小型豬糖尿病模型研究進(jìn)展

王月婷，王宗保

（南華大學(xué)藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，湖南衡陽 421001）

1 小型豬簡(jiǎn)介

小型豬是珍稀豬種，原產(chǎn)地是中國和越南。我國的小型豬主要是在其原產(chǎn)地經(jīng)過長(zhǎng)期近親交配而形成的封閉群，具有體型小，遺傳穩(wěn)定性等特點(diǎn)。國外小型豬的培育多采用世界各地小體型豬種或野豬進(jìn)行多品種雜交選育而成，雖然品種多，但缺乏資源優(yōu)勢(shì)。目前國外用小型豬來制備糖尿病模型的有Yucatan小型豬、Yorkshire小型豬、G?ttingen小型豬、Sinclair小型豬等，國內(nèi)有廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、五指山小型豬、版納微型豬等。

2 小型豬糖尿病模型的制備

2.1 單獨(dú)高糖高脂飼料喂養(yǎng)制備模型

基礎(chǔ)飼料的能量比如下：總能量為16.84 MJ/ kg，攝入能量為13.34 MJ/kg，其中蛋白質(zhì)含量約占15.98％，脂肪為4.71％，碳水化合物為62.19％。高糖高脂飼料是由10％的豬油、37％的蔗糖和53％的基礎(chǔ)飼料組成，能量比如下：總能量為18.46 MJ/kg，攝入能量為15.95 MJ/kg，蛋白質(zhì)占8.48％，脂肪12.50％，碳水化合物69.59％。飼料配方及所還有的能量沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，都大同小異。陳華等［1］以高糖高脂飼料同時(shí)喂養(yǎng)了4-5月齡的巴馬小型豬、五指山小型豬、中國農(nóng)大小型豬。結(jié)果巴馬小型豬和五指山小型豬對(duì)高糖高脂飼料誘導(dǎo)糖尿病比較敏感，實(shí)驗(yàn)5～6月后出現(xiàn)糖代謝異常，表現(xiàn)為體型肥胖、血清胰島素升高和胰島素敏感性下降。而中國農(nóng)大小型豬對(duì)高糖高脂飼料誘導(dǎo)糖尿病相對(duì)不敏感，實(shí)驗(yàn)過程中血清葡萄糖水平、胰島素含量、胰島素敏感性指數(shù)和靜脈糖耐量實(shí)驗(yàn)（IVGTT）都無顯著變化，僅在實(shí)驗(yàn)后期表現(xiàn)為肥胖、胰島素敏感性指數(shù)下降。Xi等［2］和Liu等［3］分別用貴州小型豬和巴馬小型豬誘導(dǎo)糖尿病，他們?cè)诟咛歉咧暳现刑砑恿四懝檀?，其配方如下?1％的基礎(chǔ)飼料、10％的豬油、37％的蔗糖和2％的膽固醇。結(jié)果是貴州小型豬在喂養(yǎng)6個(gè)月后出現(xiàn)了顯著的糖尿病癥狀和血管病變。巴馬小型豬在5個(gè)月后出現(xiàn)了高糖血癥、高胰島素血癥和脂代謝紊亂，同時(shí)有尿糖和腎炎糖尿病腎病等癥狀。由此可見高糖高脂飼料添加膽固醇可加速糖尿病的形成，同時(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也會(huì)出現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化癥狀。

2.2 鏈脲佐菌素的應(yīng)用

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）對(duì)一定種屬動(dòng)物的胰島素細(xì)胞有選擇性破壞作用，對(duì)機(jī)體組織毒性相對(duì)較小，動(dòng)物存活率高，目前是國內(nèi)外使用較多的制備糖尿病動(dòng)物模型的藥物。純的STZ為白色粉末狀，在光照下易分解，因此需低溫避光保存。STZ購買后應(yīng)保存在-20℃?，F(xiàn)配現(xiàn)用，用時(shí)應(yīng)溶解在緩沖液中。溶解STZ的緩沖液有生理鹽水、檸檬酸緩沖液等，通過不同溶劑溶解STZ后血糖模型的比較，最后指出pH4.5檸檬酸緩沖液可以作為理想的溶劑［4］，因此推薦用檸檬酸緩沖液溶解STZ。新鮮配制的檸檬酸緩沖液溶解STZ溶液呈現(xiàn)透明的微黃色，如果顏色變深或者有氣泡產(chǎn)生，說明該試劑的穩(wěn)定性受到破壞，將導(dǎo)致STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型失敗。給藥前，動(dòng)物需要徹底空腹禁食，一般都是禁食12 h以上。

選擇用STZ誘導(dǎo)小型豬要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、給藥途徑及方法、給藥劑量等。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇方面，最好用雄性動(dòng)物造模，雌性除了激素影響外，還要注意在實(shí)驗(yàn)時(shí)不要混入雄性，雌雄混養(yǎng)，容易導(dǎo)致妊娠，影響實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重開始建模時(shí)不能太低，因?yàn)橐坏┏赡＃w重幾乎是負(fù)增長(zhǎng)，文獻(xiàn)多選用體重為20～25 kg的小型豬來誘導(dǎo)建模。給藥途徑有腹腔注射，靜脈注射，皮下注射等。皮下注射很少見，腹腔注射操作簡(jiǎn)單，方便快捷，但一般多用于鼠類建模中。小型豬一般多主張快速靜脈注射，多采用耳緣靜脈注射。方法有一次性大劑量，一次性小劑量和多次小劑量等均可造成糖尿病。STZ的劑量與血糖的高低有關(guān)，一般一次性大劑量直接會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞的廣泛破壞，造成1型糖尿病；小劑量只破壞部分β細(xì)胞，造成外周組織對(duì)胰島素不敏感，接近于人類2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理。由于一次性大劑量藥物的毒性太大，可以平均分成多次小劑量的注射，這樣減少藥物毒性，有助于建模，提高成模率。因STZ的水溶液不穩(wěn)定，注射時(shí)要迅速最好在30 min內(nèi)注射完，否則藥效會(huì)降低。建模時(shí)除了把握藥物的劑量外，還要參考實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡、體重、對(duì)藥物的承受能力以及不同物種間對(duì)藥物的敏感程度。Didier Mesangeau等［5］用5月齡、體重為（17.8±0.45）kg的Yucatan小型豬，第一次注射55 mg/kg劑量的STZ，8 d后又按照50 mg/kg的劑量再次注射STZ，如果血糖過高，平均一天2次注射10～20單位的胰島素，成功誘導(dǎo)出1型糖尿病。成模后糖尿病組血糖與正常組相比顯著并且持續(xù)升高，體重明顯下降。Ross G等［6］用年齡為8～12周齡體重為15～20 kg的Yorkshire小型豬按照50 mg/kg的劑量通過耳緣靜脈連續(xù)3d注射STZ，再用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，成功誘導(dǎo)出糖尿病。在注射STZ后的2 d內(nèi)空腹血糖達(dá)到最高，之后會(huì)緩慢降下來。注射STZ后的20周，胰島β細(xì)胞為43±10與正常組221±86比較減少了20％。國內(nèi)Lu Lin等［7］用4～6月齡平均體重為20～30 kg的雄性貴州小型豬，按照125 mg/kg的STZ劑量成功誘導(dǎo)出糖尿病模型，糖尿病組的空腹血糖在注射STZ后的2～3個(gè)月后急劇上升，之后會(huì)逐漸降下來。6個(gè)月后空腹血糖糖尿病組（7.09±4.11） mmol/L與正常組（2.19±0.78）mmol/L相比差異有顯著性；胰腺的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，正常組的胰腺有許多β細(xì)胞團(tuán)存在，而糖尿病組的胰腺β細(xì)胞團(tuán)幾乎沒有，僅有殘余的小的β細(xì)胞存在。M Jensen-Waern等［8］用6月齡平均體重為（19±1.3） kg的家豬來誘導(dǎo)糖尿病，一次性注射STZ150 mg/ kg，成功誘導(dǎo)出高血糖癥且氨基酸代謝改變。注射STZ 9 h后，血糖由原來的（5.4～7.5）mmol/L下降到（0.8～2.2）mmol/L，血糖太低注射0.5 g/kg的葡萄糖。在24 h后所有實(shí)驗(yàn)豬出現(xiàn)高血糖，3 d后空腹血糖值大于25 mmol/L.C肽平均值為（0.25± 0.16）μg/L，血清支鏈氨基酸的濃度增加4倍，丙氨酸和?；撬岱謩e降低了70％和50％。所有實(shí)驗(yàn)豬除了生長(zhǎng)阻滯和骨骼肌減少外體格檢查均正常，最后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物消瘦，尸檢證明肌肉消耗，腹部肌肉減少和皮下脂肪減少。Von W ilmowsky C等［9］用家豬注射90 mg/kg的STZ就可以誘導(dǎo)出具有明顯特征的糖尿病模型，其6個(gè)月后軟骨和硬骨的骨組織病理特征發(fā)生改變。Lee PY等［10］在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小型豬中對(duì)胰腺蛋白進(jìn)行雙向電泳檢測(cè)，與對(duì)照組相比，糖尿病組發(fā)現(xiàn)了11個(gè)蛋白與正常組有顯著區(qū)別。此關(guān)于胰腺蛋白質(zhì)組學(xué)的研究數(shù)據(jù)將為研究1型糖尿病病理機(jī)理過程提供有價(jià)值的資源。

尼克酰胺的作用是保護(hù)部分β細(xì)胞，以緩沖STZ對(duì)β細(xì)胞造成的損傷。Marianne O.larsen等［11］用G?ttingen小型豬建立糖尿病模型，他用平均體重為（18±3）kg的小型豬單獨(dú)注射不同劑量的STZ （0，75，100和125 mg/kg）誘導(dǎo)糖尿病或者用平均體重為（22.5±3.5）kg的小型豬注射劑量為125 mg/ kg的STZ結(jié)合不同劑量的尼克酰胺（0，20，67，100，150和230 mg/kg）進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果單獨(dú)注射不同劑量的STZ，以100和125 mg/kg的劑量是最好的，空腹血糖和胰島素與正常組相比都有顯著變化；注射125 mg/kg的STZ和不同劑量的尼克酰胺，以67 mg/kg的尼克酰胺為最佳，此劑量的藥物在注射前與注射后相比較都有顯著的變化。隨后幾年他用同樣劑量125 mg/kg的STZ和67 mg/kg的尼克酰胺也誘導(dǎo)出了糖尿病模型［12，13］。此種方法建立的模型有利于糖尿病病理生理學(xué)的研究，并且為治療糖尿病篩選新的藥物提供幫助。

有文獻(xiàn)報(bào)道，用STZ誘導(dǎo)糖尿病血糖會(huì)出現(xiàn)3個(gè)時(shí)期的變化：早期的高血糖時(shí)期，大約持續(xù)1～2 h，可能是由于藥物抑制了胰島β細(xì)胞釋放胰島素所致；低血糖時(shí)期，大約持續(xù)6～10 h，可能是因?yàn)樗幬锲茐牧艘葝uβ細(xì)胞，使胰島素大量釋放所致；最后大約72個(gè)h后就是穩(wěn)定持續(xù)的高血糖時(shí)期即糖尿病階段。在注射STZ后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)短暫性的飲食減少，飲水增加，多尿，活動(dòng)反應(yīng)差，精神不振等癥狀，大約持續(xù)1周。所以要保持給予充足的水源，棲息地墊草料，要保持清潔衛(wèi)生，溫度要適中，此期間要隨時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖。嚴(yán)重的低血糖是要補(bǔ)充葡萄糖，高血糖時(shí)要補(bǔ)充胰島素。也有文獻(xiàn)報(bào)道，在注射STZ一個(gè)月后血糖不但沒有升高，反而和之前血糖不相上下甚至低于之前血糖水平，這可能是與STZ的劑量有關(guān)，STZ的劑量不夠，胰島β細(xì)胞發(fā)生代償性反應(yīng)，胰島β細(xì)胞增生，胰島素分泌增加所致。這種情況下，只有等血糖恢復(fù)正常水平后再次注射STZ。

3 小型豬糖尿病模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)

小型豬的糖代謝血液生化指標(biāo)與人類十分相似，血清胰島素和葡萄糖的正常值接近于人類，糖耐量實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)過程也與人類相近，因此，小型豬的判斷標(biāo)準(zhǔn)可以參考人類的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。2010年美國糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布了人類糖尿病診斷的新標(biāo)準(zhǔn)［14］，該標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）A1C≧6.5％。（2）空腹血糖（FPG）≧7.0 mmol/L，空腹的定義是至少8 h未攝入熱量。（3）口服糖耐量（OGTT）實(shí)驗(yàn)中2 h的血糖≧11.1 mmol/L。實(shí)驗(yàn)應(yīng)按照世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，用75 g無水葡萄糖溶于水中作為糖負(fù)荷。（4）有高血糖的癥狀或高血糖危象，隨機(jī)血糖≧11.1 mmol/L。因?yàn)樾⌒拓i在糖耐量試驗(yàn)中不會(huì)像人一樣配合，所以可以采用靜脈糖耐量（IVGTT）來代替OGTT。Berit Chistoffersen等［15］比較了幾種反應(yīng)小型豬胰島素敏感性的實(shí)驗(yàn)方法，最后指出IVGTT優(yōu)于其它幾種方法。

4 選擇小型豬制備糖尿病模型的優(yōu)勢(shì)

目前全球糖尿病患者日益增加，病因不清楚，誘發(fā)因素很多，對(duì)糖尿病研究使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也很多，如靈長(zhǎng)類的獼猴，用它研究糖尿病更接近于人類，但是價(jià)格比較昂貴；也有嚙齒類動(dòng)物，如小鼠、大鼠等，雖然價(jià)格適中，但是他們的功能器官與人類還是有一定的差距?，F(xiàn)在國內(nèi)外用小型豬來做糖尿病模型的越來越多，這主要是因?yàn)樾⌒拓i與人類的功能器官很接近，胰島素肽鏈氨基酸的組成和人類最相近，只相差一個(gè)氨基酸（β鏈第30位氨基酸，豬是丙氨酸，人是蘇氨酸［16］）；心血管系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展，形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理特征與人類相差不大［17］；再者豬與人類一樣都是雜食性動(dòng)物，自身的糖代謝、脂代謝的特點(diǎn)也與人類極為相似［18］。此模型與鼠等動(dòng)物模型相比，豬與人在皮下藥物管理、胃腸的結(jié)構(gòu)、胰島的形態(tài)與代謝狀態(tài)存在相似的藥物動(dòng)力學(xué)；還可以做糖尿病胰腺移植的相關(guān)研究，為糖尿病的治療提供一種方法；歐洲的G?ttingen小型豬已被公認(rèn)為最佳的醫(yī)用模式動(dòng)物之一，目前可作為糖尿病、心臟病、高血壓等重大疾病的動(dòng)物模型和新藥刪選模型，所以豬是研究糖尿病及其并發(fā)癥的理想動(dòng)物。

5 展望

由于小型豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、血液學(xué)和血液生化指標(biāo)值、疾病發(fā)生過程等方面都與人極為相似，因此不僅應(yīng)用于糖尿病模型，還廣泛用于心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)、骨骼發(fā)育和營養(yǎng)代謝等方面。而且應(yīng)用數(shù)量正在逐年增加，有可能會(huì)取代實(shí)驗(yàn)猴、犬成為被大量使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在心血管系統(tǒng)方面，豬的心臟大小和血液循環(huán)與人類很相似，堵塞冠狀動(dòng)脈分支后形成的心肌梗死模型與人類的心肌梗死病變過程有很大的相似，對(duì)臨床研究心肌梗死的病理生理以及治療方法有重要意義；小型豬的營養(yǎng)吸收和胃腸道結(jié)構(gòu)與人類相似，所以用小型豬制作消化系統(tǒng)疾病模型與其他同類動(dòng)物模型相比有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)；在皮膚系統(tǒng)方面，豬皮膚的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與藥理學(xué)與人類相似，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)燒傷研究的理想動(dòng)物；隨著移植醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的深入研究，到現(xiàn)在為止，小型豬已被選為最適合的異種移植供體，小型豬-人異種器官/細(xì)胞的移植已經(jīng)是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)；另外小型豬在一些藥物的代謝動(dòng)力學(xué)方面比其他動(dòng)物更能反映藥物在體內(nèi)的情況，因此，小型豬越來越多的被用于藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面的相關(guān)研究。由此可見，小型豬做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］陳華，劉亞，李春海，等.三個(gè)品系小型豬2型糖尿病模型的比較研究［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2007，24（6）：49-55.

［2］Xi S，Yin W，Wang Z，et al.A minipigmodel of high-fat/highsucrose diet-induced diabetes and atherosclerosis［J］.Int J Exp Path，2004，85：223-231.

［3］Liu Y，Wang Z，Yin W，et al.Severe insulin resistance and moderate glomerulosclerosis in a minipig model induced by highfat/high-sucrose/high-cholesterol diet［J］.Exp Anim，2007，56 （1）：11-20.

［4］末立江，劉長(zhǎng)青，郭金銘，等.不同溶劑在鏈脲佐菌素血糖模型的作用比較［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，3454-3455.

［5］Mesangeau D，Laude D，Elghozi JL.Early detection of cardiovascular autonomic neuropathy in diabetic pigs using blood pressure and heart rate variability［J］.Cardiovasc Res，2000，45 （4）：889-899.

［6］Gerrity RG，Natarajan R，Nadler JR，et al.Diabetes-induced accelerated atherosclerosis in swine［J］.Diabetes，2001，1654 -1655.

［7］Lu L，ZHANG Q，PU L，et al.Elevation of tumor necrosis factor-，interleukin-1 and interleukin-6 levels in aortic intima of Chinese Guizhou minipigs with streptozotocin-induced diabetes［J］.Chin Medical J，2007，120（60）：479-484.

［8］Jensen-Waern M，Andersson M，Kruse R，Nilsson B，et al.Effects of streptozotocin-induced diabetes in domestic pigs with focus on the amino acid metabolism［J］.Lab Anim，2009，43 （3）：249-254.

［9］Von W ilmowsky C，Stockmann P，Metzler P，et al.Establishment of streptozocin-induced diabetic domestic pigmodel and a systematic evaluation of pathological changes in the hard and soft tissue over a 12-month period［J］.Clin Oral Implants，2010，21（7）：709-717.

［10］Lee PY，Park SG，Kim EY，et al.Proteomics analysis of pancreas from mini-pigs treated with streptozotocin as a type 1 diabetesmodels［J］.Microbiol Biotechnol，2010，20（4）：817 -820.

［11］Larsen MO，Wilken M，Gotfredsen CF，et al.Mild streptozotocin diabetes in the Gottingen minipigs：A novelmodel ofmoderate insulin deficiency and diabetes［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282：E1342-E1351.

［12］Larsen MO，Rolin B，Ribel U，et al.Valine pyrrolidide preserves intact glucose-dependent insulinotropic peptide and improves abnormal glucose tolerance in minipigs with reducedβcellmass［J］.Exp Diab Res，2003，4：93-105.

［13］Larsen MO，Juhl CB，Porksen N，et al.β-cell function and islet morghology in normal，obese，and obeseβ-cell mass-reduced Gottingen minipigs［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2005，288：E412-E421.

［14］American Diabetes Association.Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus［J］.Diabetes Care，2011，34，S62-S69.

［15］Christoffersen B，Ribel U，Raun K，et al.Evaluation of different methods for assessment of insulin sensitivity in G?ttingen minipigs：introduction of a new，simpler methord［J］.Am J physiol Regul Integr Comp Physiol，2009，297：R1195-R1201.

［16］Bellinger DA，Merricks EP，Nichols TC.Swinemodels of type 2 diabetes mullitus：insulin resistance glucose and cardiovascular complications［J］.ILAR J，2006，47（3）：243-258.

［17］Liu Y，Wang Z，Yin W，et al.Severe insulin resistance and moderate glomerulosclerosis in minipig model induced by highfat/high-sucrose/high-cholesterol diet［J］.Exp Anim，2007，56 （11）：11-20.

［18］McDonald TO，Gerrity RG，Jen C，et al.Diabetes and arterial extracellular matrix changes in a porcine model of atherosclerosis［J］.Histochem Cytochem，2007，55（11）：1149-1157.