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    高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖和Caspase-3的影響

    2011-02-03 04:41:38王健李興
    中國現(xiàn)代藥物應用 2011年2期
    關(guān)鍵詞:脂聯(lián)素高糖腎小管

    王健 李興

    高糖環(huán)境下脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖和Caspase-3的影響

    王健 李興

    目的探討脂聯(lián)素(Adiponectin,ADPN)對高糖環(huán)境下人近曲腎小管上皮細胞增殖、凋亡及T-鈣黏蛋白(T-cadherin)表達的影響,揭示脂聯(lián)素在糖尿病腎病中的保護作用。方法將人近曲腎小管上皮細胞用5.5 mmol/L葡萄糖(正常對照組)、30.0 mmol/L葡萄糖(高糖組)、30.0 mmol/L+2.5μg/ml ADPN(脂聯(lián)素組)分別培養(yǎng)24 h,48 h,72 h后,運用MTT法測定細胞增殖,運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定細胞上清液中Caspase-3的含量,觀察細胞凋亡。結(jié)果①高糖組人近曲腎小管上皮細胞增殖被抑制(P<0.05),加入脂聯(lián)素(2.5μg/ml)后促進了細胞增殖(P<0.05),并呈時間依賴性。②高糖組人近曲腎小管上皮細胞凋亡增加(P<0.05),加入脂聯(lián)素(2.5μg/ml)后延緩了細胞凋亡。結(jié)論高糖環(huán)境下隨著時間的延長,可引起腎小管上皮細胞增生肥大,誘導其凋亡;脂聯(lián)素可促進細胞增殖,延緩細胞凋亡。

    脂聯(lián)素;腎小管上皮細胞;細胞凋亡

    糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見和最嚴重的并發(fā)癥之一,嚴重影響著患者的生活質(zhì)量和生存率。每年大約有30%~40%DN進展為終末期腎功能衰竭(ESRD)。DN發(fā)病機制尚不清楚,多數(shù)學者認為其發(fā)病是多種細胞因子、生長因子、激素等對高血糖的綜合反應的結(jié)果。其主要病理改變是細胞外基質(zhì)(ECM)在腎小管、腎小球聚集,最終導致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。近年來隨著對DN研究的深入,人們已認識到與腎小球相比,腎小管間質(zhì)病變對腎功能影響更大。DN早期即可發(fā)生腎小球硬化(包括小球基底膜增厚和系膜增寬)和腎小管間質(zhì)纖維化。腎小管間質(zhì)包括腎小管上皮細胞、血管和間質(zhì)成分,占腎臟體積的90%以上。DN的腎小管間質(zhì)相關(guān)病理表現(xiàn)有:腎小管基底膜增厚、腎小管營養(yǎng)不良、間質(zhì)纖維化和動脈硬化。而腎小管上皮細胞損傷后的改變被認為是腎間質(zhì)纖維化的起始因素。因而,保護腎小管上皮細胞,減少其損傷,去除腎間質(zhì)纖維化的起始因素,成為本研究的一個切入點。Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一,是細胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者,是細胞凋亡過程中的主要效應因子。脂聯(lián)素(Adiponectin,ADPN)是近年來發(fā)現(xiàn)的對糖尿病有保護作用的蛋白質(zhì),主要由脂肪細胞分泌。多項研究證明脂聯(lián)素有抗氧化[1]、抗動脈粥樣硬化、保肝、抗纖維化及抗炎[2]等多種保護作用,可能在DN發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。本研究旨在通過高糖環(huán)境中脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖及Caspase-3的影響,探討脂聯(lián)素對高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞的保護作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 細胞培養(yǎng) HK-2細胞株為人近曲腎小管上皮細胞,購買于中國醫(yī)學科學院細胞庫中心,實驗使用第2、3代細胞。HK-2細胞株生長于含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養(yǎng)液中(D-葡萄糖濃度5.5mmol/L),置于含5%CO2濃度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培育,每3~4天用0.25%胰酶消化傳代,待細胞生長至亞融合狀態(tài)時,一部分接種于96孔細胞培養(yǎng)板,接種密度為1×105個/m l,待細胞貼壁后,改用無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h使細胞同步化后,棄去舊的培養(yǎng)液后用于下一步實驗;一部分直接更換為無血清DMEM培養(yǎng)基使細胞生長同步化24 h,用于下一步實驗。

    1.2 實驗分組

    1.2.1 細胞增殖檢測 ①正常對照組(N組):培養(yǎng)基中含有生理濃度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖組(G組):培養(yǎng)基D-葡萄糖濃度為30 mmol/L;③脂聯(lián)素組(A組):在G組的基礎(chǔ)上加入外源性ADPN,使ADPN濃度達2.5μg/ml。

    1.2.2 Caspase3表達的檢測 ①正常對照組(N組):培養(yǎng)基中含有生理濃度的D-葡萄糖(5.5 mmol/L);②高糖組(G組):培養(yǎng)基D-葡萄糖濃度為30 mmol/L;③脂聯(lián)素組(A組):在G組的基礎(chǔ)上加入外源性ADPN,使ADPN濃度達2.5 μg/ml。

    1.2.3 MTT方法檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期細胞以1×105/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后,改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h,使細胞處于相對靜止期后按如上方法分為3組,每組設(shè)3個復孔,同時設(shè)調(diào)零孔。分別培育24 h、48 h、72 h進行MTT檢測。為排除培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分消耗對結(jié)果的影響,每隔48 h換一次培養(yǎng)液。反應結(jié)束后每孔加入25μl MTT(5 mg/ml)溶液,繼續(xù)孵育4 h,棄上清,每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩30 min后于酶標儀490 nm處測光吸收(OD)值(OD值越大,表明細胞增殖越旺盛)。

    1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)測細胞培養(yǎng)液中caspase-3的水平

    將對數(shù)生長期細胞以1×104/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板中。孵育24 h后,改用無血清培養(yǎng)液孵育24 h,使細胞處于相對靜止期后按以上方法隨機分為三組,每組設(shè)3個復孔,同時設(shè)調(diào)零孔,分別培育24 h、48 h、72 h后收集細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測

    2 結(jié)果

    2.1 高糖對人腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響 24 h、48 h、72 h G組與N組比較細胞增殖受抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);24 h、48 h、72 h G組與N組比較細胞凋亡增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1、2。

    2.2 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞的影響 24 h、48 h和72 h A組與G組比較細胞增殖能力明顯增加(P<0.05);細胞凋亡受抑制。在72 h脂聯(lián)素組細胞增殖旺盛,生長狀態(tài)良好, 呈亞融合狀態(tài)。見表1、2。

    表1 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖的影響(OD值)(±s,n=3)

    表1 脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞增殖的影響(OD值)(±s,n=3)

    注:與對照組相比,*P<0.05;與高糖組相比,#P<0.05

    0.348±0.017 0.558±0.061 0.724±0.011高糖組 0.478±0.006* 0.367±0.014* 0.261±0.011*脂聯(lián)素組 1.026±0.009# 1.237±0.009# 1.977±0.009 24 h 48 h 72 h對照組分組#

    表2 高糖及脂聯(lián)素對人腎小管上皮細胞上清液中caspase-3表達的影響(ng/ml,n=3)

    3 討論

    近年來,糖尿病的患病率逐年升高,已經(jīng)成為一個威脅人類健康的全球性重大疾病。2008年,國際糖尿病聯(lián)合會調(diào)查顯示,目前糖尿病病例數(shù)約為1.9億,帶來了嚴重的社會問題。如何有效治療糖尿病成為科學研究的焦點,而治療糖尿病的關(guān)鍵之一是預防和延緩各種糖尿病并發(fā)癥(如心腦血管疾病、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等)的發(fā)生、發(fā)展。近年調(diào)查及研究表明,糖尿病并發(fā)癥已成為糖尿病患者致殘和致死的主要原因。而糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最嚴重和最常見的慢性并發(fā)癥之一,是終末期腎病(ESRD)的最常見病因[3]。

    糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制目前尚未完全闡明。目前多數(shù)學者認為與遺傳易感性、胰島素抵抗、糖代謝異常、細胞因子、氧化應激以及由此引起的腎臟血流動力學改變等有關(guān)。其主要病理改變是細胞外基質(zhì)(ECM)在腎小管、腎小球的聚集,而最終導致腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化。由于近曲腎小管在腎單位所處的位置特殊和其重吸收功能,腎小管與尿液直接接觸,尿液中的蛋白、細胞因子等有害物質(zhì)可直接引起腎小管上皮細胞損傷、活化及表型轉(zhuǎn)化,并釋放多種炎性因子和生長因子。另外腎臟血流動力學改變、非酶糖化、激素水平異常、蛋白激酶C(PKC)的激活和多元醇途徑等在腎臟小管間質(zhì)病變中也發(fā)揮著重要作用。而腎小管上皮細胞損傷后的改變被認為是腎間質(zhì)纖維化的起始因素,主要因為腎小管上皮細胞在結(jié)構(gòu)上與腎間質(zhì)緊密相連,損傷后可直接參與間質(zhì)炎癥、纖維化、或通過吸引間質(zhì)炎性細胞浸潤和促進間質(zhì)固有細胞增殖,而在間質(zhì)纖維化過程中起重要作用。糖尿病狀態(tài)下,由于尿糖的產(chǎn)生及間質(zhì)組織、腎小管周圍血管中葡萄糖濃度升高,使近端腎小管細胞持續(xù)處于高糖環(huán)境中,誘導細胞凋亡,引起腎小管萎縮,進而發(fā)生腎小管間質(zhì)纖維化,導致不可逆的終末期腎功能衰竭(ESRD)。因而,積極保護腎小管上皮細胞能夠有效延緩腎小管間質(zhì)纖維化,對防治DN的進展有重大意義。

    細胞凋亡主要通過三條基本途徑-死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑完成的。這三條通路的誘因以及起始部分不同,但殊途同歸,最終都引起caspase-3的活化,導致細胞凋亡性死亡。Caspase家族是細胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵元件,其激活或超常表達均會誘發(fā)細胞凋亡[4],而caspase-3是caspase家族中重要成員之一,人caspase-3基因定位于染色體上4q32-4q35.1,其廣泛分布于各種不同類型的細胞中,表達在多種正常組織中,在一些惡性腫瘤的組織中也有表達。正常情況下,它以無活性的前caspase-3形式存在于胞質(zhì)中,當細胞受到凋亡因素刺激時,它會被系列反應激活誘導細胞凋亡。

    本實驗以人近曲腎小管上皮細胞株為研究對象,觀察到在高糖環(huán)境下,隨著時間的延長,腎小管上皮細胞增殖明顯受抑,細胞凋亡增加。說明糖尿病時,高糖是誘導腎小管上皮細胞損傷的主要因素。與Samikkannu等[5]及Xing等[6]的研究發(fā)現(xiàn)一致。即將原代培養(yǎng)的人腎小管上皮細胞短時間暴露于高糖環(huán)境下可產(chǎn)生雙重效應,先出現(xiàn)細胞增殖,隨后細胞凋亡增加。但隨著作用時間的延長,細胞增殖受抑制,至96 h出現(xiàn)細胞增殖停滯的現(xiàn)象,細胞形態(tài)發(fā)生肥大。而在加入脂聯(lián)素干預組中,腎小管上皮細胞的增殖未受抑制,且隨著干預時間的延長細胞增殖能力明顯增加,細胞凋亡減少。說明脂聯(lián)素能促進高糖環(huán)境下腎小管上皮細胞的增殖,延緩其凋亡,減輕細胞損傷,對細胞具有保護作用。

    [1]Mossalam M,Jeonq JH,Abel ED,et al.Reversal of oxidative stress in endothelial cells by controlled released of adiponectin.JControl Release,2008,130(3):234-237.

    [2]Yokota T,Oritani K,Takahashi I,et al.Adiponectin,a newmember of the family of soluble defense collagens,negatively regulates the growth ofmyelomonocytic progenitors and the function ofmacrophages.Blood,2000,96(5):1723-1732.

    [3]Hug C,wang J,Ahmad NS,et al.T-cadherin is a receptor for hexameric and high molecular weight forms of Acrp30/adiponectin.Proc Natl Acad sci USA,2004,101(28):10308-10313.

    [4]Yan Zhang,Cynthia Goodyer,Andren Le Blanc.Selective and protracted apoptosis in Human primary neuronsmicroinjection with active caspase-3,-6,-7and-8.Neurosci,2000,20:8384-8389.

    [5]Samikkannu T,Thomas JJ,Bhat GJ,et al.Acute effect of high glucose on long2term cell growth:a role for transient glucose increase in proximal tubule cell injury.Am JPhysiol Renal Physiol,2006,291(1):162-175.

    [6]Xing L,Muxun Z.Expression of c-met stimulated by high glucose in human renal tubular epithelial cells and its implication.Huazhong Univ Sci TechnologMed Sci,2007,27(2):161-163.

    030001 山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院內(nèi)分泌科

    李興 E-mail:lixinglaoshi@yahoo.com.cn

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