Cu2+和十二烷基硫酸鈉對裸項櫛鰕虎魚仔魚急性毒性影響

王國棟，徐科鳳，黃韌，鄭琰晶，陳 琳，林忠婷

（1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510260；2.青島國家海洋科學(xué)研究中心，青島 266071）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，大量的廢水和廢物排放入海，其中的重金屬在某一區(qū)域積累超過一定濃度時就會對海洋生物造成毒害作用。工業(yè)廢水、生活污水排放、石油泄漏和降雨等是水體中重金屬污染的主要來源［1］。重金屬對海洋生物特別是魚類毒害作用的研究已經(jīng)引起了科學(xué)家們的迫切關(guān)注［2-4］。銅是生物體酶必需的活性因子，其在生物體內(nèi)的含量甚微，但其濃度超過一定水平就會對生物體造成危害［5-7］。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）是常用的陰離子表面活性劑，大量存在于各類洗滌劑和去污粉中，隨生活污水的大量排放，也會對環(huán)境造成一定的危害，同時它也是生化、免疫檢測方面常用的蛋白質(zhì)變性劑，毒性較大［8］，為美國試驗材料協(xié)會（ASTM）推薦的生物毒性試驗方法中常用標(biāo)準(zhǔn)毒物之一［9］。

裸項櫛鰕虎魚（Ctenogobius gymnauchen）為鱸形目（Perciformes）、鰕虎魚亞目（Gobioidei）、鰕虎魚科（Gobiidae）、鰕虎魚亞科（Gobiinae）、櫛鰕虎魚屬（Ctenogobius）的一種小型海洋魚類，分布于我國沿海，南至琉球、菲律賓一帶的礁石或沙泥底質(zhì)淺水區(qū)［10］。因其個體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強(qiáng)，便于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)管理。實驗動物指由人工培育，來源清楚，遺傳背景明確，對其攜帶的微生物和寄生蟲實施監(jiān)控，用于生命科學(xué)研究、藥品與生物制品生產(chǎn)和檢定、水環(huán)境污染評價以及其它科學(xué)研究的動物［11］。鑒于裸項櫛鰕虎魚具有以上特性，故具有較高的實驗動物開發(fā)價值。

2007—2008年度，裸項櫛鰕虎魚被選為 GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法［12］修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測，因此有必要摸清其仔魚對標(biāo)準(zhǔn)毒物的耐受性，從而了解其對有關(guān)毒物的敏感性。其中，關(guān)于裸項櫛鰕虎魚對Cu2+和SDS的適應(yīng)能力在國內(nèi)外尚未見報道。本實驗以不同日齡的裸項櫛鰕虎魚仔魚為研究對象，研究了仔魚在不同濃度 Cu2+和SDS下的存活率，初步探討了其對兩種標(biāo)準(zhǔn)毒物的適應(yīng)性，以期為新國標(biāo)的修訂提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗魚的來源

裸項櫛鰕虎魚親魚采集于深圳大鵬灣沿岸的天然水域，在實驗室內(nèi)經(jīng)人工培育達(dá)到性成熟，進(jìn)行人工繁殖獲得子代，作為本實驗所用仔魚。

1.2 實驗魚的馴化

實驗用仔魚培養(yǎng)箱為白色塑料整理箱（規(guī)格50 cm×30 cm×40 cm），實際用水量40 L。仔魚孵出后投喂經(jīng)小球藻強(qiáng)化的褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）。馴養(yǎng)期間，實驗用水為經(jīng)過砂濾和活性碳處理的自然海水，鹽度變化在32.6～35.3之間，pH變化在7.9～8.4之間，為保證培養(yǎng)箱中溶氧充足，用氣泵24 h充氣。光照和水溫與室內(nèi)自然節(jié)律一致，不進(jìn)行人為控制，水溫變化在 20.8℃ ～26.2℃之間。

1.3 實驗設(shè)計

Cu2+急性毒性實驗設(shè)置了8個 Cu2+濃度水平，為0.012、0.021、0.035、0.06、0.102、0.173、0.294和0.5mg/L，分別以 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8表示；5個不同日齡，為4、8、12、16和20 d，分別以D4、D8、D12、D16和D20表示，二者交叉形成了40個組合，每個組合設(shè)4個重復(fù)。實驗過程中，按照6、12、24、48、72和96 h的時間間隔觀察計數(shù)仔魚的存活數(shù)。

SDS急性毒性實驗設(shè)置了7個SDS濃度水平，為0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5和5 mg/L，分別以S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7表示，每個處理設(shè)四個重復(fù)，實驗用魚為4日齡，實驗過程中，按照24、48、72和 96 h的時間間隔觀察計數(shù)仔魚的存活數(shù)。

1.4 實驗管理

實驗用養(yǎng)殖容器為1 L的玻璃燒杯，將馴養(yǎng)的裸項櫛蝦虎魚仔魚按照隨機(jī)撈取的方式由自然海水轉(zhuǎn)入以上各處理組，每杯放魚10尾，實驗期間保持正常換水，日換水量為1/3，換水前1 d將實驗用水24 h充氣。每天多次投喂褶皺臂尾輪蟲（經(jīng)小球藻和50 DE微囊輪蟲強(qiáng)化餌料強(qiáng)化），密度為10 ind/m L左右。水溫與光照條件與馴養(yǎng)期相同，不進(jìn)行人為控制，實驗期間各燒杯均不充氣。

1.5 存活率的統(tǒng)計

按照實驗設(shè)計時間點(diǎn)記錄各燒杯仔魚的存活數(shù)，并及時吸出死魚。仔魚死亡以魚體發(fā)白、心臟停止跳動為準(zhǔn)。

1.6 計算與數(shù)據(jù)分析

Cu2+急性毒性實驗所得數(shù)據(jù)用方差分析及Duncan多重比較進(jìn)行分析處理，以 P ＜0.05作為差異顯著水平。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以 SPSS10.0軟件進(jìn)行。

SDS的急性毒性試驗的數(shù)據(jù)處理采用概率單位法，根據(jù)死亡率查百分比與概率單位對照表得經(jīng)驗概率單位，以經(jīng)驗概率單位和濃度對數(shù)值作圖，根據(jù)回歸方程計算LC50［13］。

2 結(jié)果

2.1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

不同濃度下，不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚的存活率情況見表1，從中可以看出，Cu2+濃度對仔魚的存活率有顯著性影響（P＜0.05），隨濃度的升高，各組仔魚存活率顯著降低（P＜0.05），當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到0.5 mg/L時，在實驗開始6 h內(nèi)，各組仔魚均全部死亡。整體上，仔魚的存活率隨實驗時間的延長而下降，而隨日齡的增大存活率升高，其中96 h時S7處理組4 d仔魚存活率為0，而此時相同Cu2+濃度下20 d組仔魚的存活率高達(dá)42.5％。

表1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響Tab.1 The effect of Cu2+on survival rate of Bareneck goby larva

2.2 Cu2+對不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚96 h的急性毒性影響

圖1為96 h不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚在不同Cu2+濃度下的存活率，可以看出，各處理組仔魚存活率隨Cu2+濃度的升高而顯著降低（P ＜0.05），0.060 mg/L～0.500 mg/L處理組尤為明顯。整體上看，相同Cu2+濃度下，裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率隨日齡的升高而升高，其中4日齡處理組存活率在各 Cu2+濃度下均比20日齡處理組低40％左右。

2.3 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚的LC50及95％置信限

圖1 96 h時不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚在各Cu2+濃度下的存活率；圖中同一日齡中帶有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著（P＜0.05）Fig.1 The survival rate of different daily age Bareneck goby larva at different Cu2+at 96 h；The data with different letter in the same daily agemeans significant difference each other（P＜0.05）

對裸項櫛鰕虎魚仔魚SDS毒性處理結(jié)果列于表2，24、48、72和96 h的SDS半致死濃度分別為1.278、1.116、0.783和0.432 mg/L，95％的置信區(qū)間分別為0.737～2.215 mg/L、0.626～1.987 mg/ L、0.383～1.603 mg/L和0.292～0.637 mg/L。

3討論

表2 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50及95％置信限Tab.2 LC50 and 95％confidence limits of Bareneck goby larva at different SDS at 24 h、48 h、72 h and 96 h

3.1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

魚類的早期生活史階段是對污染物比較敏感的階段［14］。關(guān)于重金屬對魚類早期生活史階段的毒害效應(yīng)，已有學(xué)者作了一定的工作［15-18］。了解重金屬對海洋魚卵孵化和仔稚魚成活的毒性規(guī)律，對于防止海洋污染，保護(hù)水產(chǎn)資源和發(fā)展綠色健康海水養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。重金屬對小型魚類的毒性影響研究主要集中在斑馬魚、綿羊頭鰷魚、月銀漢魚、日本青鳉（Oryzias latipes）及黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）上，這幾種魚都是毒性試驗方法中常用的受試魚，研究證明這些魚在早期階段對重金屬的敏感性普遍都高于成魚期［19-24］。

國內(nèi)外學(xué)者在Cu2+對魚類的致毒機(jī)理方面進(jìn)行過相關(guān)研究。Mazon等［25］指出 Cu2+可引起美洲熱帶魚Prochilodus scrofa鰓的扁平上皮細(xì)胞和氯細(xì)胞增生肥大，血-水屏障增厚，而導(dǎo)致魚的呼吸困難甚至死亡。由于Cu2+抑制鰓Na+-K+-ATPase活性或者是殺死鰓上的起離子傳輸作用的成熟氯細(xì)胞群［26］從而破壞了魚體水氣交換機(jī)制［27］。Laurén等［28］報道 55μg/L Cu2+會使得虹鱒魚（Sa lmon gairdneri）鰓絲 Na+-K+-ATPase酶活性下降33％，鰓的能量利用和酸調(diào)節(jié)功能喪失或受阻。Nemcsók等［29］報道虹鱒魚在2mg/L Cu2+溶液中暴露24 h后，血液中 ASAT（天門冬氨酰轉(zhuǎn)氨酶）和ALAT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和AChE（乙酰膽堿酯酶）活力分別增加2倍、4.5倍和1.2倍，肝糖水平增加3.2倍，表明鰓、腎臟和肝臟受到損傷。Gail等［30］報道莫桑比克羅非魚（Oreochrom is mossambicus）在0.4mg/L Cu2+暴露28d后，血液白細(xì)胞數(shù)量增加而紅細(xì)胞數(shù)量減少，且滲透調(diào)節(jié)能力受到抑制，說明Cu2+對其代謝過程產(chǎn)生了毒性作用。霓紅魚（Paracheirodom innesi）對Cu2+的吸收與環(huán)境暴露濃度呈線性關(guān)系，環(huán)境暴露濃度越高，進(jìn)入魚鰓、肌肉、肝臟中的重金屬離子量越多［31］。不同形態(tài)的Cu2+在彩虹方頭魚魚體和魚鰓中的積累量均隨水相游離 Cu2+濃度增高、暴露時間增長而增加［32］。本實驗結(jié)果顯示，在本實驗條件下裸項櫛鰕虎魚仔魚的存活率受 Cu2+影響顯著，對 Cu2+的毒性具有很高的敏感性。毒性敏感性與仔魚的日齡負(fù)相關(guān)：日齡愈小，敏感性愈高。

3.2 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

作為為美國試驗材料協(xié)會推薦的生物毒性試驗方法中常用標(biāo)準(zhǔn)毒物之一，SDS對魚類具有一定的毒性。SDS對魚類的96 hLC50通常都在0.59～38 mg/L［33-35］。值得注意的是，檢測條件不同，可能導(dǎo)致SDS的毒性數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯的差異。例如，在Fogels［33］的試驗中，SDS對虹鱒的96hLC50為4.62 mg/L，而Buhl等［34］測的數(shù)值則為24.9 mg/L，遠(yuǎn)高于前者，Vijayan等［35］測得的數(shù)據(jù)甚至達(dá)到38 mg/ L。這種差異主要?dú)w因于測定溫度和魚類發(fā)育階段的不同。另外，實驗中采用的觀測指標(biāo)不同也會對SDS的毒性數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。例如，Chen等［36］在用日本青鳉（Oryzias latipes）評估電鍍廢水的毒性時，將SDS作為參比毒物，獲得SDS對幼魚的96h LC50為12.5 mg/L。SDS對草魚（Ctenopharyngodon idellus）的48 h和96 hLC50分別為11.8 mg/L和5.2 mg/L，且 SDS對草魚抗氧化酶有顯著影響，對草魚鰓、血清和腎臟等細(xì)胞組織有明顯的毒性效應(yīng)［37］。本實驗結(jié)果 24 h～96 h的 LC50變化在0.4315～1.2777 mg/L之間，低于上述各魚的SDSLC50濃度，這可能與實驗對象的種間差異有關(guān)，本實驗對象裸項櫛鰕虎魚為海水性魚類，且均為初孵仔魚，故相對具有更高的敏感性，這也正是新國標(biāo)選用其作為標(biāo)準(zhǔn)生物的原因之一。根據(jù)化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準(zhǔn)則［38］，本實驗SDS對裸項櫛鰕虎魚的毒性屬于高毒性～中毒性。有研究表明國標(biāo)GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法中選用的標(biāo)準(zhǔn)物種中，鹵蟲（Artem ia parthenogenetica）對SDS 96h的 LC50為13.9 mg/L，蒙古裸腹蚤（Moina mongolica Daday）對 SDS 72 h的 LC50為 3.5 mg/L［39］，脊尾白蝦（Palaemon carincauda）仔蝦對 SDS 96 h的 LC50為14.3 mg/L［40］。本實驗對象裸項櫛鰕虎魚仔魚與上述標(biāo)準(zhǔn)生物相比具有更高的生物敏感性，且隨日齡的變化其耐受力增長，故裸項櫛鰕虎魚仔魚被用于生物毒性檢測，具有更寬的適用范圍。

3.3 裸項櫛鰕虎魚仔魚對標(biāo)準(zhǔn)毒物耐受性的評價

裸項櫛鰕虎魚被選為國標(biāo)“海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法”修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測，需要其對相關(guān)毒性物質(zhì)具有較寬的敏感性，以便對多種不同毒性程度的海洋石油勘探開發(fā)污染物進(jìn)行毒性評估。本實驗條件下，裸項櫛鰕虎魚仔魚恰恰對標(biāo)準(zhǔn)毒物顯示出了很高的敏感性，驗證了不同日齡仔魚用于海洋生物毒性檢測的適宜性。即，選用不同日齡的裸項櫛鰕虎魚仔魚就能夠?qū)崿F(xiàn)對不同毒性污染物的生物毒性檢測。因此，裸項櫛鰕虎魚仔魚用于海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢測是切實可行且適宜的。

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