基因克隆常用的方法及其在甜菜上的應(yīng)用

吳則東，王華忠

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

基因克隆常用的方法及其在甜菜上的應(yīng)用

吳則東1，2，3，王華忠1，2，3

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

介紹了植物不同的基因克隆方法，并對基因克隆在甜菜上的應(yīng)用及未來展望作概述。

甜菜；基因克隆；方法；應(yīng)用

一般來說，基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為基因的無性繁殖、重組DNA、分子克隆、基因操作技術(shù)以及基因工程等。其目標(biāo)是識別和分離特異基因并獲得基因完整序列，確定其在染色體上的相對位置，闡明基因的生化功能，并利用生物技術(shù)手段應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中去。目前，在油菜、玉米、水稻、煙草、擬南芥、番茄等多種植物中，已經(jīng)克隆了許許多多與植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性及農(nóng)藝性狀等相關(guān)的基因。

從遺傳學(xué)觀點(diǎn)來看，基因克隆有兩條途徑：正向遺傳學(xué)途徑和反向遺傳學(xué)途徑。正向遺傳學(xué)是以研究突變表型來確定突變基因的傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法；反向遺傳學(xué)途徑則通過有目的的對基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，以確認(rèn)這些改變對于表型的影響。由于在多數(shù)情況下，我們并不清楚基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能，很難通過正向遺傳學(xué)途徑克隆基因，而反向遺傳學(xué)途徑則顯示了較好的前景[1]。反向遺傳學(xué)中的3種主要的方法是轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法、T-DNA標(biāo)簽法以及圖位克隆法。近年來生物信息學(xué)的快速發(fā)展又促進(jìn)了電子克隆的產(chǎn)生，生物信息學(xué)是以核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子數(shù)據(jù)為主要對象，以數(shù)學(xué)、信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)為主要手段，以計(jì)算機(jī)硬件、軟件和計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)為主要工具，對已知的許多生物學(xué)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行搜集、整理以及分析，確定數(shù)據(jù)所含的生物學(xué)意義，研究重點(diǎn)在于蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及比較基因組學(xué)[2]。

1 基因克隆的途徑

1.1 正向遺傳學(xué)途徑

1.1.1 功能克?。╢unctional cloning）功能克隆即已知基因的功能信息進(jìn)行基因克隆的方法。也就是說我們雖然不知道當(dāng)前的目的基因序列，但是對其編碼的產(chǎn)物或者編碼產(chǎn)物的生理生化性質(zhì)非常清楚時(shí)采用的克隆方法。其具體做法是：首先從表型異常出發(fā)，找出導(dǎo)致出現(xiàn)異常表型的異常功能蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，純化后對此蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測序，根據(jù)氨基酸的序列信息合成寡核苷酸探針，在基因組文庫或cDNA文庫中去篩選目的基因或目的cDNA，最后克隆和定位這種異常蛋白質(zhì)的編碼基因。功能克隆是一種經(jīng)典的基因克隆策略，很多基因的分離利用這種策略。功能克隆的特點(diǎn)是用基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白來克隆基因。因此成功進(jìn)行功能克隆的關(guān)鍵就是能夠分離出一個(gè)純度很高的蛋白質(zhì)，只要有一個(gè)純的蛋白質(zhì)，得到特異的探針，這一方法是可行的。這就要求我們對其生理生化以及代謝途徑研究得比較清楚。很多人都熟知的與鐮刀型細(xì)胞貧血癥相關(guān)的珠蛋白基因，就是利用功能克隆的方法。近年來利用功能克隆的方法有很多相關(guān)的基因被克隆。例如南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院微生物學(xué)系克隆的硫代磷酸酯酶基因[3]、胡天華等人利用功能克隆的方法從煙草中分離出流行于我國的黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV），并克隆了編碼該病毒外殼蛋白的cDNA基因[4]、舒群芳等人利用此法在1995年構(gòu)建了天麻cDNA文庫，制備抗體探針成功地分離了編碼天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆，為抗真菌基因在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等方面的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)[5]。這種方法有其局限性，即只適用于克隆那些蛋白質(zhì)產(chǎn)物及其相應(yīng)功能都已清楚的基因，無法去克隆蛋白質(zhì)產(chǎn)物還不清楚的基因。

1.1.2 表型克隆1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念[6]，表型克隆是指某些植物除了在表型上存在差異外，我們對它的基因產(chǎn)物以及可用于基因定位的物理圖譜知之甚少，因此可以利用表型差異或組織器官特異表達(dá)產(chǎn)生的差異來克隆植物基因。Sun等用表型差異從擬南芥中克隆出赤霉素合成酶基因[7]。表型克隆在策略上就是利用表型的差異與基因結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)密切相關(guān)，從而可以分離特定表型相關(guān)的基因。可以不需要預(yù)先知道基因所對應(yīng)的生化功能或?qū)?yīng)的物理圖譜，而僅僅根據(jù)基因的表達(dá)效應(yīng)就直接分離該基因。但在實(shí)際操作過程中，驗(yàn)證所克隆的基因就是我們所希望得到的基因也需要耗費(fèi)許多精力。

1.2 反向遺傳學(xué)途徑

1.2.1 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法轉(zhuǎn)座子就是可以從染色體的一個(gè)位置自己轉(zhuǎn)移到另一位置的DNA片段。發(fā)生轉(zhuǎn)移的只是轉(zhuǎn)座子的拷貝，在轉(zhuǎn)移過程中原來位置的DNA片段并未消失。基因發(fā)生轉(zhuǎn)座能夠引起插入突變，使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型，或在插入位置上出現(xiàn)新的編碼基因。通過轉(zhuǎn)座子上的標(biāo)記基因（如抗藥性等）就可檢測出突變基因的位置并克隆到該基因。該方法是把轉(zhuǎn)座子作為基因定位的標(biāo)記，通過轉(zhuǎn)座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因的方法。對于無緊密連鎖的分子標(biāo)記的功能基因，采用這樣的克隆辦法是較為合適的。其缺點(diǎn)是篩選突變體的群體要求較大，因此需要的時(shí)間也較長。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆植物基因首先要把已分離得到的轉(zhuǎn)座子與選擇標(biāo)記構(gòu)建成含轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒載體，然后把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物，利用Southern雜交等技術(shù)檢測轉(zhuǎn)座子是否從載體質(zhì)粒中轉(zhuǎn)座到目標(biāo)植物基因組中，這是轉(zhuǎn)座子定位和分離目標(biāo)基因所必須的步驟，最后對轉(zhuǎn)座子插入突變進(jìn)行鑒定及分離。通常用于克隆植物基因的轉(zhuǎn)座子有玉米的Ac/Ds、Mu、Smp等。Ac含有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，能夠自主轉(zhuǎn)座，Ds不含轉(zhuǎn)座酶所以不能自主轉(zhuǎn)座，但Ds-Ac系統(tǒng)因Ac為Ds提供了轉(zhuǎn)座酶就可以自主地轉(zhuǎn)座了。用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法進(jìn)行植物基因的分離，首要的是把Ac等轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)化到要進(jìn)行基因克隆的植物中。

1.2.2 T-DNA標(biāo)簽法T-DNA（Transfer DNA）是位于根癌農(nóng)桿菌（agrobacterium tumefaciens）Ti（tumor inducing）質(zhì)粒上的一段DNA，它可以從農(nóng)桿菌中被轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定整合到植物核基因組中。一般而言，改造的T-DNA載體被除去了致瘤基因，使農(nóng)桿菌失去了原致病作用。T-DNA的主要優(yōu)點(diǎn)是能夠可載大到50kb的外源DNA；其整合不引起植物基因組大的重排；能完整和高頻地進(jìn)行轉(zhuǎn)移；不需要植物染色體提供特異序列，可隨機(jī)地整合且在表達(dá)活躍區(qū)域的整合幾率較高；對特定的基因類別沒有明顯的插入偏向性，因此，在植物基因工程和基因克隆中被廣泛引用。利用T-DNA作為標(biāo)簽，快速克隆功能基因的基本方法就是首先以人工構(gòu)建好的T-DNA作為標(biāo)簽，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，構(gòu)建突變體庫，獲得大量具有一定表型的突變體；再根據(jù)插入片段及人工擴(kuò)增插入點(diǎn)側(cè)翼的植物基因組序列與突變性狀的共分離檢測，最終實(shí)現(xiàn)快速鑒定和克隆功能基因。在水稻上，T-DNA標(biāo)簽法正在成為功能基因研究的重要方法[8]。

1.2.3 圖位克隆法圖位克?。╩ap-based cloning）又稱為定位克?。╬ositional cloning），是由英國劍橋大學(xué)Coulson等人[9]首次提出的。近年來隨著各種植物的分子標(biāo)記圖譜的相繼建立而發(fā)展起來的一種新的基因克隆技術(shù)。其原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用此物理圖譜通過染色體步查（chromosome walking）逐步逼近目的基因或染色體登陸（chromosome landing）的方法最終找到包括該目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)目的基因的功能。隨著各種植物的高密度圖譜和物理圖譜的相繼構(gòu)建成功，圖位克隆技術(shù)在植物的基因克隆中有著更廣闊的前景。圖位克隆技術(shù)也有其局限性，就是利用圖位克隆法克隆基因不僅需要構(gòu)建完整的基因組文庫，建立飽和的分子標(biāo)記連鎖圖和完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而且還要進(jìn)行大量的測序工作，所以對基因組大、標(biāo)記數(shù)目不多、重復(fù)序列較多的生物采用此法不僅投資大，而且效率低。因而圖位克隆法僅局限應(yīng)用在人類、擬南芥、水稻、番茄等圖譜飽和生物上。此外，在分析發(fā)生的變異的時(shí)候，我們最有可能遇到的復(fù)雜情況是一個(gè)給定的性狀由不止一個(gè)的基因位點(diǎn)控制[1]。

1.3 生物信息學(xué)途徑

利用生物信息學(xué)途徑進(jìn)行基因克隆，就是近些年來發(fā)展起來的電子克?。╥n silico cloning），也稱為電子延伸（in silico elongation），是近年來伴隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃發(fā)展起來的基因克隆新方法，是基于EST的基因克隆技術(shù)。EST是長約200～600bp的基因表達(dá)序列片段，它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到載體構(gòu)建成cDNA文庫后，大規(guī)模隨機(jī)挑選DNA克隆，對其3'或5'端進(jìn)行單次測序所獲得的DNA序列，因此每條EST代表了全長DNA的一部分。由于同一條基因產(chǎn)生的多個(gè)克隆都有機(jī)會(huì)被測序到，尤其是測序量較大時(shí)，因此這幾條EST經(jīng)過拼接后就可能組成該基因的全長序列，電子克隆的技術(shù)原理是利用這些EST序列，借助電子計(jì)算機(jī)的巨大運(yùn)算能力，通過EST或基因組的序列組裝和拼接，利用RT-PCR的方法快速地獲得新基因。首先，利用序列同源性比較軟件（如Blast軟件）將種子序列（例如甜菜抽薹的EST序列）對庫檢索；然后，從數(shù)據(jù)庫中挑選出全部相關(guān)序列；第三，對所有序列進(jìn)行片段整合分析，形成延伸后的序列，稱新生序列。隨后，將此新生序列作為種子序列重復(fù)進(jìn)行上述三步過程，直至新生序列不能被進(jìn)一步延伸為止，通過完整性分析即獲得了全長的新基因序列。

與傳統(tǒng)的基因克隆方法相比，電子克隆主要有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，電子克隆的速度快。因?yàn)榇蟛糠值牟僮鞫际窃谠谟?jì)算機(jī)上完成，只需RT-PCR序列驗(yàn)證即可。其次，投入低。電子克隆只需能夠上網(wǎng)的計(jì)算機(jī)和PCR儀等儀器即可進(jìn)行，不需要購買太多的藥品以及儀器，實(shí)驗(yàn)成本較低。第三，技術(shù)要求低。實(shí)驗(yàn)室工作只涉及到RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增等分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)。第四，針對性強(qiáng)。擬克隆基因的生物學(xué)功能大都比較明確，一旦獲得即可直接應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行作物品種改良[10]。

國際上Boguski[11]等學(xué)者在1994年開始利用電子克隆方法發(fā)現(xiàn)新基因。電子克隆技術(shù)應(yīng)用的前提條件要具備擬研物種的豐富核酸序列信息，其他物種相關(guān)基因的信息，以及強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)硬件和相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件?；蚪M和EST資料的豐富程度決定了電子克隆得以在人類、小鼠等生物中廣泛應(yīng)用。由于受到序列資料的限制，植物基因的電子克隆還鮮有報(bào)道。但隨著植物基因組計(jì)劃和功能基因組學(xué)的發(fā)展，電子克隆在植物基因工程研究中必將發(fā)揮出巨大的功用。

2 基因克隆在甜菜上的應(yīng)用

我國甜菜基因克隆起步較晚，和水稻等其它的糧食作物相比較還有很多工作要做，但近年來也有一些基因被克隆，取得了一些成績。

2.1 在抗病蟲方面

甜菜叢根病是由甜菜多粘菌（Polymyxa betae）傳播的甜菜壞死黃脈病毒（beet necrotic yellow vein virus, BNYVV）所致的一種毀滅性土傳病害[12]?？共∮N是對付該病唯一有效的途徑,但也只能引起基因重組而不能創(chuàng)新。植物基因工程的應(yīng)用在很大程度上彌補(bǔ)了常規(guī)育種引入基因的缺陷,并可創(chuàng)造出新基因。U.Ehlers等對甜菜的BNYVV病毒的外殼蛋白基因進(jìn)行的克隆，并進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證[13]；姚華建等也克隆了BNYVV外殼蛋白基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入甜菜下胚軸,得到了轉(zhuǎn)基因再生植株[14-15]；王琦等對于BNYVV的傳毒介體甜菜多粘菌基因組片段進(jìn)行了克隆并部分測序，并將其應(yīng)用于甜菜多粘菌P.betae侵染甜菜苗的早期快速檢測[16]。隨著QTL研究的發(fā)展，很多重要的抗性基因也分別被定位在甜菜的染色體上，例如利用QTL分析，把抗叢根病和根腐病的基因定位在甜菜第三號染色體上，認(rèn)為甜菜第三號染色體是主要的包含抗病基因的染色體，為進(jìn)一步克隆抗性基因打下了良好的基礎(chǔ)[17-18]。在抗蟲方面，1997年Cai等利用定位克隆的方法克隆了甜菜的抗線蟲基因[19]，這是在甜菜抗蟲基因克隆上取得的重大突破。

2.2 在甜菜生理生化方面

甜菜生理生化方面的基因克隆這幾年國內(nèi)外做的比較多，例如陳勝勇利用RT-PCR方法進(jìn)行甜菜胞液型谷氨酰胺合成酶mRNA、質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶mRNA(GS2mRNA)和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶的基因組基因（GS2DNA）的分離克隆[20]；侯靜等運(yùn)用RT-PCR并5'/3'-RACE法首次分離了甜菜的硝酸還原酶（NR）基因，在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)手段對甜菜NR cDNA推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行主要結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測，旨在從酶分子的結(jié)構(gòu)上揭示甜菜硝酸還原酶的調(diào)控機(jī)理[21]；2008年張杰等人對甜菜硝酸還原酶cDNA全長序列進(jìn)行了克隆[22]；崔杰等人對甜菜ATP合酶β亞基基因atpB進(jìn)行了克隆，并對序列進(jìn)行了分析[23]；戴建軍等分別以低溫誘導(dǎo)的甜菜幼苗為試驗(yàn)組，以未誘導(dǎo)的甜菜幼苗為對照組，以代表性差異分析方法，克隆了低溫誘導(dǎo)的甜菜幼苗差異表達(dá)基因片段，進(jìn)行了cDNA的末端快速擴(kuò)增，并進(jìn)行了DNA測序[24]；2010年李建平等對甜菜蔗糖磷酸合酶基因進(jìn)行了克隆，并對其表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證[25]。2002年，A.El-Mezawy等人構(gòu)建了甜菜抽薹基因的高分辨率圖譜[26]，為進(jìn)一步克隆甜菜抽薹基因B打下了良好的基礎(chǔ)。另外甜菜育性恢復(fù)基因及抽薹相關(guān)基因克隆的工作也正在展開。

3 甜菜基因克隆未來展望

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的領(lǐng)域，人類已經(jīng)邁出了堅(jiān)實(shí)的步伐，目前已經(jīng)有數(shù)百個(gè)物種進(jìn)行了全基因組測序工作，例如水稻、擬南芥、油菜、高粱等等，而甜菜基因組測序工作到目前還未展開。深圳華大基因研究院2010年1月宣布啟動(dòng)“千種動(dòng)植物基因組計(jì)劃”，預(yù)計(jì)在未來兩年內(nèi)破譯千種具有重要經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值的動(dòng)植物物種基因組，已吸引了多所國內(nèi)一流科研院校、研究機(jī)構(gòu)以及加拿大、美國、澳大利亞、馬來西亞等國際相關(guān)科研人員的加入[27]。我們有理由相信，隨著國家投入力度的加大，甜菜基因組測序工作不會(huì)太遙遠(yuǎn)，到那時(shí)，伴隨著測序工作的進(jìn)行、計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，不同的基因克隆技術(shù)之間的相互交叉融合，會(huì)有越來越多的甜菜基因被克隆，探討眾多功能基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也將成為今后的研究重點(diǎn)。從而把對功能基因調(diào)控作用的認(rèn)識從單個(gè)基因水平上升到眾多基因的網(wǎng)絡(luò)層次，整合相關(guān)研究的信息以全面認(rèn)識功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于從多維度系統(tǒng)水平上為利用功能基因進(jìn)行甜菜基因工程改良提供理論依據(jù)。這一切都將大大加速甜菜育種的進(jìn)程。

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Common Methods of Gene Cloning and Application in Beet

WU Ze-dong1,2,3,WANG Hua-zhong1,2,3
(1.The KeyLaboratoryofSugarbeetGenetics Breeding,HeilongjiangUniversity/Institute forCrop Research,HeilongjiangUniversity,Harbin 150080,China;2.The KeyLaboratoryofNorthSugarCrop Resource andUtilization,Chinese AcademyofAgriculturalSciences,Harbin 150080,China;3.SugarbeetResearchInstitute ofChinese AcademyofAgriculturalSciences,Harbin150080,China)

The different methods of gene cloning were introduced.The application of gene cloning and its prospect in beet were overviewed.

beet;gene cloning;methods;application

S566.3

A

1007-2624（2011）02-0059-04

2010-09-13

甜菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（nycytx-25-01-05）。

吳則東（1972-），男，黑龍江省依蘭縣人，助理研究員，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院在讀博士，主要從事甜菜遺傳育種研究。