猴腺病毒研究進展

張榮建，賀爭鳴（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

1 猴腺病毒的發(fā)現(xiàn)及分類

猴腺病毒（simian adenovirus，SAdV）是1956年 Hull等［1］人在美國用東南亞猴的腎細胞制造和檢定小兒麻痹癥疫苗時，首次分離獲得的。隨后Hoffert［5］等人也在猴子中檢測到這些病毒。SAdV中許多是在脊灰疫苗生產(chǎn)和檢定過程中從猴細胞培養(yǎng)物中分離得到的［6］。目前，根據(jù)血清學分類至少有25種猴腺病毒（SAdV-1～25），SAdV-1～20血清型來自獼猴、食蟹猴、綠猴、狒狒等舊大陸猴，SAdV-21～25源自黑猩猩、大猩猩等新大陸猴。根據(jù)血凝性將靈長類腺病毒分為人的HAdV-A～G七個亞群和猴的一個亞群 SAdV-A，其中 HAdV-E （HAdV-4、SAdV-22～25）、HAdV-G（HAdV-52、SAdV-1、SAdV-7）亞群中多數(shù)為猴腺病毒，還有一些分支的SAdV簇尚未被分類［7］。

早期對SAdV的基因組學研究很少，直到近年來替代載體系統(tǒng)的發(fā)展，人們才對非人靈長類腺病毒的研究興趣日趨濃厚。SAdV-21～25、SAdV-1、SAdV-3等毒株相繼被測序，并解析了其基因組結(jié)構(gòu)。SAdV-1（34450 bp）與SAdV-3（34425 bp）大小相似，比HAdV-40（34214 bp）、HAdV-12（34125 bp）大，這四種病毒在靈長類腺病毒的巨大基因組中以基因組最小為特征［6］。系統(tǒng)發(fā)生分析表明，感染黑猩猩、大猩猩的SAdV和HAdV-BE亞群高度同源而與感染恒河猴等舊大陸猴的 SAdV（它們看起來與HAdVAF亞群關(guān)系較近）進化發(fā)生距離較遠［8、20］。有報道認為感染恒河猴的 SAdV為靈長類腺病毒進化早期的分支，可能與 HAdV有共同祖先［8］。利用Megalign軟件比對5種舊大陸猴SAdV六鄰體一段序列，建立進化樹（如圖1）。

由圖1知，可查到序列的5株舊大陸猴 SAdV中有兩個較大的分支，一簇為 SAdV-1、7、20，代表HAdV-GF亞群，另一簇為SAdV-3、6代表SAdV-A亞群。目前感染恒河猴、食蟹猴的主要為HAdV-G、SAdV-A亞群［7］。

2 猴腺病毒的生物學特性

（1）形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖1 五株舊大陸猴SadV的進化發(fā)生樹（Megalign軟件比對六鄰體基因一段序列（346nt）建立進化樹，序列來自GenBank中）Fig.1 Phylogenetic tree of five old wold monkeys adenovirus strains.（The tree was reconstructed from an alignment of the part sequence of hexon gene（346nt）by Megalign，all sequence form GenBank）

電鏡下，SAdV呈二十面體球形，無囊膜，直徑70～80 nm。衣殼外有寬2 nm，長約10～31 nm的纖維突起，內(nèi)含線狀雙鏈DNA和核心蛋白形成的髓芯。衣殼由252個殼粒組成，這些殼粒呈棱柱狀排列在三角形的面上，每邊六個，其中240個為六鄰體，12個為五鄰體基底。每個五鄰體基底上結(jié)合著一根纖維突起，纖維頂端的球形區(qū)在感染細胞時與細胞受體結(jié)合。病毒粒子在感染細胞核內(nèi)常呈晶格狀排列［9、10］。

（2）基因組結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄

SAdV的基因組大小差異較大，其中恒河猴腺病毒較小約34kb，而黑猩猩腺病毒較大約36 kb，與人的相近。SAdV具有哺乳動物腺病毒屬的一般基因組特征（結(jié)構(gòu)如圖2）［6］，兩端為40～200 bp的末端反向重復序列（ITR），內(nèi)部分為5個早期轉(zhuǎn)錄單位（E1A、E1B、E2、E3、和E4）、兩個即早期轉(zhuǎn)錄單位（pⅨ和Iva2）以及一個晚期轉(zhuǎn)錄單位（L1～L5）。此外，病毒基因組中還存在一個或兩個VA-RNA基因［9，11］。VA-RNA基因數(shù)量、E3和 E4區(qū)在不同腺病毒亞群間變化較大［8］。多數(shù)恒河猴腺病毒有一個VA-RNA基因，而猩猩腺病毒有兩個［11］。

圖2 SAdV-1基因組結(jié)構(gòu)（每一刻度為5 kb，陰影示E1A、E1B、E3和E4區(qū)，選自Ga＇bor M.Kova＇cs，etal./Journal of General Virology）Fig.2 Genetic content of SAdV-1.（The genome is depicted as a central horizontal line marked at 5 kbp intervals，with the E1A，E1B，E3 and E4 regions shaded，form Ga＇bor M.Kova＇cs，etal./Journal of General Virology）

ITR序列長度不一，因不同株型而異，是病毒DNA復制起始子和一些順式激活序列所在區(qū)域?；蚪M左端載有包裝信號，ITR和包裝信號是腺病毒基因組復制和病毒包裝必不可少的順式作用元件。5＇端有共價結(jié)合的末端蛋白（TP），可作為引物啟始病毒基因組的復制，且與病毒的感染有關(guān)，含TP的 DNA感染性可提高100倍［10］。發(fā)生在病毒復制前的轉(zhuǎn)錄稱為早期轉(zhuǎn)錄，表達大量早期蛋白來調(diào)整細胞狀態(tài)為病毒復制提供有利微環(huán)境（主要涉及E1A、E1B產(chǎn)物功能），抑制宿主細胞抗病毒的防御體系（以E3和VA-RNA為主）［9］，并激活晚期啟動子表達結(jié)構(gòu)蛋白，為病毒組裝和成熟做準備。復制后，晚期基因由主要晚期啟動子（MLP）起始，轉(zhuǎn)錄出長達20 kb的原初轉(zhuǎn)錄物，后根據(jù)腺苷?；稽c的差異，經(jīng)過剪切加工最終形成18種不同的mRNA。根據(jù)剪切方式和終止位點的不同，可分為5組：L1（52K、p IIIa）；L2（III、pⅦ、V）；L3（pVI、hexon、protease）；L4（100K、33K、pVIII）；L5（Fiber1、Fiber2）［9、10、12］，如圖 2。SAdV-1有兩個 Fiber基因與HAdV4041相似，而SAdV-3只有1個。

晚期基因編碼病毒包裝所需結(jié)構(gòu)蛋白，基因結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定。其中hexon基因部分序列進化上高度保守，常被用于系統(tǒng)進化發(fā)生分析，也是PCR檢測引物設(shè)計的常用序列。此外，pol、DBP、ptp基因進化上也比較保守。

（3）衣殼蛋白結(jié)構(gòu)與抗原性

衣殼蛋白主要包括六鄰體（hexon）、五鄰體（penton）、纖維蛋白（fiber）等。六鄰體蛋白是病毒顆粒中最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白，為同源三聚體，單體的中部和C端較保守，有7個高變區(qū)（HVR），HVR2～5和HVR6位于蛋白分子表面。六鄰體蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生中和抗體以及群和型特異性抗體［9］。對六鄰體而言，型特異性表位位于表面，而內(nèi)部保守的抗原，對衣殼結(jié)構(gòu)形成至關(guān)重要，因此有很廣泛的群特異性。群特異性六鄰體抗體已作為一般腺病毒診斷試劑被廣泛應(yīng)用［13］。六鄰體蛋白的Loop1、Loop2是較好的中和抗原決定簇，因此對這段基因的克隆、表達、純化，有利于其免疫學研究。但也有研究表明，存在于血清中的抗體僅與三聚體六鄰體反應(yīng)，而不結(jié)合六鄰體多肽鏈［14］。

纖維蛋白也為同源三聚體，它的結(jié)構(gòu)可分為尾、桿及球形區(qū)3部分，N端尾部與五鄰體基底相連，較保守；桿端一般由多個含15個氨基酸殘基的重復亞單位構(gòu)成［10］；球形區(qū)為功能區(qū)，可與宿主細胞受體結(jié)合，血凝素也位于球形區(qū)。纖維蛋白遠端具有型特異性而尾部有亞群特異性。五鄰體基底，是多肽Ⅲ的五聚物，與三聚體纖維蛋白結(jié)合形成五鄰體復合物，封閉衣殼上的12個頂點，具有群特異性［1，10，15］。首先，纖維蛋白的球形區(qū)與細胞受體結(jié)合使病毒粘附到細胞上，再通過五鄰體基底與細胞表面整合蛋白的相互作用，觸發(fā)細胞膜通透性使病毒內(nèi)化進入宿主細胞［13，15］。

3 猴腺病毒的感染特點

SAdV具有明顯組織嗜性和細胞依賴性，易產(chǎn)生細胞病變（CPE），感染猴多為隱性感染，可時常從糞便中檢出感染性的SAdV［2］。少數(shù)毒株引起呼吸道疾病，腹瀉、肺炎、結(jié)膜炎等。宿主以體液免疫應(yīng)答為主，產(chǎn)生 anti-Hexon、anti-Fiber和 anti-penton3種中和抗體［13］。一些 SAdV毒株接種新生倉鼠可引起腫瘤［7］。

組織培養(yǎng)研究表明，SAdV對宿主動物源性的細胞最為敏感，可在猴腎原代或傳代細胞中增殖，一般不感染異種動物細胞。但猩猩腺病毒與人腺病毒關(guān)系親密，可能源自同一祖先，也可感染人的細胞系。病變特征為細胞變圓，并形成葡萄串狀團聚塊，核內(nèi)出現(xiàn)許多小的嗜酸性包涵體，出現(xiàn)于上毒后3～4 d［1］。有文獻報道，SAdV在猩猩和恒河猴健康種群中普遍流行，糞便中檢出率高，相比之下人糞便中則很少見［2］。猴免疫應(yīng)答以體液免疫為主，產(chǎn)生的中和抗體親和力高于人的，而細胞免疫則沒有人的精細高效，SAdV可能通過E3的調(diào)控機制逃避免疫。SAdV可能感染猴小腸上皮細胞，造成SAdV慢性感染并由腸道持續(xù)向外排毒，而人腺病毒則被抑制在很低的水平。另外，在感染 SIV的長尾猴中SAdV的檢出率明顯提高，SIV-SAdV協(xié)同感染在SIV陽性猴中很普遍，相似的報道也出現(xiàn)在人中，免疫不完全的人群 HAdV的檢出率更高［3］。

SAdV在猩猩種群中的高度流行及與HAdV十分相近的親緣關(guān)系，表明存在由猩猩傳染給人的潛在風險。但經(jīng)過對50位動物工作者血清的檢測未發(fā)現(xiàn)SAdV中和抗體。盡管恒河猴SAdV的感染率更高，但與人的進化距離遠，不太可能傳染給人［2］。盡管如此，已從腸胃炎病人中分離出來一株類似恒河猴 SAdV-1的毒株［2］，全基因組一致性高達97％，但其抗體不能中和SAdV-1。

目前感染恒河猴、食蟹猴的主要為 HAdV-G、SAdV-A亞群，據(jù)文獻報道腹瀉猴糞便樣本中，腺病毒抗原陽性約占21％，PCR陽性占46％［7、18］，也有調(diào)查顯示新鮮糞便中，SAdV PCR陽性率高達67％［2］。血清學檢測我國云南某地區(qū)野生成年恒河猴群中，抗體陽性率甚至高達80.8％［16］。非人靈長類中腺病毒的高感染率表明可利用非人靈長類作為腺病毒感染動力學研究的模型，并用于檢測腺病毒疫苗臨床前的有效性和安全性［3］。此外在猴源性生物制品的檢定中SAdV污染應(yīng)引起我們的注意。

4 猴腺病毒的檢測

加強實驗用猴和猴源性生物制品的病毒檢測不僅可以保證疫苗等生物制品的安全性，提高實驗用猴質(zhì)量，同時也減少了人類感染動物源性病毒的潛在風險。傳統(tǒng)SAdV的檢測方法是收集標本進行病原分離培養(yǎng)，應(yīng)用凝集抑制、免疫熒光、放射免疫、限制性內(nèi)切酶分析等方法［4、6］，不僅費時費力，其結(jié)果準確性也不高。目前還沒有檢測 SAdV的ELISA商業(yè)化試劑盒，為了研究非人靈長類中腺病毒的感染流行情況，檢測人腸道腺病毒（HAdV-40 41）的ELISA試劑盒被應(yīng)用于研究，并首次在橄欖色狒狒、長尾猴中檢測到腺病毒，感染率分別為52.9％、48.9％［3］。ELISA簡便、快捷，提高了檢測的準確性。但SAdV與HAdV的抗原結(jié)構(gòu)和免疫應(yīng)答不盡相同且血清型多，因此可能漏檢。目前，國內(nèi)外建立了一系列高敏感度的對人腺病毒（HAdV）的檢測方法和分型方法，如 Nested-PCR、熒光定量PCR、多重 PCR等［17］，這對檢測動物 SAdV感染情況以及分析猴源性生物制品（如減毒活疫苗）的SAdV污染情況具有一定的借鑒意義。

在最近的一些研究中，為了更精確的檢測SAdV的流行情況運用了 PCR技術(shù)。K.Ba＇nyai［7］等人特異性針對hexon保守序列設(shè)計引物，擴增產(chǎn)物大小約300 bp并通過測序和系統(tǒng)進化分析所擴增片段描述了一些SAdV的分子生物學特征。結(jié)果表明在中國一個大的靈長類棲息地發(fā)現(xiàn)了不尋常的高流行率和SAdV的基因多樣性，并分離了一些新的SAdV毒株，是否代表新的 SAdV亞群需進一步確定。而 Soum itra Roy［2］等人特異性針對 pol保守序列設(shè)計了嵌套引物，用于特異性的診斷由腸道脫落的SAdV，提高了敏感度，檢出率高達67％，比一般PCR檢出率高。國外文獻報道中，還應(yīng)用了透射電子顯微術(shù)，免疫熒光檢測、核酸雜交等方法［18、19］，在分析動物 SAdV感染狀況和檢測生物制品SAdV污染時，適當?shù)穆?lián)合運用各種檢測方法對SAdV的綜合評估非常重要。隨著快速敏感、簡便準確的SAdV檢測方法的建立，將會發(fā)現(xiàn)更多新的SAdV毒株。

5 總結(jié)

近年來隨著猴腺病毒替代載體系統(tǒng)的發(fā)展，SAdV在實驗用猴中的感染流行情況開始受到關(guān)注。最新調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SAdV在非人靈長類中高度流行，可能存在由人到猩猩傳播感染［2、4］。獼猴群中感染率更高，且曾在生產(chǎn)用猴腎細胞和脊灰減毒疫苗檢定中分離出一些 SAdV毒株［1、6］。不斷探索敏感性更高、特異性更好的SAdV檢測方法，對于監(jiān)控SAdV傳播和保證猴源性生物制品安全具有深遠意義。

［1］殷震.劉景華.動物病毒學（第二版）［M］.北京：科學出版社.1997：1104-1113.

［2］Soumitra R，Luk HV，Sergey K，et al.Isolation and Characterization of Adenoviruses Persistently Shed from the Gastrointestinal Tract of Non-Human Primates［J］.PLoS Pathogens，2009，e1000503.

［3］Mwenda JM，Nyachieo A， Langat DK， et al.Serological detection of adenoviruses in non-human primatesmaintained in a colony in kenya［J］.East A frican Medical Joural，2005，82：371 -375.

［4］Suxiang T，Jatinder S，Susan R，et al.Short Report：Identification of Adenoviruses in Fecal Specimens from W ild Chimpanzees （Pan trogylodytes schweinfurthii）in Western Tanzania［J］.Am J Trop Med Hyg，2010，82（5）：967-970.

［5］HoffertWR，Bates ME，Cheever FS.Study of enteric viruses of simian origin［J］.Am JHyg，1958，68：15-30.

［6］Gabor MK，Balazs H，Alexander N，et al.Comp lete genome sequence of simian adenovirus 1：an Old World monkey adenovirus with two fiber genes［J］.Journal of General Virology，2005，86：1681-1686.

［7］Banyai K，Esona MD，Liu A，et al.Molecular detection of novel adenoviruses in fecal specimens of captive monkeys with diarrhea in China［J］.Veterinary Microbiology，2010，142：416-419.

［8］Gabor MK，Andrew JD，Alexender N，et al.Analysis of the first comp lete genome sequence of an Old World monkey adenovirus reveals a lineage distinct from the six human adenovirus species［J］.Journal of General Virology，2004，85：2799-2807.

［9］金奇，畢勝利，董關(guān)木等.醫(yī)學分子病毒學［M］.北京：科學出版社.2001.692-708.

［10］戴志紅，謝磊，趙耘.腺病毒的生物學特性［J］.中國獸藥雜志.2007.41：36-39.

［11］Kidd AH， Garwicz D， Oberg M.Human and simian adenoviruses：Phylogenetic Inferences from Analysis of VA-RNA Genes［J］.Virology，1995，207：32-45.

［12］Soumitra R，Guangping G，David SC，et al.Complete nucleotide sequences and genome organization of four chimpanzee adenoviruses［J］.Virology，2004，324：361-372.

［13］Russell WC.Update on adenovirus and its vectors［J］.Journal of General Virology，2000，81：2573-2604.

［14］金玉霞.腺病毒六鄰體蛋白的免疫學研究進展［J］.國外醫(yī)學免疫學分冊，2002，25：172-173.

［15］W.C.Russell.Adenoviruses：update on structure and function［J］.Journal of General Virology，2009，90：1-20.

［16］周亞敏，李紹東，段幸生.云南省野生恒河猴三種病毒血清抗體的初步調(diào)查［J］.云南大學學報（自然科學版），1998，20： 145-147.

［17］李文貴，俞乃勝.核酸擴增技術(shù)在人腺病毒診斷檢測的研究進展［J］.中國人獸共患雜志，2001，17：78-81.

［18］Yuhuan W，Xinming T，Charles H，et al.Detection of viral agents in fecal specimens ofmonkeys with diarrhea［J］.JMed Primatol，2007，36：101-107.

［19］Kim CS，Sueltenfuss EA，Kalter S.Isolation and characterization of simian adenoviruses isolated in association with an outbreak of pneumoenteritis in vervetmonkeys［J］?.Adenoviruses and vervet pnevmonitis.292-300.

［20］Soumitra R，Guangping G，David SC，et al.Complete nucleotide sequences and genome organization of four chimpanzee adenoviruses［J］.Virology，2004，324：361-372.