禁食狀態(tài)下MED1肝臟特異性敲除鼠呈現(xiàn)高脂血癥

白亮，付濤，賈玉枝，Jayme Borensztajn，Janardan K. Reddy，楊公社

1 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院 動物脂肪沉積與肌肉發(fā)育實驗室，楊凌 712100

2 Department of Pathology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, Chicago IL 60611, USA

高脂血癥是血漿中膽固醇和/或甘油三脂代謝異常的一類疾病[1]。近年來，隨著人類生活水平的提高，高脂血癥在全球的發(fā)病率越來越高，進而導(dǎo)致動脈粥樣硬化和心血管疾病等代謝綜合癥的發(fā)生，嚴重威脅人類健康[2-3]。因而，研究其復(fù)雜的病理生物學(xué)過程成為當今科研工作的一個熱點問題。研究表明，許多核受體或轉(zhuǎn)錄因子參與脂質(zhì)代謝的網(wǎng)路調(diào)控[4-5]。其中，過氧化物酶體增殖子激活受體(PPARs) 及其輔激活子MED1是調(diào)控脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子[5-7]。

調(diào)節(jié)子亞單位1 (Mediator subunit 1，MED1)，是利用酵母雙雜交技術(shù)以 Gal4-PPARγ為誘餌從小鼠肝臟 cDNA文庫克隆獲得[8]。研究證實，它可以與許多核受體 (PPARα、PPARγ和RXR等) 以及轉(zhuǎn)錄因子 (p53、GATA和 C/EBPβ等) 結(jié)合，從而在細胞增殖、分化和代謝等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8-12]。MED1周身敲除后，由于胎盤脈管系統(tǒng)發(fā)育不全，小鼠在胚胎期11.5 d死亡[13]。為研究MED1的組織特異性功能，本實驗室建立了MED1肝臟特異性敲除鼠 (MED1?Liv) 模型[14]。研究發(fā)現(xiàn)，MED1在 PPARα和 PPARγ信號通路中起關(guān)鍵作用[14-16]。MED1肝臟缺失可以模擬PPARα敲除，其缺失的肝細胞對PPARα配體誘導(dǎo)的過氧化物增殖無反應(yīng)，也不能表達PPARα的下游調(diào)控基因[14]。在PPARγ誘導(dǎo)下，MED1?/?胚胎成纖維細胞 (MEFs) 不能生成脂肪[16]。而且，MED1肝臟特異性敲除鼠也不能生成脂肪肝[15]。目前，有關(guān)MED1在脂蛋白代謝中的調(diào)控作用尚不清楚。

本研究證實，禁食條件下，MED1肝臟特異性缺失鼠的血漿甘油三酯和膽固醇水平顯著增高，且這種代謝異常是由于血漿極低密度脂蛋白的積聚所致。本研究首次揭示MED1基因特異性敲除與禁食后的血漿極低密度脂蛋白含量變化密切相關(guān)，為高脂血癥的預(yù)防和治療提供了新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

實驗動物：4~5周齡MED1肝臟特異性敲除鼠(MED1?Liv)、對照鼠 (MED1fl/fl)[14]和PPARα周身敲除鼠 (PPARα?/?)[17]。本實驗使用雌性和雄性小鼠，自由飲水，給予脂肪含量為 11.4%的標準鼠糧(Teklad #7904；Harlan-Teklad，印第安納波利斯，印第安納州) 或禁食0、24、48、72 h。根據(jù)國際實驗動物保護協(xié)會規(guī)定，實驗用小鼠被飼養(yǎng)在12 h光照和12 h黑暗的無菌動物房。所有動物處理程序均符合美國西北大學(xué)動物保護協(xié)會的要求。為了測定血漿中甘油三酯和膽固醇的含量以及分離脂蛋白，運用肝素化的毛細管采集血樣，200~300 μL血樣采自小鼠尾部。

1.2 主要試劑

MED1抗體 (編號：sc-5334) 購自 Santa Cruz生物技術(shù)公司。普通Taq DNA聚合酶購于Invitrogen公司。測定甘油三酯和膽固醇的酶試劑盒購自Sigma公司。Superose 6 FPLC 柱子購自 Akta (GE Healthcare)。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取

用剪刀剪一小段小鼠尾巴，放入1.5 mL管中，加入0.5 mL組織裂解液，置于55 ℃水浴鍋中過夜消化。第2天取出，混勻，13 000 r/min離心10 min，將上清移至另一管中，加入600 μL酚∶氯仿∶異戊醇 (25∶24∶1，V/V/V)，在搖床上搖動10 min。13 000 r/min離心10 min，小心將含有DNA的上清移至另一管中，加入1 mL 100%乙醇沉淀DNA，靜置5 min，13 000 r/min離心 10 min。去掉上清，加入1 mL 70%乙醇洗滌，13 000 r/min離心5 min。小心棄掉上清，放置10 min，然后加入100~200 μL蒸餾水，室溫放置2~3 h備用。

1.3.2 PCR鑒定基因型

20 μL PCR反應(yīng)體系：滅菌的雙蒸水15.0 μL、PCR緩沖液2.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.4 μL、25 mmol/L MgCl20.8 μL、基因組DNA 0.8 μL、25 μmol/L上游引物0.4 μL、25 μmol/L下游引物0.4 μL、5 U/μL Taq DNA聚合酶 0.2 μL。引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s，55 ℃30 min，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃10 min。PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 基因型鑒定所用PCR引物Table 1 PCR primers used in genotype identification

1.4 免疫組化

石蠟切片在60 ℃烘箱中烤15 min脫蠟，冷卻后，置于二甲苯20 min，100%乙醇3 min，3.3%過氧化氫 (甲醇配制) 1 h。然后，置于100%乙醇3 min，90%乙醇3 min，80%乙醇3 min，蒸餾水沖洗3次 (3 min/次)，PBS溶液 (0.01%，pH 7.4) 沖洗3次 (3 min/次)。之后，切片用 2%馬血清 (1% BSA配制) 封閉4 h，MED1抗體 (1∶200稀釋) 孵育過夜。第2天，用PBS沖洗，加二抗孵育1 h。此時，準備Vectastain ABC 試劑 (5 mL PBS中各加入1滴A液和B液)。用PBS沖洗，加入ABC試劑孵育1 h。PBS沖洗，然后，用DAB試劑 (2.25 mL蒸餾水，0.25 mL DAB 底物緩沖液，2滴DAB，1滴H2O2)孵育15~30 s。待顯色后，立即將切片放入水中終止反應(yīng)。最后，80%乙醇3 min，90%乙醇3 min，100%乙醇3 min，二甲苯5~10 min；封片。

1.5 實時定量PCR

運用 TRIzol 試劑 (Invitrogen公司) 從小鼠肝臟提取總RNA。用SuperScriptTMIII第一鏈cDNA合成系統(tǒng) (Invitrogen公司) 進行反轉(zhuǎn)錄。ABI 7300 (Applied Biosystem公司) 設(shè)備運行Q-PCR，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，18 S rRNA作為內(nèi)參。實時定量PCR反應(yīng)體系：2× SYBR Green Master Mix 7.5 μL，上、下游引物 (100 pmol) 各0.3 μL (特異性引物序列見表2)，cDNA 2.0 μL，補ddH2O至總體積15 μL。特異PCR產(chǎn)物由溶解曲線來分析，運用相對Ct值方法，即X=2???Ct來測定相對基因表達變化。

表2 Q-PCR特異性引物Table 2 Specific primers for Q-PCR

1.6 蘇木素-伊紅 (H&E) 染色法

取一小塊肝臟組織，經(jīng) 4%多聚甲醛固定 24 h后，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片。按以下方法脫蠟：二甲苯 (I) 5 min，二甲苯 (II) 5 min，二甲苯 (III) 5 min，100%乙醇3 min，95乙醇3 min，80%乙醇3 min，蒸餾水沖洗3 min；蘇木素染色3 min，用流水沖洗2~3 min；鹽酸乙醇分化10 s；自來水沖洗3 min；0.2%氨水返藍10 s，自來水沖洗3 min；伊紅染色30 s，之后進行脫水和透明，即80%乙醇3 min，95%乙醇3 min，100%乙醇 (I) 3 min，100%乙醇 (II) 3 min，二甲苯5 min，封片。

1.7 血漿甘油三酯和膽固醇的測定

為了測定血漿中甘油三酯和膽固醇的含量以及分離脂蛋白，應(yīng)用肝素化的毛細管采集血樣(200~300 μL)，采集自小鼠尾部。2 000 r/min 離心10 min，用剪刀解掉毛細管的下部，上部血清部分用吹吸管吹進1.5 mL管中。然后，取出5 μL至另一管中，加入500 μL生理鹽水，混勻。取100 μL至微量培養(yǎng)板中，用酶試劑盒進行檢測。

1.8 快速蛋白液相色譜 (FPLC) 分析

取7只小鼠的血清等量混在一起，取200 μL，用Superose 6 FPLC柱子分離血漿脂蛋白。柱子用200 mmol/L磷酸鈉 (pH 7.4)，50 mmol/L氯化鈉，0.03%乙二胺四乙酸和 0.02%疊氮鈉以0.4 mL/min的流速洗脫。FPLC洗脫的甘油三酯和膽固醇含量的測定參見1.7。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MED1肝臟特異性敲除鼠的鑒定

MED1基因周身敲除致使胚胎死亡[8]。為研究其組織特異性功能，本實驗室構(gòu)建了MED1肝臟特異性敲除鼠模型。將構(gòu)建好的靶載體導(dǎo)入胚胎干細胞，篩選靶克隆，注入C57BL/6小鼠胚泡產(chǎn)生嵌合體鼠，與C57BL/6雌性鼠雜交，產(chǎn)生的雜合子鼠與EIIaCre鼠雜交，獲得的MED1fl/+鼠再與AlbCre鼠雜交，即可產(chǎn)生8~10號外顯子缺失的MED1?Liv鼠[14]。此后，用MED1fl/fl鼠與MED1?Liv鼠雜交，子代通常一半為MED1fl/fl鼠，一半為MED1?Liv鼠。以子代小鼠尾巴基因組DNA為模板，Cre和loxP為引物，進行PCR擴增，分別得到401 bp (圖1A) 和1.8 kb (圖1B) 的片段。1.8 kb片段代表篩選出的小鼠均帶有2個loxP位點。401 bp片段代表篩選出的小鼠是Cre陽性(+)，MED1基因已被敲除，即MED1?Liv鼠 (圖1A，2、4、5、9和10)。Cre陰性(?) 作為對照組，即MED1fl/fl鼠 (圖1A，1、3、6、7和8)。

圖1 MED1fl/fl和MED1?Liv鼠的基因型鑒定Fig. 1 Identification of MED1fl/fl and MED1?Liv mice. (A) PCR Genotyping of MED1fl/fl and MED1?Liv mice using Cre primer. (B) PCR Genotyping of MED1fl/fl and MED1?Liv mice using loxP primer. (C) Immunohistochemical localization of MED1 in MED1fl/fl mice. (D) Immunohistochemical localization of MED1 in MED1?Liv mice. Arrows in C point to MED1 positive cells. Arrows in D point to an occasional large MED1 positive residual hepatocytes that escaped Cre-mediated excision of MED1 floxed alleles. (E) Q-PCR analysis to confirm the expression of MED1. Total RNA was extracted from two individual of MED1fl/fl or MED1?Liv mice. Data from three independent Q-PCR determinations are expressed as±s.

為了進一步評定 MED1的敲除效率，進行了MED1免疫組織化學(xué)分析。在MED1fl/fl鼠中，MED1定位在肝細胞核中 (圖 1C箭頭所示)。相反，在MED1肝臟特異性敲除鼠中，幾乎沒有MED1陽性染色 (圖 1D)。殘留的極少 MED1陽性大細胞 (圖1D箭頭所示)，可能是由于極少量肝細胞不能有效表達albumin啟動子，從而不能啟動Cre表達。此外，我們還檢測了MED1的表達水平。實時定量PCR分析證實，與MED1fl/fl鼠相比，MED1?Liv鼠中MED1 mRNA表達極低，證明MED1有效敲除 (圖1E)。以上實驗結(jié)果表明，我們成功得到了 MED1?Liv和MED1fl/fl鼠。

2.2 禁食狀態(tài)下 MED1?Liv鼠血漿甘油三酯和膽固醇升高

2.2.1 形態(tài)學(xué)分析

禁食狀態(tài)下，MED1fl/fl鼠肝臟中脂肪酸的氧化能力增強。而PPARα?/?鼠在長期禁食情況下，由于脂肪酸氧化功能的下降會出現(xiàn)嚴重的脂肪肝[18]。所以，我們比較了 PPARα?/?、MED1fl/fl和 MED1?Liv鼠肝臟的形態(tài)變化。長期禁食72 h，PPARα?/?鼠的肝臟變大，顏色發(fā)白，大量脂肪積聚在肝細胞中，呈現(xiàn)脂肪肝 (圖 2A、2D)。相反，MED1fl/fl鼠肝臟顏色紅潤，無脂肪沉積 (圖 2B、2E)。MED1?Liv鼠肝臟形態(tài)與MED1fl/fl鼠的相似，H&E染色顯示其肝細胞中幾乎無脂肪堆積 (圖2C、2F)。

圖2 PPARα?/?、MED1fl/fl和MED1?Liv鼠肝臟的形態(tài)學(xué)變化Fig. 2 Gross and histological change in liver of PPARα?/?, MED1fl/fl and MED1?Liv mice after 72 hours of fasting. (A) Liver photograph of PPARα?/? mouse. (B) Liver photograph of MED1fl/fl mouse. (C) Liver photograph of MED1?Liv mouse. (D) Liver sections stained with H&E from PPARα?/? mouse. (E) Liver sections stained with H&E from MED1fl/fl mouse. F. Liver sections stained with H&E from MED1?Liv mouse.

2.2.2 生物化學(xué)分析

為了測定血漿甘油三酯和膽固醇的含量，對MED1fl/fl和MED1?Liv鼠分別禁食0、24、48、72 h，并尾部采血。分析結(jié)果顯示，正常狀態(tài)下，MED1fl/fl和 MED1?Liv鼠血漿甘油三酯和膽固醇水平無明顯差異。但是，禁食24、48、72 h后，與MED1fl/fl鼠相比，MED1?Liv鼠血漿中甘油三酯顯著上升 (圖3A)。禁食48、72 h后，MED1?Liv鼠血漿膽固醇含量也明顯上升 (圖3B)。

圖3 MED1?Liv鼠血漿甘油三酯和膽固醇顯著升高Fig. 3 Level of plasma triglyceride and cholesterol remarkably elevated in MED1?Liv mouse after time-course fasting. (A) Level of triglyceride in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse after 0, 24, 48, and 72 hours of fasting. (B) Level of cholesterol in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse after 0, 24, 48, and 72 hours of fasting (n=7; *P<0.05; **P<0.01).

2.3 小鼠肝臟特異性缺失MED1導(dǎo)致極低密度脂蛋白積聚

為了進一步探討高血脂和高膽固醇是由于哪部分脂蛋白代謝異常引起，分別將正常和禁食狀態(tài)的血清 (n=7) 匯聚到一起，進行快速蛋白液相色譜分析。正常飼喂下，MED1fl/fl和MED1?Liv鼠表現(xiàn)出相似的脂蛋白峰，富含甘油三酯 45%~65%的脂蛋白主要是極低密度脂蛋白峰 (圖4A)，富含膽固醇45%~50%的脂蛋白主要是低密度脂蛋白峰 (圖5A)。然而，禁食24 h，MED1fl/fl和MED1?Liv鼠血漿富含甘油三酯的極低密度脂蛋白峰表現(xiàn)出顯著的差異。與 MED1fl/fl鼠相比，MED1?Liv鼠甘油三酯-極低密度脂蛋白峰明顯升高 (圖 4B)。禁食 24 h，MED1fl/fl和MED1?Liv鼠血漿富含膽固醇的低密度脂蛋白峰都升高。而且，富含膽固醇8%~12%的極低密度脂蛋白峰表現(xiàn)出顯著的差異。與MED1fl/fl鼠相比，MED1?Liv鼠膽固醇-極低密度脂蛋白峰異常升高(圖 5B)。該研究結(jié)果表明，禁食情況下，MED1?Liv鼠極低密度脂蛋白的積聚導(dǎo)致血脂和膽固醇的代謝異常，進而引起高脂血癥 (圖6)，提示MED1基因可能調(diào)控極低密度脂蛋白。

圖4 MED1?Liv鼠血漿甘油三酯-極低密度脂蛋白積聚Fig. 4 Deficiency of hepatic MED1 causes accumulation of triglyceride associated VLDL. Lipoproteins were separated from 200 μL of pooled mouse plasma samples (n=7 for each genotype) by FPLC. (A) the concentration of triglyceride in each eluted fraction is indicated on the y axis in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse under normal condition. (B) the concentration of triglyceride in each eluted fraction is indicated on the y axis in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse in response to 24 hours of fasting.

圖5 MED1?Liv 鼠血漿膽固醇-極低密度脂蛋白積聚Fig. 5 Deficiency of hepatic MED1 causes accumulation of cholesterol associated VLDL. Lipoproteins were separated from 200 μL of pooled mouse plasma samples (n=7 for each genotype) by FPLC. (A) the concentration of cholesterol in each eluted fraction is indicated on the y axis in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse under normal condition. (B) the concentration of cholesterol in each eluted fraction is indicated on the y axis in MED1fl/fl and MED1?Liv mouse in response to 24 hours of fasting.

圖6 禁食狀態(tài)下MED1?Liv鼠發(fā)生高脂血癥的模型圖Fig. 6 Model to illustrate the regulatory role of MED1 in hyperlipidemia under fasting. During fasting, triglycerides stored in adipose tissue are hydrolyzed to free fatty acids and mobilized into plasma to reach liver. Triglyceride and cholesterol are assembled into VLDL particles for secretion into blood. Triglyceride and cholesterol associated with VLDL are significantly elevated in hepatic deficient MED1 mice. Thus, hyperlipidemia is taken place in MED1?Liv mice. However, reasons for accumulation of VLDL are still unclear.

3 討論

高級動物在自由采食狀態(tài)下，一般是消耗碳水化合物以產(chǎn)生 ATP，多余的能量轉(zhuǎn)化為脂肪酸，以甘油三酯的形式儲存在脂肪組織。而在禁食狀態(tài)下，機體分解脂肪組織中的甘油三酯，產(chǎn)生大量的游離脂肪酸通過血液循環(huán)進入肝臟，代謝產(chǎn)生酮體，作為其他組織的能源[18-20]。脂肪酸氧化代謝由線粒體β氧化、過氧化物酶體β氧化和微粒體ω氧化系統(tǒng)來完成[21-22]，氧化代謝關(guān)鍵酶主要受PPARα調(diào)控[18,23]。以往研究表明，長期禁食狀態(tài)下，PPARα?/?鼠呈現(xiàn)嚴重的脂肪肝[18]。本研究中，PPARα?/?鼠作為陽性對照，禁食72 h，肝臟出現(xiàn)脂肪變性[18,23]。但是，作為 PPARα輔激活因子的MED1[8,14]，其肝臟特異性敲除鼠幾乎沒有脂肪積聚，提示禁食狀態(tài)下，MED1缺失，小鼠肝臟脂肪酸氧化能力下降，多余的脂肪酸合成甘油三酯和膽固醇，以極低密度脂蛋白形式進入血液循環(huán)，影響血漿脂蛋白的清除。此外，MED1在小鼠脂肪肝的形成中也發(fā)揮重要作用。高脂日糧和 PPARγ誘導(dǎo)下，MED1?Liv鼠不能形成脂肪肝，且不能表達脂肪生成的標志基因[15]。因而，我們初步推測，禁食狀態(tài)下，MED1調(diào)控肝臟脂肪代謝可能是通過PPARα和PPARγ通路共同發(fā)揮作用的。

血漿脂蛋白在脂質(zhì)運輸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要分為 5大類：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白 (IDL)、低密度脂蛋白(LDL) 和高密度脂蛋白 (HDL)[24]。肝臟中合成的大量甘油三酯由極低密度脂蛋白攜帶進入血液中。如果脂蛋白酶活性低下，不能充分利用血漿脂蛋白中的甘油三酯，就可導(dǎo)致高脂血癥[25]。ob/ob鼠中，肝臟特異性敲PPARγ后，禁食24 h，血漿中甘油三酯和膽固醇顯著升高，并且極低密度脂蛋白積聚[26]。與此研究相似，本研究發(fā)現(xiàn)與 MED1fl/fl鼠相比，MED1?Liv鼠極低密度脂蛋白高度積聚，導(dǎo)致血漿甘油三酯和膽固醇水平顯著增加，出現(xiàn)高脂血癥 (圖6)。血漿中極低密度脂蛋白的積聚表明，MED1肝臟特異性敲除鼠失去清除富含甘油三酯的脂蛋白的能力。因此我們推測肝臟MED1的缺失可能間接導(dǎo)致脂蛋白酯酶 (LPL) 的活性降低。

本研究結(jié)果提示，MED1在富含甘油三酯的脂蛋白代謝中具有重要的調(diào)控作用。而且，根據(jù)他人和本實驗室的研究結(jié)果，我們推測MED1?Liv鼠極低密度脂蛋白積聚的原因可能有以下幾點：1) 禁食狀態(tài)下，脂肪組織發(fā)生脂肪分解，游離脂肪酸流入肝臟，MED1 肝臟特異性缺失后不能有效啟動脂肪酸氧化系統(tǒng)，進而使肝臟中富含甘油三酯的極低密度脂蛋白包裝和合成增加，大量進入血液，導(dǎo)致極低密度脂蛋白積聚。2) MED1缺失，導(dǎo)致脂蛋白酯酶活性下降，從而不能有效清除富含甘油三酯的脂蛋白，引起極低密度脂蛋白積聚。3) MED1缺失狀態(tài)下，以上兩種情況同時存在，即進入血液的極低密度脂蛋白增加，同時多余的極低密度脂蛋白不能有效清除，從而導(dǎo)致其大量積聚。有關(guān)MED1肝臟特異性敲除鼠中甘油三酯和膽固醇的升高以及極低密度脂蛋白積聚的原因等分子機制尚不清楚，有待于進一步研究和探討。

綜上所述，本研究首次證實了MED1肝臟特異性敲除鼠血脂升高是由于極低密度脂蛋白的積聚，提示MED1在脂蛋白代謝中具有重要的調(diào)控作用，為高血癥的發(fā)生發(fā)展及防治提供了一個新的調(diào)控機制和靶點。

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