軸突生長抑制因子重組疫苗預(yù)防免疫減輕阿爾茨海默癥模型小鼠行為學(xué)損傷

張玲玲，馬全紅，楊武林，劉 穎，馬春梅，黃 瀾，徐艷峰，朱 華，鄧 巍，肖志成，秦 川

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021；2.蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所，蘇州 215123；3.蒙納士大學(xué)免疫干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，維多利亞，澳大利亞 3800；4.昆明醫(yī)學(xué)院分子臨床醫(yī)學(xué)研究所，昆明 650031）

阿爾茨海默癥（A lzheimer＇s disease，AD）又名老年癡呆癥是引發(fā)癡呆的最常見疾病。隨著人口老齡化的加重，阿爾茨海默癥越來越受到人們的重視。雖然目前有大量阿爾茨海默癥的相關(guān)研究報(bào)道但并未闡明該病病因機(jī)理，而一系列藥物也并不能起到實(shí)質(zhì)性治療作用。軸突損傷，神經(jīng)元丟失不可再生是老年癡呆癥患者學(xué)習(xí)記憶漸進(jìn)性損傷并最終導(dǎo)致癡呆的直接原因。而腦內(nèi)神經(jīng)元不可再生主要是由腦內(nèi)環(huán)境造成的，其中髓鞘相關(guān)軸突生長抑制因子蛋白（NGI）在抑制神經(jīng)元，軸突再生過程中扮演重要角色［1-3］。NGI是一系列以抑制軸突生長為主要功能的蛋白。軸突生長抑制因子蛋白重組疫苗能夠促進(jìn)脊髓橫斷損傷小鼠軸突生長，恢復(fù)脊髓功能［4-5］，該研究結(jié)果為該疫苗在神經(jīng)退行性變疾病中的應(yīng)用提供了可能。基于以上研究，本研究構(gòu)建NGI重組疫苗并觀察NGI重組疫苗對阿爾茨海默癥轉(zhuǎn)基因模型小鼠的預(yù)防效果。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒

NGI重組DNA質(zhì)粒包含小鼠 Tenascin-R（TNR）和Tenascin-C（TN-C）蛋白的表皮生長因子樣區(qū)域，以及人受體樣蛋白酪氨酸磷酸酶β的cDNA，每個(gè)亞克隆序列末端加入三個(gè)丙氨酸作為連接［6］。以上三個(gè)片段順次連接后經(jīng) Bg1II和 XbaI酶切位點(diǎn)插入 pcDNA3.1+載體（pcDNA-NGI），產(chǎn)物經(jīng)過PCR和測序驗(yàn)證。PcDNA3.1+和pcDNA-NGI質(zhì)粒在大腸桿菌中擴(kuò)增，質(zhì)粒大提試劑盒（美國Promega公司）提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，制備成1μg/μL溶解在磷酸鹽溶液中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組DNA疫苗示意圖Fig.1 recombinant DAN vaccine

1.2 H is蛋白的表達(dá)及純化

設(shè)計(jì)帶有Pet28載體（李萬波教授饋贈(zèng)）限制性酶切位點(diǎn)的 Tenascin R引物，構(gòu)建質(zhì)粒 Pet28-Tenascin R，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 BL21（DE3）細(xì)胞，LB固體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落加入 LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6～0.9，加入終濃度1 mM IPTG，25℃誘導(dǎo)6～8 h，超聲破碎菌體，SDS-PAGE電泳分析蛋白表達(dá)。GE 1m L HP His蛋白純化柱純化蛋白。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠由我所遺傳中心實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該轉(zhuǎn)基因小鼠三月齡出現(xiàn)認(rèn)知行為學(xué)改變，4.5月腦內(nèi)出現(xiàn)老年斑沉積［7-8］。無任何行為學(xué)改變及腦內(nèi)老年斑沉積的4～5周小鼠隨機(jī)分為四組：野生對照組（注射PBS）；模型對照組（注射PBS）；空載體對照組（注射pcDNA3.1質(zhì)粒）；疫苗組（注射pcDNA-NGI）。每組12只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)室溫18℃ ～25℃，相對濕度（30％ ～70％），每日光照12 h，自由攝食引水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用及操作均嚴(yán)格按照中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行（證號ILAS-PL-2010-003）。

1.4 免疫和抗體測定

小鼠免疫采用DNA疫苗肌肉注射免疫，具體如下：4～5周小鼠肌肉注射質(zhì)粒100μg/只，兩周一次，連續(xù)免疫直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。四只小鼠用來進(jìn)行抗體檢測，免疫前及免疫后每兩周取血，分離血清，-80℃凍存，檢測抗體使用。

抗體檢測采用雙夾心Elisa法，具體步驟簡述如下：純化蛋白his-TNR 10 ng/孔包被板（美國corning公司）4℃過夜孵育，5％脫脂奶粉與0.5％BSA混合液37℃1 h封閉，血清樣品1∶200稀釋，37℃1 h孵育，山羊抗小鼠二抗（中衫金橋PS-6002）室溫1 h孵育，TBS發(fā)光液室溫孵育15 min，含有2M硫酸的終止液終止顯色，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)。

1.5 行為學(xué)檢測：M orris水迷宮

利用荷蘭Noldus ethvision XT行為學(xué)分析軟件及監(jiān)測系統(tǒng)對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試與數(shù)據(jù)分析。Morris水迷宮 DMS-2系統(tǒng)由中國科學(xué)院藥物研究所提供，包括一個(gè)圓形不銹鋼水池，直徑100 cm，高50 cm；將水池等分為4個(gè)象限；目標(biāo)象限的中央放置一直徑為9 cm，高27 cm的圓形隱藏平臺，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間其位置保持不變；水池中水面高于平臺且加入奶粉，以隱藏平臺并使水不透明，水溫保持（26±1）℃；實(shí)驗(yàn)期間迷宮外設(shè)足夠的參照物，且始終保持不變。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，Morris水迷宮數(shù)據(jù)采集和分析軟件記錄相關(guān)數(shù)據(jù)及圖象結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程分為隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)兩部分。

1.5.1 隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)：用于測量動(dòng)物在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d。正式實(shí)驗(yàn)每天訓(xùn)練4次，每次60 s，隨機(jī)從東、西、南、北4個(gè)入水點(diǎn)選擇一個(gè)，將動(dòng)物面向池壁放入水中，記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺所需時(shí)間即潛伏期（latency）。如果動(dòng)物在60 s內(nèi)未找到平臺，由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺，潛伏期記為60 s；動(dòng)物在平臺上停留20 s（此種停留對在水中高度緊張的小鼠非常重要，它可避免小鼠再跳回水中，以保證實(shí)驗(yàn)的成功）。每次訓(xùn)練之間和4次訓(xùn)練完成后，迅速將動(dòng)物洗凈擦干，置于加熱器旁，以防動(dòng)物低體溫。每只動(dòng)物共計(jì)訓(xùn)練20次。計(jì)算每天各組4次逃避潛伏期的平均值。

1.5.2 空間搜索實(shí)驗(yàn)：用于測量動(dòng)物對平臺空間位置準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。第6天撤除平臺，任選一個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物放入水中，動(dòng)物在水中游泳60 s，測量60 s內(nèi)：（1）動(dòng)物在目標(biāo)象限（原平臺所在象限）（target quadrant）的游泳時(shí)間；（2）穿越目標(biāo)（原平臺所在區(qū)域及象限）次數(shù)。Noldus ethvision XT行為學(xué)分析軟件記錄數(shù)據(jù)后，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測

在裸DNA免疫兩次后抗體OD平均值由免疫前的0升至0.3并一直維持在0.3左右直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（圖2）。結(jié)果顯示裸DNA疫苗注射在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都產(chǎn)生了有效的抗體。

2.2 水迷宮檢測

5天的隱藏平臺獲得實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因組和空載體組潛伏期雖然在第2，3天縮短，但第4，5天的訓(xùn)練卻出現(xiàn)潛伏期再次延長的現(xiàn)象，表明其學(xué)習(xí)能力受損。疫苗組潛伏期在第3天出現(xiàn)平臺期（較第2天并無縮短）但隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加在第4，5天顯著縮短并較模型對照組和空載體對照組有顯著差異（P＜0.05），疫苗組潛伏期隨訓(xùn)練天數(shù)變化趨勢與野生組一致，表明疫苗對癡呆小鼠的學(xué)習(xí)能力起到了改善作用（圖3）。在探索實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因和空載體組穿越原平臺及原平臺所在象限的次數(shù)，停留時(shí)間均較野生組縮短表明其記憶功能受損。疫苗組穿越次數(shù)增加停留時(shí)間延長表明預(yù)防免疫能夠改善APP/PS1的記憶功能（圖3）。

圖2 抗體動(dòng)態(tài)檢測示意圖Fig.2 Fig.re of antibody

圖3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（*P＜0.05，P＜0.01野生對照組VS雙轉(zhuǎn)對照組；#P＜0.05空質(zhì)粒對照組VS疫苗組）Fig.3 Open field test result（*P＜0.05，WT group vs placebo group；#P＜0.05，vehicle vs vaccine group）

3 討論

阿爾茨海默癥是以神經(jīng)元丟失為病變基礎(chǔ)的神經(jīng)退行性變疾病，神經(jīng)元的損傷不可再生是導(dǎo)致病人出現(xiàn)各種癥狀的根本原因。神經(jīng)元的不可逆性損傷大部分歸咎于髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的軸突生長抑制因子蛋白。Tenascin R，Tenascin C，受體樣蛋白酪氨酸磷酸酶β，均為髓鞘相關(guān)軸突生長抑制因子蛋白［11-12］。髓鞘相關(guān)軸突生長抑制因子重組疫苗能夠應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病治療［1-3，13］，由MAG Ig1-5區(qū)域，TN-R的EGFL區(qū)域，NogoA的66氨基酸胞外區(qū)域及N端構(gòu)成的DNA疫苗能在大鼠體內(nèi)產(chǎn)生有效抗體，促進(jìn)脫髓鞘大鼠的皮質(zhì)脊髓束軸突再生［4］，增加脊髓損傷大鼠體內(nèi)神經(jīng)生長因子蛋白的表達(dá)［5］，并無脫髓鞘副反應(yīng)的產(chǎn)生［4］。本文中我們檢驗(yàn)了軸突生長抑制因子疫苗是否也能有效的改善阿爾茨海默癥的癥狀。DNA疫苗便于構(gòu)建，生產(chǎn)方便，且DNA疫苗注射可產(chǎn)生有效抗體［4］。我們采用裸DNA疫苗連續(xù)注射的免疫方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此方法在免疫期間產(chǎn)生了雖然不高但持續(xù)有效的抗體。APP/PS1雙轉(zhuǎn)小鼠是由過表達(dá)人的 APP swedon雙突變（K594N/ M595L）和 PS1單突變（deltaE9）小鼠雜交而成，兩種突變均為家族性老年癡呆癥的患病基因，雙轉(zhuǎn)小鼠的老年斑隨年齡的增長而不斷增多，學(xué)習(xí)記憶損傷也不斷加重［7-8，9］。行為學(xué)檢測方法水迷宮實(shí)驗(yàn)表明疫苗能有效改善模型小鼠的行為學(xué)損傷。到目前為止針對阿爾茨海默癥的治療藥物只能取得癥狀的改善，疫苗治療也多聚焦于 Aβ蛋白的被動(dòng)或主動(dòng)免疫以期待減少Aβ蛋白的表達(dá)，而對于與老年癡呆癥狀學(xué)習(xí)記憶損傷直接相關(guān)的軸突改善卻被人忽略。本文中髓鞘相關(guān)軸突生長抑制因子重組疫苗預(yù)防免疫能改善模型小鼠的行為學(xué)，可能機(jī)制推測為該疫苗預(yù)防阿爾茨海默癥導(dǎo)致的軸突損傷，為阿爾茨海默癥的免疫治療提供了新契機(jī)。其具體機(jī)制尚待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)中DNA免疫雖產(chǎn)生有效抗體，但需連續(xù)免疫，為疫苗發(fā)展前景帶來阻礙，我們會(huì)進(jìn)一步在免疫劑量，方式方面進(jìn)行改善，期待得到更加有效簡便的免疫方式。另外，本實(shí)驗(yàn)中的疫苗免疫在小鼠產(chǎn)生行為學(xué)癥狀前進(jìn)行，至于該疫苗是否對小鼠有治療效果還需我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

致謝：感謝李萬波教授、劉江寧博士對實(shí)驗(yàn)中質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)純化的幫助和指導(dǎo)。

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