基于pH的反饋補料方法在谷氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用

邢宇，張麗葉，叢威，岳雷，陳崇安，馬吉銀

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190

3 寧夏伊品生物科技股份有限公司，銀川 750100

谷氨酸發(fā)酵過程中，流加糖工藝必不可少。流加糖工藝成功的關(guān)鍵在于如何確保糖代謝速率與流加糖速率的平衡，它包括菌體耗糖速度、流加量、流加時間、流加次數(shù)、流加濃度等[1]。目前，流加糖工藝主要有恒速流加補料、恒糖濃度流加補料、溶氧控制的脈沖流加補料等。恒速流加補料工藝即在整個發(fā)酵過程中保持補料液流速恒定，此種補料方式下葡萄糖濃度易出現(xiàn)產(chǎn)酸期偏低，發(fā)酵后期偏高的情況；恒糖濃度流加補料工藝則根據(jù)上一時間間隔的耗糖量，預(yù)測下一時段的耗糖量，從而將流速調(diào)至適宜水平，由于葡萄糖濃度需離線測量，且各時段補糖量是以前一時段消耗量為依據(jù)，糖濃度控制存在滯后性；溶氧控制的脈沖流加補料工藝，是根據(jù)溶氧值變化隨時調(diào)整流加速率，溶氧值上升表明糖濃度偏低，應(yīng)增加流加量，使溶氧值保持在合適范圍內(nèi)，同樣存在滯后性[2-3]。目前，在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的是恒定葡萄糖濃度流加補料工藝[4]。

發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸的生物反應(yīng)式為[5]：

菌 體 生 長 階 段 ： 2C6H12O6+NH3+3.5O2→C8H13O4N+4CO2↑+7H2O；

菌 體 產(chǎn) 酸 階 段 ： C6H12O6+NH3+1.5O2→C5H9O4N+CO2↑+3H2O。

可以看出，谷氨酸發(fā)酵過程中糖消耗與氨消耗成一定比例關(guān)系。通過考察發(fā)酵過程中菌體在產(chǎn)酸期糖、氨消耗情況，獲得兩者間比例關(guān)系。據(jù)此以pH反饋信號為控制條件，以一定比例的糖氨混合溶液為補料液，將營養(yǎng)物利用與pH反饋相偶聯(lián)，使得pH反饋系統(tǒng)向發(fā)酵罐中流加氨的同時實現(xiàn)糖的補加[6-8]。在產(chǎn)酸過程中，菌體消耗葡萄糖，生成谷氨酸，導(dǎo)致pH下降，此時pH反饋系統(tǒng)自動補加氨以控制發(fā)酵液pH，由于該工藝以糖氨混合溶液作為補料液，因此在補加氨的同時會補加一定量的葡萄糖以維持葡萄糖濃度的相對穩(wěn)定。菌體產(chǎn)酸旺盛時，氨補加量增加，相應(yīng)的葡萄糖補加增多；而當(dāng)菌體產(chǎn)酸能力下降時，發(fā)酵液pH變化減緩，pH反饋控制系統(tǒng)停止補堿，此時葡萄糖補加過程也同時終止。

本研究結(jié)合谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)菌株，考察基于pH的反饋補料工藝控制糖濃度的適用性，并與恒定葡萄糖濃度補料工藝進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum FM，由寧夏伊品生物科技股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基組成

種子培養(yǎng)基 (g/L)：K2HPO41.5，MgSO40.7，糖蜜1.2，玉米漿25，尿素5，Mn2+、Fe2+0.002，葡萄糖30[9]。于118 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：K2HPO41.5，MgSO40.7，糖蜜10，玉米漿0.6，Mn2+、Fe2+0.002，KCl 0.5，葡萄糖110。于118 ℃滅菌20 min。

1.3 試劑與實驗設(shè)備

K2HPO4、MgSO4購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；KCl購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸錳、硫酸鐵、尿素購于天津凱通化學(xué)試劑有限公司；糖蜜、玉米漿購于寧夏伊品生物工程股份有限公司；葡萄糖購于秦皇島驪驊淀粉股份有限公司)。

10 L-三聯(lián)發(fā)酵罐 (上海國強生化工程裝備有限公司)；YZ1515X蠕動泵 (保定蘭格恒流泵有限公司)；LS-B50L立式壓力蒸汽滅菌鍋 (上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司)；BX41數(shù)碼攝像顯微鏡 (OLYMPUS)；SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學(xué)院生物研究所)；FE-20pH 計(METTLER-TOLEDO)；TDL-5-A離心機 (上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 發(fā)酵過程控制條件

1.4.1 種子培養(yǎng)

按照 1% (V/V) 的接種量將種子接入種子培養(yǎng)基，恒定 pH 6.8，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制相對溶氧＞15%，32 ℃~33 ℃培養(yǎng)5~7 h。

1.4.2 10L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

種子液按10% (V/V) 接種量轉(zhuǎn)入10 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵過程中用22.82 g/100 mL的氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH，發(fā)酵初期，由于菌種對pH較為敏感，pH過高會抑制菌體生長，因此pH設(shè)定較低；菌體經(jīng)對數(shù)生長期后向產(chǎn)酸期轉(zhuǎn)型的過程中，逐步提高pH控制水平，以利于菌體轉(zhuǎn)型；進(jìn)入產(chǎn)酸期，考慮到pH對谷氨酸脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響，將pH逐步降至7.6左右促進(jìn)產(chǎn)酸；發(fā)酵結(jié)束前，為使后續(xù)提取工藝順利進(jìn)行，調(diào)節(jié)pH下降至 7.3左右，具體參數(shù)設(shè)定如表1所示。發(fā)酵過程中溫度采用程序升溫，0~10 h時溫度為 (34±0.02) ℃；10~23 h為(36±0.02) ℃；23 h至發(fā)酵結(jié)束為 (37±0.02) ℃。發(fā)酵液中溶氧水平保持在10%以上，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量控制，罐壓維持在0.05 MPa左右。

表1 谷氨酸發(fā)酵過程中pH控制參數(shù)Table 1 The pH-control in glutamic acid fermetation

1.5 補料方式

1.5.1 恒定葡萄糖濃度補料

當(dāng)菌體濃度達(dá)到一定水平、葡萄糖濃度降至20 g/L左右，開始補料。補料過程中，每間隔 2 h測定一次葡萄糖濃度，根據(jù)發(fā)酵液中葡萄糖濃度的變化情況，計算上一時段葡萄糖消耗速率，并以此為依據(jù)預(yù)測下一時段的需糖量，同時對補料泵轉(zhuǎn)速進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。

1.5.2 pH反饋補料

將恒定葡萄糖濃度補料工藝與 pH反饋控制策略相結(jié)合，實現(xiàn)補料過程中碳源和氮源同時補加。其操作方法是將116 ℃滅菌后的糖液 (680 g/L) 與濃氨水 (22.82 g/100 mL) 按照一定比例混合 (該比例通過恒定葡萄糖濃度補料實驗確定)，混合所得糖氨混合溶液中糖濃度為450 g/L (與工業(yè)生產(chǎn)過程中流加糖濃度相當(dāng))，氨濃度為6.021 g/100 mL。發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)酸階段后，以pH為反饋條件控制糖氨混合液的流加，實現(xiàn)pH控制的同時完成補糖操作。

1.6 離線參數(shù)測定

谷氨酸、乳酸含量通過SBA-40C生物傳感儀分析測定[10]；菌體濃度采用分光光度法在620 nm下測定；還原糖采用菲林法測定[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酸期葡萄糖與氨消耗關(guān)系

考慮到補料方式對谷氨酸轉(zhuǎn)化率的影響，為獲得適用于pH反饋方式下的糖氨混合比，本文采用恒定葡萄糖濃度補料方式進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵。以葡萄糖為碳源、以氨水為無機氮源和pH調(diào)節(jié)劑，計量產(chǎn)酸期氨消耗量和葡萄糖消耗量，并以此為基礎(chǔ)計算兩者之間的比例關(guān)系。三批次谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期補料時段中氨消耗量與葡萄糖消耗量關(guān)系如圖 1所示，實驗獲得糖氨消耗關(guān)系為y=7.4744 x (式中x、y分別表示氨消耗量、葡萄糖消耗量)，R2=0.9989，糖氨消耗比例為7.4744 g糖/g氨，按此比例配制糖氨混合溶液，作為后續(xù)pH反饋補料方式下的補料液。嚴(yán)格意義上，此比例關(guān)系僅適用于該菌種產(chǎn)酸期，不涉及發(fā)酵0~10 h的菌體生長階段。之所以如此，是因為生產(chǎn)之初培養(yǎng)基中的初始糖濃度完全可滿足菌體生長期需求。隨著菌種進(jìn)入產(chǎn)酸期，菌體對糖的需求增加，葡萄糖濃度逐步降低，當(dāng)糖濃度降至一定水平時，需補加葡萄糖以維持菌體正常產(chǎn)酸。目前工業(yè)生產(chǎn)中，糖濃度一般維持在15~20 g/L之間，因此本文的pH反饋補料工藝在糖濃度降到20 g/L時開始進(jìn)行。

圖 1 三批次谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸期氨消耗量與葡萄糖消耗量關(guān)系

Fig. 1 Relationship between the consumption amounts of ammonia and glucose in 3 batches fermentation.

2.2 補料方式對葡萄糖濃度影響

采用恒定葡萄糖濃度補料工藝與 pH反饋補料工藝分別進(jìn)行三批次重復(fù)實驗，對比兩種補料工藝對谷氨酸發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的影響。其中，在控制補料操作開始即發(fā)酵10 h前，保持發(fā)酵過程中溫度、pH、溶氧情況一致。

由于補料開始前，各控制參數(shù)一致，菌體對糖的消耗情況也基本相同，當(dāng)葡萄糖濃度降至20 g/L左右 (發(fā)酵10 h時)，分別采用兩種補料工藝開始補料。如圖 2所示，恒定葡萄糖濃度補料方式下，葡萄糖濃度在5~29 g/L之間波動，補料過程中易出現(xiàn)糖濃度過高或不足的情況，葡萄糖濃度的波動造成發(fā)酵體系的不穩(wěn)定，不利于菌體代謝。相比之下，pH反饋補料方式在補料階段使葡萄糖濃度維持在設(shè)定值附近，穩(wěn)定在12~21 g/L之間。pH反饋補料工藝由于采用糖氨混合溶液作為補料液，其中的碳源、氮源配比恰好滿足菌體維持生長和產(chǎn)酸的需求，使進(jìn)入發(fā)酵體系的碳源、氮源及時被菌體代謝消耗，并可根據(jù)菌體產(chǎn)酸情況對葡萄糖補加量進(jìn)行及時調(diào)節(jié)，從而避免了葡萄糖濃度大幅波動，有效地維持葡萄糖濃度穩(wěn)定。

2.3 補料方式對谷氨酸產(chǎn)酸過程的影響

在葡萄糖濃度穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，考察了兩種補料方式對谷氨酸產(chǎn)酸速率的影響。圖3是谷氨酸濃度的變化。葡萄糖濃度的穩(wěn)定控制使菌體所處發(fā)酵環(huán)境相對穩(wěn)定，減輕了環(huán)境因素對菌體造成的不利影響，從而使菌體產(chǎn)酸能力提升。采用恒定葡萄糖濃度補料進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸期平均產(chǎn)酸速率為4.56 g/(L·h)；而采用pH反饋補料時平均產(chǎn)酸速率為5.36 g/(L·h)，提高了17.5%。

圖2 補料方式對葡萄糖濃度的影響Fig. 2 Effect of glucose-fed methods on glucose concentration. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

圖3 補料方式對谷氨酸濃度的影響Fig. 3 Effect of glucose-fed methods on glutamic acid concentration. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

2.4 補料方式對谷氨酸轉(zhuǎn)化率的影響

pH反饋補料方式下，由于發(fā)酵液中葡萄糖濃度得到有效控制，有利于菌種對葡萄糖的消耗利用，同時因葡萄糖濃度對乳酸生成有一定影響，故以乳酸為主的發(fā)酵副產(chǎn)物濃度下降，提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)化率 (以谷氨酸量為分子，以總加糖量為分母)。如圖 4所示，恒定葡萄糖濃度補料工藝下，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為48.33%；采用pH反饋補料工藝時，葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高到了52.71%。

圖4 補料方式對葡萄糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig. 4 Effect of glucose-fed methods on conversion rate. (A) Constant glucose concentration fed-batch method. (B) pH feedback-controlled substrate feeding method. The first arrow indicates the start of glucose addition and the second arrow stands for the end of glucose feeding.

表2 兩種補料方式下，發(fā)酵結(jié)果比較Table 2 Results of fermentation experiment under two kind of glucose-fed methods

表2是兩種補料方式下，分別進(jìn)行三批次發(fā)酵結(jié)果匯總。通過表 2可以看出，與恒定葡萄糖濃度補料工藝相比，pH反饋控制補料工藝總加糖量相當(dāng)，轉(zhuǎn)化率提升明顯，兩種補料方式下，因補料結(jié)束即停止發(fā)酵，發(fā)酵液殘?zhí)菨舛扰c產(chǎn)酸期糖濃度水平相當(dāng)，其中兩批次 pH反饋補料發(fā)酵在補料結(jié)束后，繼續(xù)流加氨水1 h，因而殘?zhí)菨舛嚷杂邢陆?；其次?pH反饋補料過程中葡萄糖濃度的穩(wěn)定控制使乳酸含量下降；再者pH反饋補料方式使發(fā)酵速率提高，發(fā)酵時間明顯縮短 2 h以上，且菌體產(chǎn)酸情況穩(wěn)定。

3 結(jié)論

采用恒定葡萄糖濃度補料方式獲得谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸階段的糖氨比例，配制糖氨混合液，用于pH反饋補料，能將谷氨酸發(fā)酵過程中葡萄糖濃度控制在相對窄的范圍。

穩(wěn)定的葡萄糖濃度不僅提高了葡萄糖轉(zhuǎn)化率和谷氨酸產(chǎn)酸速率，而且縮短了發(fā)酵周期。恒定葡萄糖濃度補料工藝時，谷氨酸葡萄糖轉(zhuǎn)化率為48.33%，平均產(chǎn)酸速率 4.56 g/(L·h)；而采用本文設(shè)計的pH反饋補料工藝，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到52.71%，平均產(chǎn)酸速率提高至5.36 g/(L·h)，發(fā)酵周期縮短了2 h以上。

pH反饋補料工藝操作簡單，利于工業(yè)應(yīng)用。

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