頸椎脫臼犧牲小鼠,取雙腿脛骨、股骨用預冷的PBS沖出骨髓腔的骨髓細胞,吹打成單細胞懸液,過濾、計數(shù),調(diào)整濃度至1×108cell/m L。本實驗使用小鼠均來自北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009-0007,動物使用許可證號:SYXK(京)2005-0001。

    1.2.2 骨髓B細胞及粒細胞染色方案 取10 uL全骨髓細胞懸液置于96孔板一孔中,加入 B220/ PE-cy7(Biolegend)、CD11b/APC-cy7(Biolegend)抗體,冰上避光孵育 30 min,加入 200 uL staining medium(PBS+1%BSA),400 g/m in,離心5 m in,棄上清后用200 uLstaining medium重新懸浮細胞,200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析,每只小鼠收集1 ×105細胞,計算 B220/PE-cy7陽性細胞及CD11b-APC-cy7陽性細胞所占的比例。

    1.2.3 骨髓B細胞發(fā)育染色方案 取10 uL全骨髓細胞懸液至于 96孔板一孔中,加入 IgD/FITC (Biolegend)、CD43/Percp-cy5.5(Biolegend)、B220/ PE-cy7(Biolegend)、IgM/APC(Biolegend)抗體,冰上避光孵育30 min,加入200 uL staining medium(PBS +1%BSA),400 g/m in離心 5 m in,棄上清后用200 uL staining medium重新懸浮細胞,200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析,每只小鼠收集1× 105細胞,計算B220+CD43-IgM-IgD-(Pre-B);B220+CD43-IgM+IgD-(immature-B);B220+CD43-IgM+IgD+(mature-B)細胞所占的比例。

    1.2.4 胸腺單細胞懸液制備 頸椎脫臼犧牲小鼠,完整摘取胸腺,使用兩片載玻片研磨,200目濾網(wǎng)過濾置離心管中,計數(shù)、調(diào)整濃度至 1×108cell/m L。取10 uL細胞懸液置于96孔板一孔中,加入CD8/ FITC、CD45/Percp-cy5.5、CD4/APC-cy7抗體,冰上避光孵育30 min,加入200 uLstaining medium(PBS +1%BSA),400 g/m in離心5 m in,棄上清后用200 uLstaining medium重新懸浮細胞,200目濾網(wǎng)過濾至流式管中準備流式分析,每只小鼠收集1×105細胞,計算 CD45陽性細胞、CD8單陽性細胞、CD4/ CD8雙陽細胞、CD4/CD8雙陰性細胞及 CD4單陽性細胞所占的比例。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 PCR鑒定結(jié)果及 W IP1基因缺失小鼠形態(tài)差異

    圖1 PCR鑒定WIP1基因敲除小鼠的凝膠電泳分析及W IP1缺失小鼠形態(tài)差異圖1A:Marker為DL2000 marker,H20為空白對照,WT為野生型對照,KO為基因敲除對照,HET為雜合對照; 1316/1317/1318/1319為樣品;1B為3月齡W IP1缺失雄性小鼠與同窩野生型對照體型對比Fig.1 PCR genotyping of the W IP1-/-mice and the Morphological alterations in Wip1 nullmales 1A:The marker is the DNA molecular weightmarker;H2O indicates the negative control;WT:wild-type control; KO:WIP1 gene knockout control;HET:heterozygosity control;Lane 1316—1319:stands for DNA samples of W IP1 mice;1B:The smaller animal on the right is W IP1-/-male littermate along with a wild-type male littermate at 3 months of age

    基因型鑒定結(jié)果如圖1A所示。W IP1基因在小鼠全身眾多臟器組織中表達,由于W IP1基因在睪丸中表達最為明顯,因此該基因缺失致使雄性小鼠發(fā)育不全,生育力下降,雄性缺失小鼠在3月齡時體型較同窩野生型對照小鼠明顯變小(如圖1B)。有研究報道W IP1缺失的雄性小鼠生命期限明顯縮短,而W IP1+/-雄性小鼠及W IP1-/-雌性小鼠生命期限較野生型差異不明顯。

    2.2 骨髓中B細胞比例流式分析

    為研究W IP1基因缺失對成年小鼠骨髓B細胞發(fā)育的影響,我們分析了3月齡W IP1-/-小鼠和野生型對照小鼠的骨髓B細胞和M細胞的比例。(如圖2A 2B)。結(jié)果顯示W(wǎng) IP1缺失的小鼠骨髓B細胞比例下降(如圖2C)。而M細胞比例無明顯差異。為了進一步研究B細胞在發(fā)育過程中哪一階段出現(xiàn)問題,我們依據(jù)骨髓B細胞發(fā)育過程中特異性表面標記的表達順序進行了染色(如圖2D 2E 2F 2G),結(jié)果顯示 W IP1基因缺失的骨髓 B細胞各發(fā)育階段比較野生對照均為正常,提示骨髓B細胞比例下降可能是由于Pre-B之前更前體的祖細胞發(fā)育障礙導致。

    2.3 胸腺中T細胞比例流式分析

    為研究W IP1基因?qū)Τ赡晷∈笮叵侔l(fā)育的影響,我們分析了三月齡W IP1-/-及野生型對照小鼠的胸腺形態(tài)差異(如圖3D),發(fā)現(xiàn)WIP1缺失小鼠的胸腺明顯較野生型對照小,進一步對胸腺白細胞表面標記CD45染色發(fā)現(xiàn),W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例明顯較野生型低(如圖3A、3B及3C)。

    為進一步明確胸腺T細胞在發(fā)育階段哪一步出現(xiàn)問題,我們對胸腺細胞進行CD8及CD4染色。結(jié)果顯示,W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4雙陰性細胞比例明顯升高,而CD8/CD4雙陽性比例降低,由CD8/CD4雙陽性細胞進一步分化的CD8單陽性細胞比例升高,而CD4單陽性細胞變化不大。

    3 討論

    圖2 骨髓B細胞比例流式分析2A:野生型小鼠骨髓中B細胞、M細胞比例;2B:WIP1敲除小鼠骨髓中B細胞、M細胞比例;2C:WIP1缺失骨髓B細胞比例與野生型對照比較明顯降低;2D-2E:野生型骨髓B細胞發(fā)育流式圖;2F-2G:WIP1缺失小鼠骨髓B細胞發(fā)育流式圖Fig.2 Flow cytometric analysis of the proportion of B cell in bonemarrow2A:The ratio of B cells and M cells in wild-type mice bone marrow;2B:The ratio of B cells and M cells in WIP1-/-mice bonemarrow;2C:Histogram showing the lower percentage of B cells in W IP1-/-mice than WTmice;2D-2E:FACS plots show the development of B cell in WT bone marrow; 2F-2G:FACS plots show the development of B cell in W IP1-/-bone marrow

    已有的研究表明W IP1蛋白作為一種磷酸酶,參與眾多細胞信號通路調(diào)控,對DNA損傷修復、癌癥的發(fā)生、細胞穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及抗衰老起重要的作用。而鮮有研究W IP1在B細胞T細胞發(fā)育過程中是否起到重要作用。我們對W IP1缺失小鼠的骨髓B細胞及胸腺 T細胞進行流式細胞術分析,發(fā)現(xiàn)WIP1缺失導致骨髓 B細胞比例降低,在胸腺中 T細胞發(fā)育障礙。骨髓和胸腺分別是B細胞和T細胞分化發(fā)育成熟的場所。在成熟小鼠的骨髓中,B細胞所占比例為20~30%左右,而W IP1缺失小鼠的骨髓B細胞僅為10%左右,為了弄清楚B細胞在發(fā)育過程的哪一階段遇到障礙,我們進而依據(jù)B細胞發(fā)育階段所表達的特異性表面標記進行染色,流式分析發(fā)現(xiàn),在Pre-B之后的B細胞發(fā)育各階段細胞比例均正常,從而猜想骨髓中B細胞比例整體降低可能是由于更前體的祖細胞發(fā)育障礙。W IP1缺失小鼠的胸腺中T細胞數(shù)目整體降低,在WIP1敲除小鼠模型中,CD8/CD4雙陰性T細胞比例高于野生型對照小鼠,而CD8/CD4雙陽性細胞比例低于對照組(差異不顯著,但具有統(tǒng)計學差異),與已有報道一致,而CD8單陽性T細胞比例升高,不同于已有報道的CD8單陽T細胞比例降低,此外CD4單陽T細胞比例變化不明顯而非已有報道的CD4單陽T細胞比例降低。

    已有的報道發(fā)現(xiàn)衰老小鼠會產(chǎn)生淋系發(fā)育障礙,同時伴隨著髓系細胞過度增殖[11],這與人類衰老時免疫能力下降及髓系白血病發(fā)病率升高相吻合。我們的研究表明W IP1基因參與調(diào)控B細胞及T細胞的發(fā)育,W IP1基因缺失導致骨髓B細胞及胸腺T細胞比例下降,影響小鼠免疫系統(tǒng)正常發(fā)育,暗示W(wǎng) IP1基因可能直接參與調(diào)控個體衰老。作為重要的衰老相關調(diào)控基因,P53、P38等在衰老過程中發(fā)生明顯變化,端??s短導致的復制性衰老直接引起P53的高表達;在小鼠胰島β細胞中隨著衰老的進行,WIP1表達逐漸下降,同時 P38表達升高[8]。而W IP1做為P38/P53信號通路的負反饋調(diào)節(jié)基因[1],W IP1的缺失直接導致 p38/p53的升高,尤其在放射線照射、衰老等應激條件下,p38/p53持續(xù)的高表達使受損傷的細胞在修復之后無法正常的返回細胞周期,從而走向衰老或凋亡??梢奧 IP1對抗衰老尤其是調(diào)節(jié)免疫衰老具有重要的應用前景,然而W IP1的過表達極易導致癌癥的發(fā)生,因此如何調(diào)控W IP1在衰老進程中的表達仍是限制其臨床應用的重要障礙,對W IP1調(diào)控B細胞T細胞的具體分子機制及調(diào)控免疫衰老的機制仍須進一步研究。

    圖3 胸腺形態(tài)學分析注:3A:野生型小鼠胸腺白細胞比例;3B:W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例;3C:W IP1缺失小鼠胸腺白細胞比例較野生型對照組明顯低;3D:野生型小鼠胸腺與W IP1缺失小鼠胸腺形態(tài)比較Fig.3 Morphological alteration about thymus in W IP1-/-nullmiceNote:3A:The ratio of white blood cells in 3 months old wild-type mice thymus;3B:The ratio of white blood cells in 3 months old W IP1deletion mice thymus;3C:Histogram showing the lower percentage of white blood cells in WIP1-/-mice compare with WTmice;3D:Thesize of W IP1-/-mice thymus is much smaller than WT

    圖4 胸腺T細胞流式分析4A:WIP1缺失小鼠胸腺CD8單陽性T細胞比例較野生型高;4B:W IP1缺失小鼠胸腺CD8/CD4雙陰性T細胞比例較野生型明顯高;4C:WIP1缺失小鼠胸腺CD8CD4雙陽性T細胞比例較野生型低;4D:W IP1缺失小鼠胸腺CD4單陽性T細胞比例與野生型相比無明顯差異;4E:野生型小鼠胸腺T細胞各亞群比例;4F:WIP1缺失小鼠胸腺T細胞亞群比例Fig.4 Flow cytometric analysis of the proportion of T cell in thymus 4A:The ratio of CD8 single positive cells in WIP1 deletion mice is higher than WT;4B: The ratio of CD8/CD4 double negative cells in W IP1 deletion mice is significantly higher than WT;4C:The ratio of CD8/CD4 double positive cells in W IP1 deletion mice is lower than WT;4D:The ratio of CD4 single positive cells do not have different between WIP-/-and WT;4E-4F:FACS plots of different subsets T cells from WT and WIP1-/-m ice thymus

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