冠脈結(jié)扎和介入兩種方法制備犬心肌梗死模型的比較

劉素蕊，趙春生，王更銀，李振奇，李俊峽

（解放軍白求恩國際和平醫(yī)院，石家莊 050082）

心肌梗死是心血管病死亡的重要原因之一，嚴(yán)重危害著人類健康，其在發(fā)展中國家的發(fā)病率和死亡率居高不下［1］。心肌梗死特征是心肌細(xì)胞壞死并被纖維組織所取代從而影響整個心臟功能和患者預(yù)后［2］。伴隨對心肌梗死研究的不斷深入，如何建立更貼近臨床的動物模型成為關(guān)鍵之一。心肌梗死模型作為疾病研究的重要手段，其應(yīng)用不但可以研究心肌梗死的發(fā)病機制，而且能夠為心肌梗死的預(yù)防和新治療方案的建立提供理論及實驗依據(jù)。本實驗比較了兩種不同的構(gòu)建犬心梗模型的方法，以期為更好地制備模型提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

雜種犬16只，開胸冠脈結(jié)扎與閉胸冠脈栓塞各8只，雌雄不拘，體重（15～20）kg；小型動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；PTCA所需材料包括各種穿刺針、動脈鞘、導(dǎo)絲（短導(dǎo)絲及長導(dǎo)絲）、導(dǎo)管（造影導(dǎo)管、Guiding造影導(dǎo)管、PTCA球囊導(dǎo)管均為Cordis公司產(chǎn)品）；數(shù)字剪影血管造影機（荷蘭飛利浦）。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉犬：術(shù)前12 h禁食，6 h禁水，經(jīng)肌內(nèi)注射速眠新（846合劑，0.15～0.20 m L/kg體重）進行麻醉，胸部及雙側(cè)腹股溝部備皮，建立靜脈通道，進行心電監(jiān)測。術(shù)中根據(jù)肢體運動情況每隔1 h左右重復(fù)肌內(nèi)注射速眠新1.5 m L，使犬保持麻醉狀態(tài)，并觀察犬的呼吸、血壓、心律及心率情況。

1.2.2 開胸冠脈結(jié)扎方法制備犬心梗模型：將犬固定于實驗手術(shù)臺上，右側(cè)臥位，氣管插管，接呼吸機輔助呼吸，靜脈預(yù)防性使用抗生素。常規(guī)消毒鋪巾，左前胸心臟搏動最明顯之肋間（約4～5肋間）作橫切口，約5～7 cm，逐層分離，暴露心臟，表面最粗大的橫向走行的血管即為左前降支（LAD）。先結(jié)扎供應(yīng)預(yù)缺血區(qū)大的側(cè)支血管，左前降支第一對角支下距左主干1.5 cm處結(jié)扎前降支主干，觀察3～5 m in。術(shù)中有心律失常者用利多卡因5～10 mg/kg靜注，關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉，用青霉素粉劑敷于肌肉和皮膚內(nèi)層防止感染，并插引流管進行肺部排氣。關(guān)胸后用50 m L注射器抽盡胸腔內(nèi)積氣，避免術(shù)后氣胸。待犬自主呼吸恢復(fù)去掉呼吸機，拔出引流管，保溫至完全蘇醒。

1.2.3 閉胸冠脈栓塞制備犬心梗模型：常規(guī)手術(shù)消毒鋪巾，經(jīng)皮穿刺右股動脈，穿刺成功后，置入5F血管鞘。此時經(jīng)股動脈注入肝素鈉2500 U，此后每隔1 h追加肝素鈉1250 U。插入Cobra造影導(dǎo)管，在透視監(jiān)視下置入冠狀竇，插入左冠狀動脈主干行冠狀動脈造影，造影成功后將導(dǎo)絲送入前降支遠(yuǎn)端，沿鋼絲送入微導(dǎo)管，撤除鋼絲保留微導(dǎo)管于前降支中段，經(jīng)微導(dǎo)管注入細(xì)顆粒狀明膠海綿（注入前無菌狀態(tài)下用手術(shù)刀將其切割成直徑1 mm左右的細(xì)顆粒狀），行冠狀動脈造影顯示左前降支遠(yuǎn)端血流中斷，拔除造影導(dǎo)管。拔除血管鞘，動物清醒后送回動物飼養(yǎng)中心。

1.2.4 犬心梗模型鑒定：（1）心電圖檢查：造模前及30 min后采用單級肢體導(dǎo)聯(lián)和胸導(dǎo)聯(lián)方式，觀察心電圖波形變化；（2）病理分析：兩組動物均于術(shù)后72 h，靜脈注射10％KCl 20 mL將犬處死，迅速取出心臟，用生理鹽水將殘余血液沖洗干凈，置入10％福爾馬林固定液中，固定后行組織修整、洗滌、酒精逐級脫水，二甲苯置換出組織中的酒精。石蠟包埋，切片機切成4μm的薄片，HE染色封片，光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 開胸冠脈結(jié)扎法

5 m in后可觀察到結(jié)扎部位變蒼白。本組4只犬死亡（死因分別為氣胸和麻醉過深），4只存活；閉胸冠脈栓塞法，1只死亡，7只存活。開胸對實驗動物的創(chuàng)傷較大，故死亡率較高。

2.2 犬心梗模型的鑒定

開胸冠脈結(jié)扎過程中，結(jié)扎左前降支3～5 m in后可見結(jié)扎部位以下及心尖部心肌顏色變暗，搏動減弱（圖1）；閉胸冠脈栓塞注入明膠海綿后造影顯示左前降支遠(yuǎn)端血流中斷（圖2）。（1）較造模前正常心電圖波形，兩種方法造模后的心電圖均顯示ST-T改變和/或室性心律失常出現(xiàn)，符合心梗心電圖特點（圖3）；（2）造模后72 h KCl處死實驗犬，造模前正常心肌樣本為磚紅色，梗死心肌顏色暗淡，呈白色或灰色；梗死部位主要位于左心室前壁。光鏡下梗死心肌細(xì)胞變性深染，核固縮、消失，肌纖維腫脹，間質(zhì)血漿滲出、出血，并可見大量白細(xì)胞浸潤（圖4，B、C，圖4見封三）。心電圖和病理結(jié)果提示兩種方法均可成功制作心梗模型。

圖1 開胸冠脈結(jié)扎左前降支。Fig.1 The left anterior descending coronary artery was obstructed by open thoracotomy ligation

圖2 造影顯示閉胸冠脈栓塞過程。A，冠脈造影栓塞前；B，栓塞組顯影。Fig.2 Coronary angiography showing the close chest embolism.A.Before embolism；B.After embolism

3 討論

心肌梗死模型的制備原理是采用各種手段使目的冠狀動脈閉塞，從而造成該冠脈供血區(qū)的心肌細(xì)胞發(fā)生缺血壞死。心肌缺血使心肌細(xì)胞數(shù)目減少，心肌收縮力下降［3］，從而為心肌梗死的研究提供條件?？紤]到犬個體較大，觀察與操作方便，且犬在心臟解剖、生理特性方面與人類也較為接近，相關(guān)研究較少，所以選擇犬作為實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

當(dāng)前，冠脈結(jié)扎法和介入法是兩種最常用的制備心梗模型的方法。有研究報道，結(jié)扎左冠脈前降支及冠脈介入均能夠成功建立心梗模型［4，5］。本實驗我們以犬為模型對這兩種造模方法進行比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法均能成功制備犬的急性心肌梗死模型，且可被心電圖和病理檢測所證實，同已有實驗結(jié)論一致。其中開胸結(jié)扎法手術(shù)操作難度高，創(chuàng)傷大，易造成氣胸，且必須有呼吸機輔助呼吸，術(shù)后恢復(fù)較慢，難以飼養(yǎng)且死亡率高。該組的8只動物中，死亡4例，死亡率高達(dá)50％，我們總結(jié)手術(shù)過程中的經(jīng)驗和教訓(xùn)如下：（1）良好的麻醉至關(guān)重要。戊巴比妥鈉是文獻(xiàn)中最常報道的全麻藥物，但其對呼吸的抑制較重，如不能良好掌握輸注速度及劑量，易致動物麻醉過量而死亡。我們所選用的麻醉藥物速眠新（846合劑），對呼吸的抑制程度較輕，以（0.15～0.20）m L/kg肌內(nèi)注射，可以達(dá)到理想的麻醉效果；（2）氣胸是導(dǎo)致犬死亡的重要原因。因犬的縱膈胸膜極薄，在打開心包膜時易被撕破而形成右側(cè)氣胸。此外，因犬無法使用胸腔閉式引流，所以術(shù)后關(guān)胸時要盡量抽盡胸腔內(nèi)氣體，術(shù)后發(fā)現(xiàn)氣胸要及時抽氣；（3）呼吸機必不可少。在以開胸結(jié)扎法制備心梗模型的過程中，呼吸機的應(yīng)用可大大提高動物的存活率，簡易人工呼吸氣囊不容易掌握潮氣量的大小和頻率，死亡率很高；（4）室顫的預(yù)防及處理。室顫的發(fā)生率與冠脈結(jié)扎的位置和心梗的面積密切相關(guān)［6］，因此，掌握好結(jié)扎部位是預(yù)防室顫及造模成功的關(guān)鍵。結(jié)扎前的缺血預(yù)適應(yīng)對預(yù)防室顫的發(fā)生也很重要，一般采用先結(jié)扎較大的側(cè)支血管，再結(jié)扎前降支主干的方法，即可以達(dá)到很好的室顫預(yù)防效果。此外，預(yù)防性應(yīng)用利多卡因，可以提高室顫的閾值，從而減少室顫的發(fā)生。一旦出現(xiàn)室顫，應(yīng)立即給予除顫器電擊除顫，犬的側(cè)支循環(huán)比較豐富，一般均可復(fù)律。相比之下，介入法制備過程比較順利，除一例因微導(dǎo)管進的位置太深導(dǎo)致室顫死亡外，其余幾例均成功存活，在制備過程中應(yīng)注意：（1）導(dǎo)管不宜在冠狀動脈內(nèi)停留時間太久，微導(dǎo)管位置不宜進的太深，否則均易誘發(fā)室顫，增加死亡率；（2）栓塞前降支位置不宜過高，以第2對角支遠(yuǎn)端最為合適［7］，高位阻斷后，梗死面積過大，術(shù)后易并發(fā)急性左心衰而致動物死亡，死亡率可高達(dá)85％［8］。

圖3 兩種方法造模前后的心電圖波形變前化。A，正常犬的心電圖波形； B，開胸冠脈結(jié)扎組心電圖；C，閉胸冠脈栓塞組心電圖。Fig.3 Electrocardiograms of the dogs before and after the model establishment.A.Electrocardiogram before the model establishment；B.Coronary ligation group；C，Close chest embolism group

本實驗所采用的兩種造模方法均可成功制備犬的急性心肌梗死模型，并為心電圖、病理組織切片的方法所證實。其中，開胸結(jié)扎法效果確實可靠，但操作難度高，創(chuàng)傷大，動物不容易存活；而介入法簡便易行，創(chuàng)傷小，死亡率低，結(jié)果同已有報道一致，是一種有效的犬急性心肌梗死造模方法。

［1］American Heart Association.Statistical Fact Sheet—Populations：2009 Update.Available at：http：//www.americanheart.org/ downloadable/heart/1236204012112INTL.pdf.

［2］Rota M，Padin-Iruegas E，Misao Y，et al.Local activation or implantation of cardiac progenitor cells rescues scarred infracted myocardium improving cardiac function［J］.Circ Res，2008，103：107-116.

［3］Sabbah HN，Sharov VG，Goldstein S.Cell death，tissue hypoxia and the progression of heart failure［J］.Heart Fail Rev，2000，5：131-138.

［4］孫帥，郭濤.冠狀動脈堵閉法與栓塞法制備小型豬心肌梗死模型的對比［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13：9913-9916.

［5］謝忠忱，尹明，茍鵬，等.開胸與微創(chuàng)方法制備小型豬急性心肌梗死模型的對比研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16：46-49.

［6］Zhang WZ，Zha DG，Cheng GX，et al.Assessment of regional myocardial blood flow withmyocardial contrast echocardiography：an experimental study［J］.Echocardiography，2004，21：409 -416.

［7］李可，劉衛(wèi)金，鄒利光，等.閉胸式冠狀動脈插管法建立犬急性心肌缺血模型［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，29：1630 -1631.

［8］Murasat o Y，Nagamot o Y，Urabe T，et al.Effects of lidocaine and diltiazem on recovery of electrophysiologic activity during partial reperfusion following severemyocardial ischemia in canine hearts［J］.Electrocardiology，1997，30：113-125.