海風(fēng)藤對β淀粉樣蛋白寡聚體激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

馬艷 邢華醫(yī) 馬學(xué)強(qiáng) 鄭梅梅 杜怡峰

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）發(fā)病機(jī)制有多種假說，小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎性反應(yīng)在AD形成過程中起重要作用，β淀粉樣蛋白（amyloid beta protein，Aβ）能與特異性受體結(jié)合使小膠質(zhì)細(xì)胞激活、增殖，并分泌釋放大量炎性因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，從而引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素6（IL-6）為 Aβ發(fā)揮毒性作用的重要調(diào)節(jié)因子［1］。本研究采用Aβ寡聚體或（和）海風(fēng)藤提取物對小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并測量小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和IL-6的水平，旨在探討海風(fēng)藤提取物對Aβ寡聚體激活小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器 SPF級新生1～2d的Wistar大鼠（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），Aβ25-35（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院老年病研究所贈送），六氟異丙醇（HFIP），二甲基亞砜（DMSO，購自Sigma公司），PBS緩沖液、大鼠IL-1β和IL-6ELISA試劑盒（購自上海依科賽），海風(fēng)藤提取物（山東大學(xué)藥學(xué)院提供），H-800型電子顯微鏡（日本日立公司，山東師范大學(xué)提供）。

1.2 方法

1.2.1 Aβ25-35寡聚體的制備：將 Aβ25-35利用HFIP溶解成1mg／mL的溶液，于室溫下孵育24 h，然后置生物安全柜中使HFIP完全蒸發(fā)，完成Aβ25-35的單體化，再用DMSO把單體化的Aβ25-35溶解成1mmol／L，然后用PBS緩沖液稀釋成40μmol／L，置4℃孵育48h。同時(shí)設(shè)立空白對照組，只加DMSO和PBS，不加 Aβ25-35。

1.2.2 Aβ寡聚體的鑒定：用透射電鏡觀察制備的寡聚體。取5μL樣本將其吸附到200網(wǎng)的銅網(wǎng)上，在空氣中風(fēng)干后用蒸餾水洗滌1min，用2%（質(zhì)量濃度）磷鎢酸（pH 6.8）溶液染色2min，再用蒸餾水洗滌，風(fēng)干后用透射電鏡觀察，由山東師范大學(xué)電鏡室教授操作，加速電壓為100kV，透射電鏡放大倍數(shù)為8萬～10萬觀察。

1.2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)和分組：將新生的Wistar大鼠于無菌環(huán)境下開顱取腦，剝除腦膜和血管，經(jīng)機(jī)械剪碎、胰酶消化后制備成混合細(xì)胞懸液，在MEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～9d后，水平手搖3～5min分離小膠質(zhì)細(xì)胞，以CD11b（為小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物）鑒定小膠質(zhì)細(xì)胞。將原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為4組，每組設(shè)5個(gè)平行孔：（1）空白對照組：無任何干預(yù)處理；（2）Aβ25-35寡聚體組：給予 Aβ25-35寡聚體干預(yù)，Aβ25-35寡聚體終濃度為10μmol／L；（3）Aβ25-35寡聚體＋海風(fēng)藤提取物組：在Aβ25-35寡聚體組處理的基礎(chǔ)上同時(shí)給予海風(fēng)藤提取物干預(yù)，海風(fēng)藤提取物終濃度為20g／L；（4）Aβ25-35寡聚體＋DMSO 組：在Aβ25-35寡聚體組處理的基礎(chǔ)上同時(shí)給予DMSO干預(yù)，DMSO終濃度為0.5%。48h后，收集上清液，用ELISA試劑盒測上清液中IL-1β和IL-6的水平，按說明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析（ANOVA），均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察 所制備的Aβ寡聚體直徑10～20nm，沒有觀察到纖絲狀物質(zhì)；而空白對照電鏡下觀察的視野為空白（圖1）。

圖1 透射電鏡下觀察Aβ寡聚體的形態(tài)（比例尺為100nm）

2.2 各組IL-1β和IL-6表達(dá)比較 與空白對照組相比，Aβ寡聚體刺激小膠質(zhì)細(xì)胞48h后，其上清液中IL-1β、IL-6的水平明顯增加（P＜0.05），而Aβ寡聚體＋海風(fēng)藤提取物組上清液中IL-1β、IL-6的水平低于Aβ寡聚體組（P＜0.05），Aβ寡聚體＋DMSO組上清液中IL-1β、IL-6水平與 Aβ寡聚體組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

表1 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β水平比較（±s，n＝5，pg／mL）

表1 各組細(xì)胞上清液IL-6、IL-1β水平比較（±s，n＝5，pg／mL）

注：與空白對照組和Aβ寡聚體＋海風(fēng)藤組比較，＊P＜0.05

組 別 IL-6 IL-1β空白對照組110.9±4.62 36.30±1.40 Aβ寡聚體組 181.14±4.46＊ 67.06±1.79＊Aβ寡聚體＋海風(fēng)藤組 170.34±3.47 63.24±2.00 Aβ寡聚體＋DMSO組 184.7±6.06 68.26±1.38 F值315.60 491.02 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

體外制備Aβ寡聚體的方法有多種，所制備的寡聚體在大小、穩(wěn)定性、可重復(fù)性等方面各不相同。本研究參考Stine等［2］和 Andrea等［3］的方法制備Aβ寡聚體。HFIP能破壞β折疊、疏水作用，促進(jìn)α螺旋、無規(guī)則卷曲形成，在制備Aβ寡聚體的過程中，用HFIP處理Aβ的目的是去除凍干粉狀A(yù)β中存在的二級結(jié)構(gòu)，使其形成化學(xué)和結(jié)構(gòu)都一致的Aβ單體。本研究用PBS緩沖液孵育Aβ，使其在生理離子強(qiáng)度和中性pH值條件下生成寡聚體，所制備的寡聚體直徑為10～20nm，未發(fā)現(xiàn)纖絲狀A(yù)β生成；而空白對照組觀察視野中為空白，未發(fā)現(xiàn)球形Aβ寡聚體，排除了DMSO和PBS溶劑中可能存在球形物質(zhì)的干擾。

Aβ寡聚體的神經(jīng)毒性作用之一是能激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起炎性反應(yīng)。Aβ寡聚體可通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）、促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）、Janus激酶／信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK／STAT）等途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而產(chǎn)生炎性反應(yīng)［4－6］，小膠質(zhì)細(xì)胞激活后分泌釋放大量炎性細(xì)胞因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、S-100β、活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和谷氨酸鹽等，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷［1］。Aβ刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β是炎性反應(yīng)的始動環(huán)節(jié)，IL-1能通過刺激β-APP基因的啟動子來上調(diào)神經(jīng)元對β－APP的表達(dá)，因而促進(jìn)老年斑的形成［7］。

本研究初步探討了海風(fēng)藤提取物對Aβ寡聚體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用。結(jié)果顯示Aβ寡聚體能激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子IL-1β和IL-6，提示Aβ在聚集成纖維之前就已經(jīng)具有毒性。Sondag等［8］和Izumi等［9］的研究表明 Aβ能激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，但Aβ的構(gòu)象決定了釋放的細(xì)胞因子的性質(zhì)。

近年來對海風(fēng)藤及其有效成分的藥理作用及機(jī)制進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明海風(fēng)藤具有明顯的抗炎作用，海風(fēng)藤的乙酸乙酯部位、正丁醇部位和揮發(fā)油部位能明顯抑制炎性反應(yīng)［10］。海風(fēng)藤能夠抑制植物凝血素刺激T細(xì)胞增殖，抑制T細(xì)胞的炎性因子如IL-2、IL-4、INF-γ等的 mRNA表達(dá)［4］，并且能夠通過抑制環(huán)氧合酶-1（COX-1）減少前列腺素和白細(xì)胞三烯的生物合成［5］；另外，海風(fēng)藤酮對急性胰腺炎合并肺損傷大鼠炎性反應(yīng)產(chǎn)生的介質(zhì)，如血小板活化因子（PAF）、TNF-α、IL-6也有明顯的抑制作用［6］。龐在英等［11］研究結(jié)果也顯示海風(fēng)藤提取物能明顯改善D-半乳糖腦老化模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究結(jié)果表明，制備海風(fēng)藤提取物時(shí)所用的溶劑DMSO對小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β、IL-6無明顯影響，海風(fēng)藤提取物對 Aβ寡聚體誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的作用來自海風(fēng)藤，而與DMSO無關(guān)；海風(fēng)藤提取物能抑制Aβ寡聚體激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性反應(yīng)因子IL-1β和IL－6。目前海風(fēng)藤抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的有效成分尚未明確，機(jī)制還不是很清楚。

綜上所述，海風(fēng)藤提取物能明顯抑制Aβ寡聚體誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，具有抗炎作用，而Aβ引起的炎性反應(yīng)在AD發(fā)病中具有重要作用，提示海風(fēng)藤提取物在AD的治療中有著重要的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

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