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    釀酒酵母Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域的自組裝機(jī)理及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

    2011-02-09 09:31:38印文何進(jìn)喻子牛王階平
    生物工程學(xué)報(bào) 2011年10期
    關(guān)鍵詞:寡聚體構(gòu)象納米線

    印文,何進(jìn),喻子牛,王階平

    華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心,武漢 430070

    釀酒酵母Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域的自組裝機(jī)理及其應(yīng)用的研究進(jìn)展

    印文,何進(jìn),喻子牛,王階平

    華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心,武漢 430070

    Sup35是釀酒酵母的翻譯終止因子,其朊蛋白結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外都能形成淀粉樣蛋白纖維。由于其高度有序的交叉β-片層構(gòu)象與其他物種中的淀粉樣蛋白纖維相似,因此,Sup35的分子自組裝機(jī)理的研究可以作為蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病及朊病毒生物學(xué)等相關(guān)研究的理想模型。而 Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域自組裝成納米線的能力在生物技術(shù)和納米材料等方面已得到廣泛的應(yīng)用。

    Sup35,朊蛋白結(jié)構(gòu)域,自組裝,釀酒酵母

    真菌中的朊蛋白 (Prion) 是一類特殊的蛋白性傳染因子 (Proteinaceus infection particle),它們?cè)隗w內(nèi)外都能形成淀粉樣蛋白纖維。目前,在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中發(fā)現(xiàn)且得到深入研究的朊蛋白有 Ure2p、Sup35p、Rnq1p、Swi1p和New1p[4],這些朊蛋白都能以非孟德爾方式在子細(xì)胞中遺傳與傳播,且對(duì)釀酒酵母的生理活動(dòng)起到表觀遺傳學(xué)的調(diào)控作用[5]。Sup35p是目前研究最為深入的真菌朊蛋白,文中主要就最近幾年有關(guān)Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域的自組裝機(jī)理及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行敘述,而 Sup35朊蛋白的毒性、生理功能、遺傳與傳播等內(nèi)容不在論述范圍內(nèi)。

    1 Sup35的朊蛋白結(jié)構(gòu)域

    Sup35全長(zhǎng)685個(gè)氨基酸,根據(jù)編碼框內(nèi)3個(gè)甲硫氨酸 (Met 1、124和254) 將其分為3部分:氨基端結(jié)構(gòu)域 (N,1-123)、富含帶電荷氨基酸的中部結(jié)構(gòu)域 (M,234-253) 和羧基端結(jié)構(gòu)域 (C,254-685)[6](圖1A,1C)。在Sup35蛋白正確折疊時(shí),其 C結(jié)構(gòu)域可以執(zhí)行翻譯終止因子的功能;但在錯(cuò)誤折疊后,Sup35蛋白聚集成淀粉樣蛋白纖維,其C結(jié)構(gòu)域的功能喪失,由NM結(jié)構(gòu)域決定其朊蛋白行為[6]。

    在Sup35的朊蛋白結(jié)構(gòu)域 (NM) 中,N結(jié)構(gòu)域是其形成朊蛋白的主要區(qū)域,M 結(jié)構(gòu)域可能與Sup35的溶解度及保持其單體狀態(tài)有關(guān)[7]。N結(jié)構(gòu)域富含不帶電荷的極性氨基酸,特別是谷氨酰胺(Gln) 和天冬酰胺 (Asn),包括有部分重疊的聚集(Aggregation) 和傳播 (Propagation) 2個(gè)元件 (圖1B)。聚集元件是Sup35的分子自組裝和形成朊蛋白的關(guān)鍵區(qū)域。其中,7-13的GNNQQNY 7肽是Sup35的分子自組裝的核心片段,該 7肽在體外就具有聚集成淀粉樣蛋白纖維的能力,已被廣泛用于研究朊蛋白的自組裝機(jī)理[8-9]。傳播元件包含5個(gè)重復(fù)序列 R1~R5,片段刪除及點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明,這些重復(fù)序列與Sup35p朊蛋白在子細(xì)胞中的傳播密切相關(guān)[10-11]。例如,R2中的第 1位甘氨酸 (G) 突變?yōu)樘於彼?(D) 后,突變體仍具有聚集能力,但在大多數(shù)菌株中不能有效地傳播[11]。

    2 Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域的自組裝機(jī)理

    2.1 自組裝的基本過程

    研究表明,Sup35p從頭 (de novo) 自組裝的基本過程包括:誘導(dǎo)、聚集、成核和成纖維等步驟,可劃分為速度較慢的遲滯期及隨后的快速組裝期(圖2A)。首先,Sup35的朊蛋白結(jié)構(gòu)域 (NM) 快速從單體 (約占總 NM的 90%) 向寡聚體 (約 10%)轉(zhuǎn)變 (圖2A,step 1);在構(gòu)象可變的寡聚體內(nèi),NM單體逐漸發(fā)生重排 (step 2) 并形成淀粉樣寡聚體的中間體 (step 3);中間體快速轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維構(gòu)象,形成朊蛋白的核 (Seed/nucleus) (step 4);NM單體靠近朊蛋白核并轉(zhuǎn)變構(gòu)象,沿核的長(zhǎng)軸向 2個(gè)方向不斷延伸,從而形成具有交叉 β-片層構(gòu)象的淀粉樣蛋白纖維 (step 5)[12]。

    2.2 單體的寡聚化

    由單體到寡聚體是Sup35形成淀粉樣蛋白纖維的早期限速步驟。天然的NM單體中,N結(jié)構(gòu)域主要以被壓縮的形式存在,而且其構(gòu)象在多種多樣的瞬時(shí)中間體之間快速轉(zhuǎn)變 (時(shí)間為20~300 ns),而M結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象較伸展;當(dāng)只存在N結(jié)構(gòu)域時(shí),它們不經(jīng)過遲滯期而立即組裝成淀粉樣纖維,表明帶電荷的M結(jié)構(gòu)域有利于N結(jié)構(gòu)域維持單體狀態(tài)[7]。

    圖1 Sup35及其朊蛋白結(jié)構(gòu)域的組成[6]Fig. 1 Structure of Sup35 and its prion domain[6].

    圖2 Sup35p朊蛋白結(jié)構(gòu)域的自組裝模型[12-13]Fig. 2 Model of Sup35 prion domain self-assembly[12-13].

    單體的二聚化反應(yīng)起始于 N3殘基之間的接觸[8];隨著寡聚體中單體數(shù)量的增加,即使是從二聚體到三聚體,寡聚體的穩(wěn)定性顯著增強(qiáng);單個(gè)β-片層的穩(wěn)定通過骨架與骨架、側(cè)鏈與側(cè)鏈之間的氫鍵實(shí)現(xiàn);而緊鄰的β-片層之間沒有氫鍵和疏水相互作用,它們通過N2、Q4和N6的側(cè)鏈形成干的極性配位拉鏈 (Dry polar steric zipper) 而將彼此牢牢抓住,這些位點(diǎn)的突變導(dǎo)致寡聚體的穩(wěn)定性喪失[14]。二聚體的平行 β-片層構(gòu)象沒有反平行 β-片層穩(wěn)定,但從二聚體到三聚體、四聚體的過程中,新加入的 β-片層更多的采用平行堆疊方式[15],這與已知的GNNQQNY晶體結(jié)構(gòu)信息相一致[16]。

    2.3 成核與纖維的生長(zhǎng)

    大量的研究表明,Sup35p淀粉樣蛋白纖維的生長(zhǎng)是通過朊蛋白核 (Seed/nucleus) 捕獲單體,經(jīng)構(gòu)象轉(zhuǎn)變后向核的兩端不斷延伸 (圖2B)。朊蛋白核主要有3種來源:從頭組裝而成[17];由Hsp104從成熟的淀粉樣蛋白纖維切割而成的小片段[18];其他淀粉樣蛋白纖維提供的核,即交叉成核(Cross-seeding)[19-21]。成核后的纖維生長(zhǎng)過程存在 2個(gè)限速步驟:可溶性蛋白單體與核結(jié)合,并形成變性劑敏感的中間體;由核介導(dǎo)的單體的構(gòu)象轉(zhuǎn)變而使纖維得到延伸[22]。

    3 Sup35朊蛋白結(jié)構(gòu)域的應(yīng)用

    3.1 Sup35淀粉樣蛋白纖維的功能化

    研究表明,淀粉樣蛋白纖維的直徑通常在10~30 nm (圖3-A),從材料學(xué)的角度它屬于納米線(Nanowire),因而具有納米材料的獨(dú)特屬性[23-27]。將具有特定功能的酶、抗體/抗原、吸附重金屬離子的蛋白及其他功能的蛋白質(zhì)與具有自組裝成納米線能力的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域融合,就可以將這些蛋白質(zhì)高濃度地展示在納米線的表面,從而使納米線功能化,獲得新型的納米材料、傳感器等。

    中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所的張先恩研究小組在Sup35納米線的功能化方面進(jìn)行了大量的富有成效的嘗試[25-27]。他們將Sup351-61片段分別與蛋白G和甲基對(duì)硫磷水解酶 (Methyl-parathion hydrolase,MPH) 融合,通過體外自組裝獲得 MPH對(duì)蛋白 G的比例很高的納米線,建立的鼠疫耶爾森氏菌Yersinia pestis F1抗原檢測(cè)體系的靈敏度提高了100倍[26];隨后,他們?cè)诖嘶A(chǔ)上,通過引入生物素-鏈親和素系統(tǒng),將F1抗原的檢測(cè)靈敏度提高了2 000~4 000倍[27]。他們還將Sup351-61片段與對(duì)pH值敏感的綠色熒光蛋白突變體E2GFP及MPH進(jìn)行融合表達(dá),獲得新型納米線材料 (圖3B),以此材料為基礎(chǔ)的生物傳感器對(duì)甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥的檢測(cè)靈敏度可以提高10 000倍[25]。

    圖3 Sup35自組裝成的納米線 (A) 及其功能化 (B)[24-25]Fig. 3 The nanowire self-assembled by Sup35 and its functionaliztion. (A) Transmission electron micrographs of Sup35 prion fibers[24]. (B) Self-assembly of the nanowire fluorescent biosensor Sup351-61-E2GFP-MPH[25].

    3.2 作為淀粉樣蛋白聚集的研究模型

    在大腸桿菌中,酵母Sup35的NM結(jié)構(gòu)域能形成具有感染性的朊蛋白,而且酵母的另一個(gè)朊蛋白New1能起到在酵母細(xì)胞內(nèi)相同的促進(jìn) Sup35向朊蛋白轉(zhuǎn)變的功能[28]。Li等發(fā)現(xiàn)在果蠅中表達(dá) Sup35的N結(jié)構(gòu)域可以抑制 Poly (Q) 的毒性 (Sup35朊蛋白在酵母中增強(qiáng)其毒性),N結(jié)構(gòu)域中的重復(fù)序列是發(fā)揮抑制作用所必需的,他們的結(jié)果提示,Sup35N可以在多細(xì)胞環(huán)境中以反式作用因子的方式調(diào)節(jié)具有Poly (Q) 結(jié)構(gòu)域的致病性朊蛋白的聚集行為[29]。在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞胞漿中表達(dá)Sup35的NM結(jié)構(gòu)域,它們是以可溶性形式存在,但在培養(yǎng)基中添加在大腸桿菌中形成的Sup35NM纖維后,可溶性Sup35NM就可以聚集成淀粉樣蛋白纖維而具有朊蛋白效應(yīng),而且朊蛋白可以在表達(dá)了 Sup35NM 的神經(jīng)細(xì)胞之間傳播[31]。通過 GPI (Glycosylphosphatidylinisotol) 將 Sup35NM 錨定到神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜可以促進(jìn)朊蛋白在細(xì)胞之間的傳播[30]。由此可見,酵母Sup35已在大腸桿菌、果蠅和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中異源表達(dá),并都能有效地形成淀粉樣蛋白纖維,呈現(xiàn)出朊蛋白效應(yīng),因此,Sup35可以作為研究人類的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病的發(fā)病機(jī)制、朊病毒生物學(xué)等的理想模型[28-31]。

    Sup35形成的朊蛋白還可以用于朊病毒、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病的預(yù)防與治療藥物的篩選和評(píng)價(jià)模型[12,32]。例如,Roberts等發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin-3-gallate,EGCG) 能直接抑制Sup35形成朊蛋白,其活性具有菌株特異性,即有些酵母菌株具有EGCG抗性,但 4,5-4-甲氧基二鄰苯二甲酰亞胺 (4,5-bis-(4-methoxyanilino) phthalimide) 與 EGCG協(xié)同作用后,可以抑制所有菌株中 Sup35朊蛋白的形成,因此這 2種藥物聯(lián)合使用有望應(yīng)用于蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病的預(yù)防與治療[12]。

    3.3 其他應(yīng)用

    Ivanov等將Sup35NM結(jié)構(gòu)域與HIV-1病毒的核心蛋白Gag-p55融合,使原來在釀酒酵母中表達(dá)量極低的Gag-p55獲得了高效表達(dá),獲得的融合蛋白具有熱、堿和變性劑 (SDS) 的抗性,而且Gag-p55具有完全的抗原活性;Sup35融合后有利于不溶性的和不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在釀酒酵母中的異源表達(dá)與純化,他們成功表達(dá)了不溶性的 A型肉毒外毒素的L-鏈[33]。

    蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis在形成芽胞的同時(shí),其具有殺蟲活性的殺蟲晶體蛋白會(huì)組裝成伴胞晶體,但目前伴胞晶體的組裝機(jī)制尚不清楚。本課題組將Sup351-61片段分別與不同大小的殺蟲晶體蛋白融合,主要進(jìn)行兩方面的探索:(1) 在大腸桿菌中表達(dá)并純化,通過Sup35的自組裝,將殺蟲晶體蛋白高濃度地展示在納米線表面后能否提高其殺蟲活性?(2) 在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株中表達(dá)融合蛋白,Sup35的自組裝是否會(huì)干擾伴胞晶體的組裝?這些研究將為蘇云金芽胞桿菌的相關(guān)功能基因的改造及揭示伴胞晶體的組裝機(jī)制提供新的思路,目前已取得了一定的成果 (待發(fā)表)。

    4 展望

    釀酒酵母的翻譯終止因子Sup35的朊蛋白結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)外都能形成淀粉樣蛋白纖維,而且其構(gòu)象與其他物種 (如哺乳動(dòng)物) 淀粉樣蛋白纖維相同,都為高度有序的交叉β-片層構(gòu)象。而阿爾茨海默癥、亨廷頓氏癥、帕金森氏癥及傳染性海綿狀腦病等蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病與體內(nèi)淀粉樣蛋白聚集物的形成密切相關(guān),目前可以運(yùn)用的預(yù)防與治療藥物非常有限[1-2]。研究證實(shí),酵母Sup35異源表達(dá)后都能有效地形成淀粉樣蛋白纖維,因此,Sup35是相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及其藥物篩選與評(píng)價(jià)的理想模型[12,28-33]。

    從材料學(xué)角度看,Sup35形成的淀粉樣蛋白纖維屬于納米線,如果把有關(guān)的功能基因與具有自組裝成納米線能力的朊蛋白結(jié)構(gòu)域融合,就可以將相關(guān)蛋白質(zhì)或酶高濃度地展示在納米線的表面[23]。功能化的納米線將有望在研制新一代電路、新功能材料及臨床檢測(cè)與診斷等生物技術(shù)與納米科技方面得到廣泛應(yīng)用[25-27]。

    終上所述,Sup35分子自組裝機(jī)理的研究在人類蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病及朊病毒生物學(xué)等方面具有重大的理論意義,而且Sup35自組裝成納米線的能力在生物技術(shù)和納米材料等方面有望得到更廣泛的應(yīng)用。

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    Mechanism and application of molecular self-assembly in Sup35 prion domain of Saccharomyces cerevisiae

    Wen Yin, Jin He, Ziniu Yu, and Jieping Wang
    State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, National Engineering Research Center of Microbial Pesticides, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

    Sup35 in its native state is a translation termination factor in Saccharomyces cerevisiae. The prion domain of Sup35p can form amyloid-like proteinaceous fibrils in vitro and in vivo. Furthermore, the in-register cross β-sheet structure of Sup35p amyloid fibrils is similar to those formed in other species. Therefore, studies on mechanism of Sup35p self-assembly can be an appropriate model to study protein misfolding-related diseases and prion biology. Because of its ability to self-assemble into nanowires, the prion domain of Sup35p has been widely used in biotechnology and nanotechnology.

    Sup35, prion domain, self-assembly, Saccharomyces cerevisiae

    淀粉樣蛋白 (Amyloids) 是一類高度有序的蛋白性纖維 (Proteinaceous fibers),廣泛存在于細(xì)菌、真菌和哺乳動(dòng)物。它們的共同特征是:由天然的 α-螺旋和 β-片層混合構(gòu)象轉(zhuǎn)變成交叉 β-片層 (Crossβ-sheet) 構(gòu)象;對(duì)化學(xué)及熱變性、蛋白酶具有極強(qiáng)的抗性;易與剛果紅和硫黃素 T等染料結(jié)合[1]。在哺乳動(dòng)物中,淀粉樣蛋白的形成往往會(huì)引起阿爾茨海 默 癥 (Alzheimer disease)、 亨 廷 頓 氏 癥(Huntington′s disease)、帕金森氏癥 (Parkinson′s disease) 及傳染性海綿狀腦病 (Transmissible spongiform encephalopathies) 等蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊性疾病[1-2]。有些淀粉樣蛋白參與正常的生理功能,在細(xì)菌、真菌、無脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物中都存在功能性淀粉樣蛋白[3]。

    April 7, 2011; Accepted: May 16, 2011

    Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 30930004).

    Jieping Wang. Tel: +86-27-87280670; E-mail: wangjieping2011@163.com

    國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30930004) 資助。

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