IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的建立和表型分析

楊 青，全雄志，廉 虹，張 旭，馬春梅，張連峰

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

白介素最早發(fā)現(xiàn)在白細(xì)胞中表達(dá)作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞，可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，不但參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答還廣泛參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理病理過程。迄今發(fā)現(xiàn)并命名的白介素家族的成員共有37種，它們存在于多種組織中，具有廣泛的生物學(xué)活性。白介素34（Interleukin34，IL34）是2008年Haishan Lin等發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子［1］，它可以與在單核細(xì)胞表面的表達(dá)的集落刺激因子受體（colony stimulating factor 1 receptor，CSF1R）結(jié)合，促進(jìn)骨髓中巨噬細(xì)胞集落的形成。IL34在脾中有高表達(dá)，提示該基因?qū)γ庖呦到y(tǒng)有一定的作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人IL34基因轉(zhuǎn)入C57BL/6J小鼠，建立了人IL34轉(zhuǎn)基因小鼠，為進(jìn)一步研究 IL34的作用建立了模型。

1 材料和方法

1.1 IL34表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

從Origene公司購(gòu)買人IL34質(zhì)粒，以EcoRⅠ和NotⅠ酶切質(zhì)粒，膠回收IL34基因片段，然后將該片段插入到從Origene公司購(gòu)買的pCMV-MIR載體中CMV啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建 IL34轉(zhuǎn)基因載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后，用 Tth111I將其線性化，SephedexG50柱純化 DNA片段，獲得 CMV啟動(dòng)的IL34基因的轉(zhuǎn)基因片段，注射前將轉(zhuǎn)基因片段的濃度調(diào)整至5 ng/uL，用顯微注射法［2］將線性化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購(gòu)自康藍(lán)公司［SCXK（京）2004001］），用ICR小鼠作假孕受體（本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)），制備轉(zhuǎn)基因小鼠（TE2000-U顯微注射儀）。實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為GC-08-2036。

1.2 PCR鑒定IL34轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標(biāo)記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［3］，用PCR檢測(cè)IL34轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR引物為（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司，中國(guó)），PCR試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司，中國(guó)。PCR 上游引物為 5＇GTCAATGGGTGGAGTATTTACG，下游引物為 5＇GCTTATATAGACCTCCCACCGT。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。IL34片段為386 bp。

1.3 W estern b lotting鑒定IL34基因在蛋白水平的表達(dá)

選用1月齡的轉(zhuǎn)基因陽性和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，迅速取出脾組織置勻漿器中，加入1 m L的RIPA蛋白裂解液，將組織勻漿破碎后靜置30 m in，然后4℃，1300 rpm離心30 min，取上清液即為脾組織總蛋白。BCA法測(cè)定濃度，取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉30 m in。用 TBST以1：1000濃度稀釋棉羊抗人IL34單抗，將一抗與膜封入雜交袋中，4℃過夜。棄去一抗，TBST洗膜3次，每次10 min。用TBST以1：20000濃度稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗綿羊 IgG，同時(shí)加入 β-actin抗體于雜交盒中，放入膜，室溫?fù)u床孵育1 h。棄去二抗TBST洗膜3次，每次10 min。將膜至于化學(xué)發(fā)光劑中，曝光、顯影及定影。

1.4 IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的病理學(xué)檢測(cè)

選用2月齡IL34轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠，頸椎脫臼法犧牲小鼠，取心、肝、脾、肺、腎、腦及小腸等重要器官然后用10％福爾馬林溶液中固定48 h，進(jìn)行取材、脫水、包埋、切片、HE染色及光鏡下觀察（Nikon顯微鏡，日本）。

2 結(jié)果

2.1 IL34表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

從Origenen購(gòu)買的人IL34質(zhì)粒（GenBank No.NM_152456）。將該基因酶切回收后插入從Origene公司購(gòu)買的pCMV-MIR載體中CMV啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建IL34轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體（圖1）。

圖1 IL34轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig.1 IL34 transgenic construct

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，轉(zhuǎn)入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生后9 d提取基因組DNA，用PCR擴(kuò)增IL34目的基因386 bp的片段來鑒定IL34轉(zhuǎn)基因小鼠（圖2），共得到5只首建鼠，均可傳代，留下兩個(gè)表型明顯的保種。

2.2 W estern b lotting檢測(cè)IL34基因在蛋白水平的表達(dá)

分別提取出生1月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠的脾組織總蛋白，用人 IL34單克隆抗體進(jìn)行Western blotting分析，結(jié)果顯示有 2個(gè) Founder的F1代有人 IL34高表達(dá)，分別為13和24首建鼠。IL34蛋白分子量大小為27×103。

圖2 PCR鑒定IL34轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的凝膠電泳分析1、空白對(duì)照；2、陰性對(duì)照；3、陽性對(duì)照； 4、DNA分子量標(biāo)記DL2000；5、6、8、10、12 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠；7、9、11 F1代陰性小鼠Fig.2 Genotyping of the transgenic mice with PCR Lane 1 was blank control；Lane 2 was negative control； Lane 3 was positive control；Lane 4 was DNA molecular weightmarker（DL2000）；Lane 5，6，8，10 and 12 werethe positive transgenic mice；Lane 7，9 and 11 were negative controls

圖3 人IL34蛋白在IL34轉(zhuǎn)基因小鼠脾組織中的表達(dá)1號(hào)野生型小鼠；2、3號(hào)陽性小鼠；用β-actin作為內(nèi)對(duì)照Fig.3 The column Fig.re of different lesions in different age groups Expression of human IL34 in the transgenic spleen The Lane 1 was the wild type spleed.The lane 2 and 3 were samples from the transgenic spleed of founder 13 and founder 24.The same NC membrane was normalized withβ-actin

2.3 病理學(xué)檢測(cè)

將2月齡IL34轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠的重要器官進(jìn)行病理解剖，HE染色高倍鏡下可觀察到IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟中白髓比較活躍，白髓范圍比對(duì)照鼠大（彩插4圖 4），其他組織沒有明顯變化。

3 討論

白介素最早發(fā)現(xiàn)其主要作用是激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)過程。但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)白介素還廣泛地參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理病理過程。白介素的重要作用越來越受到研究者們的關(guān)注，迄今為止人們發(fā)現(xiàn)并命名了37種白介素細(xì)胞因子［4］。IL34是2008年Haishan Lin等［1］發(fā)現(xiàn)的又一白介素家族成員，它可以與CD14+單核細(xì)胞特異性結(jié)合，促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖和分化。通過功能篩選還證明了IL34是 CSF1R的配體，和CSF1R另一個(gè)配體巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage-colony stimulating factor，M-CSF1）的功能相似，IL34也能刺激骨髓中單核母細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化［5］。M-CSF在炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中起著非常重要的作用，在各種炎性和自身免疫性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［6］、腎炎［7，8］、肺炎［9］、動(dòng)脈粥樣硬化［10］、骨巨細(xì)胞瘤［11］等重大疾病中都起到了重要的作用。IL34是近兩年才發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，生物活性與 MCSF相似［12］，但促巨噬細(xì)胞分化的能力低于 MCSF，且其功能以及對(duì)各種疾病的調(diào)節(jié)作用還未明確。最近兩年對(duì) IL34的研究都是集中在體外研究或者使用重組 IL34進(jìn)行體內(nèi)研究［13］，而且其使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了機(jī)體內(nèi)的生理濃度，維持時(shí)間短等特點(diǎn)，因此我們建立了 IL34轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究?jī)?nèi)源性IL34對(duì)機(jī)體的作用提供了很好的模型。

在本研究中，首建鼠F13和F24的后代小鼠，PCR結(jié)果顯示了外源基因能穩(wěn)定地按孟德爾規(guī)則傳遞到下代。Western blot結(jié)果顯示IL34基因的表達(dá)量在F13和F24轉(zhuǎn)基因小鼠的脾組織中與野生型小鼠的相比顯著增高，表明成功建立了IL34轉(zhuǎn)基因小鼠。通過病理學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL34轉(zhuǎn)基因小鼠的脾臟的白髓區(qū)域比較活躍，白髓范圍比野生型小鼠的大。說明免疫細(xì)胞增生活躍，提示IL34對(duì)免疫系統(tǒng)有一定的作用，但其機(jī)制尚未清楚。因此，IL34小鼠的建立，為進(jìn)一步對(duì)內(nèi)源性IL34的生物學(xué)功能及對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用機(jī)制提供很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Lin H，Lee E，Hestir K，et al.Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome［J］.Science 2008，320：807-811.

［2］Gordan J， Ruddle F. Integration and stable germ line transmission of genes injected intomouse pronuclei［J］.Science，1981，214（4526）：1244-1246.

［3］Chishti M，Yang D，Janus C，et al.Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid presursor protein695［J］.J BiolChem，2001，276（24）：21562-21570.

［4］Nold M，Nold-Petry C，Zepp J，et al.IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity［J］.Nat Immunol.2010，11（11）： 1014-22.

［5］Marc Baud H，Romain R，C＇eline C et al.Interleukin-34 is expressed by giant cell tumours of bone and plays a key role in RANKL-induced osteoclastogenesis［J］.JPathol 2010，221：77 -86

［6］Bischof R，Zafiropoulos D，Hamilton J，et al.Exacerbation of acute inflammatory arthritis by the colony-stimulating factors CSF-1 and granulocyte macrophage （GM）-CSF： evidence of macrophage infiltration and local proliferation［J］.Clin.Exp.Immunol.2000，119：361-367.

［7］Lenda D，Kikawada E，Stanley E，et al.Reduced macrophage recruitment，proliferation，and activation in colony-stimulating factor-1-deficient mice results in decreased tubular apoptosis during renal inflammation［J］.J Immunol.2003，170：3254-3262.

［8］Le Meur，Y.et al.Macrophage accumulation at a site of renal inflammation is dependent on the M-CSF/c-Fms pathway［J］.J.Leukocyte Biol.2002，72：530-537.

［9］Baran C.et al.Important roles formacrophage colony-stimulating factor，CC chemokine ligand 2，and mononuclear phagocytes in the pathogenesis of pulmonary fibrosis［J］.Am.J.Respir.Crit.Care Med.2007，176：78-89.

［10］Isabelle B，Seraya M，HervéD，et al.Antagonistic regulation of macrophage phenotype by M-CSF and GM-CSF：Implication in atherosclerosis［J］.Atherosclerosis.2011，214（2）：316-24.

［11］Niida S，Kaku M，Amano H，et al.Vascular endothelial growth factor can substitute for macrophage colony-stimulating factor in the support of osteoclastic bone resorption［J］.JExp Med 1999； 190：293-298.

［12］Suwen W，Sayan N，Violeta C，et al.Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation ofmyeloid cells［J］.JLeukoc Biol.2010，88（3）：495-505.

［13］Eda H， Zhang J， Keith RH， et al. Macrophage-colony stimulating factor and interleukin-34 induce chemokines in human whole blood［J］.Cytokine.2010，52（3）：215-20.