IL-19對(duì)哮喘模型大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響

李年珍，張煥萍，柴景偉，張 彬

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸內(nèi)科，太原 030001）

氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）在哮喘氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑中均具有十分重要的作用。近年來研究表明，ASMCs不僅具有收縮和增殖功能，而且還有分泌功能［1］。ASMCs可分泌一些細(xì)胞因子、炎癥因子和趨化因子，這些介質(zhì)又可作用于ASMCs對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。ASMCs在哮喘的發(fā)病及進(jìn)展中扮演很重要的角色。IL-10在哮喘中的作用比較明確，IL-10對(duì)氣道炎癥起抑制作用。因IL-19與IL-10具有同源性，推測(cè) IL-19也具有和 IL-10相似的生物學(xué)活性［2-4］。關(guān)于 IL-19的生物學(xué)作用尚存在爭(zhēng)議。IL-19對(duì)哮喘的具體作用尚無相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠哮喘模型，培養(yǎng)大鼠葉支氣管ASMCs，用不同濃度的IL-19干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)，觀察ASMCs的增殖的變化。探討IL-19對(duì)體外培養(yǎng)的哮喘平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、Ⅰ型膠原酶（collagenase）為美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物所）；小鼠抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-actin）單克隆抗體購(gòu)自博士德公司；白細(xì)胞介素-19（IL-19）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司。余為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑，分析純。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型的建立 健康雄性 W istar大鼠，體重200～250 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK（普）070101］。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，第1天大鼠腹腔注射含100 mg OVA和200 mg氫氧化鋁的生理鹽水1 m L，同時(shí)腹腔注射百日咳桿菌疫苗1 m L（約6×109個(gè)菌株）作為佐劑，第8天重復(fù)致敏1次，第15天開始激發(fā)，將大鼠置于特制玻璃容器內(nèi)，用超聲霧化器噴入2％OVA生理鹽水50 m L，激發(fā)30 m in，每天1次，激發(fā)8周。激發(fā)后大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等哮喘發(fā)作癥狀。正常大鼠以等量生理鹽水代替OVA注射，并吸入生理鹽水50 mL8周。

1.2.2 ASMCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 參照 Johnson等［5］的培養(yǎng)方法，上述大鼠腹腔注射25％烏拉坦（4 m L/kg）麻醉后，開胸迅速取出肺臟置于預(yù)先冰浴的D-hanks’溶液，在解剖顯微鏡下仔細(xì)分離出葉支氣管，并將支氣管外膜剝離干凈，刮除內(nèi)皮，將獲得的單層ASM在青霉素小瓶中剪成1 mm×1 mm的小塊后，加入1 g/LⅠ型膠原酶，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中消化1 h后加入DMEM液，混勻后用金屬濾網(wǎng)過濾，濾液置離心管內(nèi)1000 r/m in離心6 min。棄上清后，沉淀的細(xì)胞用含20％FBS、青霉素100 U/m L、鏈霉素100 U/m L的DMEM培養(yǎng)液重懸，接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，讓細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)約7～10 d后融合。0.25％胰蛋白酶消化傳代，以含10％FBS、青霉素100 U/m L、鏈霉素100 U/m L的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，每3～4d換液1次，約4～5 d細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代，3～8代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。小鼠平滑肌α-肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定為ASMCs［6］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取第3～8代培養(yǎng)的大鼠氣道平滑肌細(xì)胞，0.25％胰蛋白酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率大于96％。用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)，待細(xì)胞90％融合后，換無血清DMEM培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步于 G0期，換用含 10％FBS的DMEM液，隨機(jī)分為5組：（1）對(duì)照組：培養(yǎng)的正常大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干預(yù)；（2）哮喘組：培養(yǎng)的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中不加任何干預(yù)； （3）、（4）、（5）組分別為不同濃度的 IL-19干預(yù)組：培養(yǎng)的哮喘大鼠 ASMCs，每孔/瓶中分別加入終濃度為1μg/L、10μg/L、100μg/L的 IL-19放入 CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)12 h，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。每4個(gè)復(fù)孔/瓶為一組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

1.2.4.1 流式細(xì)胞儀分析 ASMCs細(xì)胞周期：

ASMCs按106/m L的密度接種于100 cm2的培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)及分組如前述，收集的ASMCs用PBS液配制成濃度為1×106個(gè)/m L的細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的75％乙醇固定，加入 RNA酶、碘化丙啶室溫作用后，用FACSort型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）Cellquest軟件分析細(xì)胞周期中各期所占的百分比。

1.2.4.2 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）微量比色法測(cè)定ASMCs增殖： 96孔板內(nèi)的ASMCs培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔加MTT（5 g/L）20μL，培養(yǎng)4 h后去培養(yǎng)液，加二甲基亞砜150μL振蕩30 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)定各孔A值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件包SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異顯著性檢驗(yàn)采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定

在倒置顯微鏡下，經(jīng)原代培養(yǎng)的 ASMCs呈梭形，有較長(zhǎng)的突起，圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈疏密相間、典型“峰和谷”生長(zhǎng)狀態(tài)（彩插2圖1）。α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。97％細(xì)胞α-actin染色陽(yáng)性，所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞［6］（彩插2圖2）。

2.2 流式細(xì)胞儀分析 ASM Cs細(xì)胞周期

與對(duì)照組ASMCs比較，哮喘組ASMCs的G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少（P＜0.01），S期細(xì)胞所占比例增高（P＜0.01），表明處于有絲分裂期的細(xì)胞數(shù)目增多。而加入不同濃度 IL-19共培養(yǎng) 12 h后，10μg/L、100μg/L IL-19干預(yù)組 S期細(xì)胞所占比例較哮喘組都明顯下降（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）（表1和圖3）。同時(shí)這兩個(gè)濃度IL-19干預(yù)組ASMCs的G0/G1期細(xì)胞所占比例較哮喘組明顯增高（P＜0.01），但仍低于對(duì)照組（P＜0.01）。且上述兩個(gè)指標(biāo)兩個(gè)濃度干預(yù)組間比較有差異（P＜0.01）。但1μg/L IL-19干預(yù)組以上指標(biāo)與哮喘組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 M TT檢測(cè)ASM Cs增殖

與對(duì)照組相比，哮喘組ASMCs A值顯著增加（P＜0.01），10μg/L、100μg/L IL-19干預(yù)組ASMCs A值較哮喘組相比均顯著降低（P＜0.01），但仍高于對(duì)照組（P＜0.01）（表1和圖4）。而1μg/L IL-19干預(yù)組ASMCs A值與哮喘組并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 流式細(xì)胞儀分析各組大鼠氣道平滑肌細(xì)胞周期Fig.3 Analysis of cell cycle of ASMCs by flow cytometry

表1 IL-19對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響（n=3）Tab.1 IL-19effect on cell proliferation of ASMCs in asthmatic rats（n=3）

圖4 MTT法檢測(cè)各組大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖A：對(duì)照組 B：哮喘組 C：1μg/L IL-19組D：10μg/L IL-19組 E：100μg/L IL-19組注：*P＜0.01與對(duì)照組比較；#＊＊P＞0.05與哮喘組比較；#*P＜0.01與哮喘組比較Fig.4 Proliferaion of ASMCs were detected by MTT A：Control group；B：Asthmatic group；C：1μg/L IL-19 group；D：10μg/L IL-19 group；E：100μg/L IL-19 group.Note：*P＜0.01 compared with control group；#＊＊P＞0.05compared with asthmatic group；#*P＜0.01 compared with asthmatic group

3 討論

支氣管哮喘是一種由多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子共同參與并相互作用的氣道慢性炎癥性疾病。在氣道炎癥中，氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）不僅有收縮功能，而且有合成分泌炎癥介質(zhì)的功能。ASMCs在哮喘氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性與氣道重構(gòu)中有重要作用。多種炎癥介質(zhì)和炎性細(xì)胞產(chǎn)物又可作用于ASMCs，對(duì)ASMCs的增殖進(jìn)行調(diào)節(jié)。增殖的ASMCs使氣道壁增厚，導(dǎo)致基礎(chǔ)氣道阻力增加和不可逆性氣流受限的發(fā)生。

白細(xì)胞介素-19（IL-19）是新近發(fā)現(xiàn)的 IL-10超家族成員中的一員。IL-10被廣泛認(rèn)為是系統(tǒng)性的抑制炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子［7］。因 IL-19與IL-10具有同源性［8］，推測(cè)IL-19也具有和IL-10相似的生物學(xué)活性。關(guān)于IL-19的生物學(xué)作用尚存在爭(zhēng)議。在Sommerville［9］研究IL-19對(duì)受損血管平滑肌的作用過程中，發(fā)現(xiàn)在它可使受損血管平滑肌增殖減少。但它對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的作用目前還尚無報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：一定濃度 IL-19可使慢性哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖減弱，處于增殖期的細(xì)胞數(shù)目減少。提示IL-19對(duì)體外培養(yǎng)的哮喘氣道平滑肌細(xì)胞有抑制增殖的作用。這與IL-19可使受損血管平滑肌增殖減少的報(bào)道一致。我們還發(fā)現(xiàn)隨著IL-19干預(yù)濃度的增高，處于增殖期的細(xì)胞比例逐漸減少但仍高于正常對(duì)照組，提示可能所選擇的IL-19干預(yù)濃度仍較低，或者ASMCs上還可能存在其它類型的促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道，有待進(jìn)一步研究。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的 IL-19可以抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖。目前對(duì)于已形成的氣道重塑當(dāng)前尚無特效藥物，大力加強(qiáng)防治哮喘氣道重塑藥物的研究勢(shì)在必行，本課題為哮喘的防治提供了新思路。關(guān)于IL-19抑制哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制還未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。

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