Y-39983在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用研究

謝富華 張姍姍 林哲聰 高聰 熊旭明

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是具有軸突損害的一類脫髓鞘性疾病，實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊 髓 炎 （experment autoimmune encephomeylophy，EAE）為其經(jīng)典的動物模型。中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷后再生困難的主要原因是軸突損傷局部區(qū)域存在相關(guān)生長抑制分子［1］，Rho激酶信號途徑是介導(dǎo)上述相關(guān)抑制分子的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Rho相關(guān)激酶（Rho kinase，ROCK）屬于絲／蘇氨酸蛋白激酶，是Rho的下游靶效應(yīng)分子。肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain，p-MLC）、LIM 激酶（LIM kinase 2，LIMK2）、腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（collapsin response mediator protein-2，CRMP-2）為ROCK較為重要的底物，ROCK被激活后可調(diào)節(jié)p-MLC、LIMK2與 CRMP-2的活性，使肌球蛋白磷酸酶磷酸化，進(jìn)而使肌球蛋白磷酸化程度增高，影響肌動球蛋白系統(tǒng)而導(dǎo)致軸突生長錐的塌陷，抑制軸突生長［2］。Y-39983為ROCKⅡ的選擇性抑制劑，本研究擬通過觀察Rho／ROCK通路在EAE中的作用，探討Y-39983對Rho／ROCK通路的影響及可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組：雌性Lewis大鼠（清潔級）100只，體質(zhì)量150～280g，由中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（粵監(jiān)證號2005A061）；豚鼠10只，體質(zhì)量320～360g，由廣州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，用于制作腦脊髓白質(zhì)抗原。

1.1.2 主要藥品與試劑：不完全福氏佐劑購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；吸附無細(xì)胞白百破聯(lián)合疫苗購自武漢生物制品研究所；卡介苗購自上海生物制品研究所；Y-39983、一抗蛋白脂蛋白（PLP）、髓磷脂堿性蛋白（MBP）、3-環(huán)腺苷酸-3-磷酸二酯酶（CNPase）、p-MLC、CRMP-2及 LIMK2均購自美國Sigma公司。在不完全福氏佐劑中按10∶1比例加入卡介苗混合而成完全福氏佐劑（CFA）。麻醉處死豚鼠，按1g白質(zhì)加1mL PBS的比例，在冰盒中研磨，制成牛乳樣組織勻漿。將該勻漿與等體積CFA充分混勻制成誘導(dǎo)乳劑。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立、治療及平均臨床評分：將大鼠隨機(jī)分為對照組（健康大鼠）、EAE模型組（模型組）及干預(yù)組，每組均30只。模型組及干預(yù)組建立EAE動物模型，對照組為健康大鼠。

EAE模型制作過程：按0.12mL／100g比例給予模型組及干預(yù)組中的每只Lewis鼠雙后足墊皮下注射誘導(dǎo)乳劑，于后足墊背面真皮內(nèi)輔以注射0.2mL吸附無細(xì)胞白百破聯(lián)合疫苗進(jìn)行模型制作。致敏當(dāng)天記為第0天［3］。對照組用生理鹽水代替誘導(dǎo)乳劑。

于模型動物發(fā)病后第1天開始并連續(xù)3d給予干預(yù)組大鼠腹腔注射 Y-39983（20μg／d），模型組同樣于該組動物發(fā)病第1天給予連續(xù)3d腹腔注射生理鹽水（20μg／d）。每天稱體質(zhì)量，觀察動物行為，并每組隨機(jī)抽取6只Lewis大鼠進(jìn)行臨床癥狀評分。

臨床癥狀評分分5級：正常或無任何神經(jīng)缺損癥狀，計(jì)為0分；尾部肌張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙，計(jì)為1分；尾部無力，雙后肢肌張力低，計(jì)為2分；尾部無力，雙后肢癱瘓，但給予刺激后可挪動，記3分；癱瘓累及前肢，伴尿便失禁，計(jì)為4分；瀕死狀態(tài)或死亡，計(jì)為5分。癥狀介于兩標(biāo)準(zhǔn)級之間以±0.5分計(jì)。動物出現(xiàn)臨床癥狀即可認(rèn)為發(fā)病。造模成功的動物進(jìn)入下一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)。造模及干預(yù)過程中2只死亡和3只未發(fā)病大鼠均退出實(shí)驗(yàn)。不足大鼠按相同方法補(bǔ)足。

1.2.2 組織學(xué)觀察：（1）取材：于干預(yù)結(jié)束后第5天，各組隨機(jī)抽取6只大鼠取出腦組織放入4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切片。（2）采用HE染色、搔洛花青髓鞘染色及電鏡觀察（具體步驟參見說明書），在40倍顯微鏡視野下分別觀察各組腦組織中炎性細(xì)胞浸潤程度、髓鞘脫失現(xiàn)象及髓鞘的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.3 APC免疫熒光染色法：（1）取材：于干預(yù)結(jié)束后第5天，各組隨機(jī)抽取6只大鼠采用10%（體積分?jǐn)?shù)）水合氯醛麻醉大鼠后處死，取出腦組織放入4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛中固定、石蠟包埋、切取厚度為2mm的腦組織切片。（2）每組中均選取包含側(cè)腦室旁腦組織區(qū)域的20張切片放入漂洗盒，PBS換洗3次，然后加入過氧化物酶阻斷劑室溫下振蕩孵育30min；PBS換洗3次，加入正常非特異性血清，室溫下振蕩孵育60min；加入一抗APC（1∶125），振蕩后于4℃冰箱中孵育過夜；取出后PBS換洗5次；加入生物素標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫下振蕩孵育45min，PBS換洗3次；加入鏈霉素抗生物素－過氧化物酶溶液，室溫下振蕩孵育30min，PBS換洗3次；最后采用顯微鏡40倍視野下進(jìn)行觀察攝片。觀察各組腦組織中髓鞘的脫失變化情況，APC表達(dá)愈多說明髓鞘脫失愈嚴(yán)重。

1.2.4 采用蛋白免疫印跡（Western blot）法對PLP、MBP及 CNPase、p-MLC、CRMP-2、LIMK2蛋白定量測定：各組于干預(yù)結(jié)束后第5天均隨機(jī)抽取10只大鼠進(jìn)行麻醉后處死并灌注，取大鼠腦組織按照凱基核蛋白和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明書分別提取胞質(zhì)蛋白和胞核蛋白；BCA蛋白定量，配制膠液并灌膠；10%（質(zhì)量濃度）SDS-PAGE電泳分離；轉(zhuǎn)膜，染色并照相，經(jīng)TBST洗滌脫色；封閉2h；TBST洗滌4次；分別加入一抗PLP、MBP及CNPase、CRMP-2（1∶500）、LIMK2（1∶500）及p－MLC（1∶1000）稀釋液振蕩孵育過夜；TBST洗滌洗膜；加HRP標(biāo)記的二抗稀釋液室溫振蕩孵育1.5h；TBST洗膜；用化學(xué)發(fā)光法顯色；將所得譜帶照相并經(jīng)圖像分析軟件分析相應(yīng)譜帶密度值。所測密度值越高，說明各蛋白表達(dá)量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 模型組與干預(yù)組均于免疫后第7～10天開始發(fā)病及免疫后第17～20天出現(xiàn)復(fù)發(fā)。干預(yù)組臨床癥狀明顯改善，其發(fā)病高峰期臨床評分（4.229±1.017）低于模型組（1.076±0.682）（P＜0.05）；模型組發(fā)病高峰期持續(xù)（5.3±1.46）d，干預(yù)組為（3.7±1.35）d，短于模型組（P＜0.05）。干預(yù)組中共有11只出現(xiàn)臨床癥狀復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)率為有37.5%（11／30），低于模型組復(fù)發(fā)率〔46.67%（14／30）〕（P＜0.05）。

2.2 腦組織病理表現(xiàn) HE染色顯示模型組中可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象及血管袖套形成，干預(yù)組中炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減少，血管袖套現(xiàn)象消失；搔洛花青髓鞘染色顯示模型組中髓鞘明顯腫脹及斷裂，干預(yù)組中髓鞘脫失現(xiàn)象減輕；電鏡觀察可見模型組病變散在分布，髓鞘呈松散的層狀結(jié)構(gòu)，有脫失及融合，明暗相間消失，干預(yù)組上述改變均明顯減輕（圖1）。APC免疫熒光染色顯示模型組中APC表達(dá)增多，干預(yù)組中APC表達(dá)較模型組減少（圖2）。對照組上述方法均未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。

圖1 各組腦組織病理表現(xiàn)（×40）

圖2 各組腦組織APC免疫熒光染色比較（×40）

2.3 髓鞘相關(guān)蛋白（PLP、MBP 及 CNPase）及ROCKⅡ底物（p-MLC、CRMP-2及 LIMK2）蛋白含量測定 PLP、MBP及CNPase含量模型組低于對照組，干預(yù)組高于模型組（P＜0.05）。p－MLC、CRMP-2及LIMK2含量模型組明顯高于對照組，干預(yù)組低于模型組（P＜0.05）（表1，圖3）。

表1 各組PLP、MBP、CNPase、CRMP-2、p-MLC及LIMK2密度值比較

圖3 各組腦組織中髓鞘相關(guān)蛋白（PLP、MBP及CNPase）及ROCKⅡ底物（p-MLC、CRMP-2及LIMK2）表達(dá)（Western blot）

3 討論

中樞及外周有髓神經(jīng)纖維的髓鞘部分或全部損害及軸突受損是EAE的典型病理特征［4］。本研究中組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，EAE模型組動物腦組織軸突損害較健康對照組明顯，并伴有較多炎性細(xì)胞浸潤。

Rho相關(guān)激酶分為ROCKⅠ和ROCKⅡ型，其中ROCKⅡ在腦組織中表達(dá)明顯，活化的ROCKⅡ?qū)-MLC的肌動蛋白結(jié)合亞基（MBS）肽鏈的Thr、Ser及Thr855進(jìn)行磷酸化修飾，使p－MLC失活［5］。ROCKⅡ可使 CRMP-2磷酸化，從而阻礙肌動蛋白聚合和解聚過程，最終導(dǎo)致生長錐塌陷、回縮，軸突生長停止［6］。ROCKⅡ也可能通過LIMK2抑制coffilin介導(dǎo)的肌動蛋白解聚和其他一些調(diào)節(jié)蛋白，如肌動蛋白解聚因子（ADF）活性作用于肌動－球蛋白系統(tǒng)，從而阻礙肌動蛋白聚合和解聚過程，最終導(dǎo)致生長錐塌陷、回縮，軸突生長停止［7］。本研究結(jié)果顯示，EAE模型組中的MLCP、CRMP-2及LIMK2含量較健康對照組明顯升高，說明在EAE的發(fā)病過程中，ROCK的激活可通過調(diào)節(jié)上述激酶底物含量從而抑制神經(jīng)軸突的生長，提示Rho／ROCK通路參與了EAE的發(fā)生。

Y-39983是ROCKⅡ選擇性抑制劑，其可通過與Rho激酶催化結(jié)構(gòu)ATP位點(diǎn)結(jié)合而抑制ROCKⅡ激活，同時(shí)還可抑制炎性因子，如腫瘤壞死因子的增殖［8］。本研究采用Y-39983進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Y-39983可以降低EAE模型的發(fā)病率、減輕臨床癥狀及炎性細(xì)胞浸潤程度和髓鞘脫失。同時(shí)，通過蛋白印跡方法檢測結(jié)果顯示Y-39983干預(yù)組中 ROCK 底物蛋白 pMLC、CRMP-2 及LIMK2含量較EAE模型組明顯降低，主要髓鞘相關(guān)蛋白PLP、MBP及CNPase含量較EAE模型組顯著增高，由此可以推測Y-39983可能通過抑制ROCKⅡ激活，使Rho激酶下游通路部分中斷，減少破壞軸突生長的底物蛋白生成，促進(jìn)髓鞘形成及軸突再生的主要作用機(jī)制之一。

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