Cu2+和十二烷基硫酸鈉對裸項櫛鰕虎魚仔魚急性毒性影響

王國棟，徐科鳳，黃韌，鄭琰晶，陳 琳，林忠婷

（1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510260；2.青島國家海洋科學研究中心，青島 266071）

隨著工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅速發(fā)展，大量的廢水和廢物排放入海，其中的重金屬在某一區(qū)域積累超過一定濃度時就會對海洋生物造成毒害作用。工業(yè)廢水、生活污水排放、石油泄漏和降雨等是水體中重金屬污染的主要來源［1］。重金屬對海洋生物特別是魚類毒害作用的研究已經(jīng)引起了科學家們的迫切關注［2-4］。銅是生物體酶必需的活性因子，其在生物體內(nèi)的含量甚微，但其濃度超過一定水平就會對生物體造成危害［5-7］。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）是常用的陰離子表面活性劑，大量存在于各類洗滌劑和去污粉中，隨生活污水的大量排放，也會對環(huán)境造成一定的危害，同時它也是生化、免疫檢測方面常用的蛋白質(zhì)變性劑，毒性較大［8］，為美國試驗材料協(xié)會（ASTM）推薦的生物毒性試驗方法中常用標準毒物之一［9］。

裸項櫛鰕虎魚（Ctenogobius gymnauchen）為鱸形目（Perciformes）、鰕虎魚亞目（Gobioidei）、鰕虎魚科（Gobiidae）、鰕虎魚亞科（Gobiinae）、櫛鰕虎魚屬（Ctenogobius）的一種小型海洋魚類，分布于我國沿海，南至琉球、菲律賓一帶的礁石或沙泥底質(zhì)淺水區(qū)［10］。因其個體小，性成熟早，繁殖周期短，繁殖力強，便于實驗室內(nèi)飼養(yǎng)管理。實驗動物指由人工培育，來源清楚，遺傳背景明確，對其攜帶的微生物和寄生蟲實施監(jiān)控，用于生命科學研究、藥品與生物制品生產(chǎn)和檢定、水環(huán)境污染評價以及其它科學研究的動物［11］。鑒于裸項櫛鰕虎魚具有以上特性，故具有較高的實驗動物開發(fā)價值。

2007—2008年度，裸項櫛鰕虎魚被選為 GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法［12］修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測，因此有必要摸清其仔魚對標準毒物的耐受性，從而了解其對有關毒物的敏感性。其中，關于裸項櫛鰕虎魚對Cu2+和SDS的適應能力在國內(nèi)外尚未見報道。本實驗以不同日齡的裸項櫛鰕虎魚仔魚為研究對象，研究了仔魚在不同濃度 Cu2+和SDS下的存活率，初步探討了其對兩種標準毒物的適應性，以期為新國標的修訂提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗魚的來源

裸項櫛鰕虎魚親魚采集于深圳大鵬灣沿岸的天然水域，在實驗室內(nèi)經(jīng)人工培育達到性成熟，進行人工繁殖獲得子代，作為本實驗所用仔魚。

1.2 實驗魚的馴化

實驗用仔魚培養(yǎng)箱為白色塑料整理箱（規(guī)格50 cm×30 cm×40 cm），實際用水量40 L。仔魚孵出后投喂經(jīng)小球藻強化的褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）。馴養(yǎng)期間，實驗用水為經(jīng)過砂濾和活性碳處理的自然海水，鹽度變化在32.6～35.3之間，pH變化在7.9～8.4之間，為保證培養(yǎng)箱中溶氧充足，用氣泵24 h充氣。光照和水溫與室內(nèi)自然節(jié)律一致，不進行人為控制，水溫變化在 20.8℃ ～26.2℃之間。

1.3 實驗設計

Cu2+急性毒性實驗設置了8個 Cu2+濃度水平，為0.012、0.021、0.035、0.06、0.102、0.173、0.294和0.5mg/L，分別以 C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8表示；5個不同日齡，為4、8、12、16和20 d，分別以D4、D8、D12、D16和D20表示，二者交叉形成了40個組合，每個組合設4個重復。實驗過程中，按照6、12、24、48、72和96 h的時間間隔觀察計數(shù)仔魚的存活數(shù)。

SDS急性毒性實驗設置了7個SDS濃度水平，為0.078、0.156、0.312、0.625、1.25、2.5和5 mg/L，分別以S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7表示，每個處理設四個重復，實驗用魚為4日齡，實驗過程中，按照24、48、72和 96 h的時間間隔觀察計數(shù)仔魚的存活數(shù)。

1.4 實驗管理

實驗用養(yǎng)殖容器為1 L的玻璃燒杯，將馴養(yǎng)的裸項櫛蝦虎魚仔魚按照隨機撈取的方式由自然海水轉(zhuǎn)入以上各處理組，每杯放魚10尾，實驗期間保持正常換水，日換水量為1/3，換水前1 d將實驗用水24 h充氣。每天多次投喂褶皺臂尾輪蟲（經(jīng)小球藻和50 DE微囊輪蟲強化餌料強化），密度為10 ind/m L左右。水溫與光照條件與馴養(yǎng)期相同，不進行人為控制，實驗期間各燒杯均不充氣。

1.5 存活率的統(tǒng)計

按照實驗設計時間點記錄各燒杯仔魚的存活數(shù)，并及時吸出死魚。仔魚死亡以魚體發(fā)白、心臟停止跳動為準。

1.6 計算與數(shù)據(jù)分析

Cu2+急性毒性實驗所得數(shù)據(jù)用方差分析及Duncan多重比較進行分析處理，以 P ＜0.05作為差異顯著水平。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析以 SPSS10.0軟件進行。

SDS的急性毒性試驗的數(shù)據(jù)處理采用概率單位法，根據(jù)死亡率查百分比與概率單位對照表得經(jīng)驗概率單位，以經(jīng)驗概率單位和濃度對數(shù)值作圖，根據(jù)回歸方程計算LC50［13］。

2 結果

2.1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

不同濃度下，不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚的存活率情況見表1，從中可以看出，Cu2+濃度對仔魚的存活率有顯著性影響（P＜0.05），隨濃度的升高，各組仔魚存活率顯著降低（P＜0.05），當Cu2+濃度達到0.5 mg/L時，在實驗開始6 h內(nèi)，各組仔魚均全部死亡。整體上，仔魚的存活率隨實驗時間的延長而下降，而隨日齡的增大存活率升高，其中96 h時S7處理組4 d仔魚存活率為0，而此時相同Cu2+濃度下20 d組仔魚的存活率高達42.5％。

表1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響Tab.1 The effect of Cu2+on survival rate of Bareneck goby larva

2.2 Cu2+對不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚96 h的急性毒性影響

圖1為96 h不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚在不同Cu2+濃度下的存活率，可以看出，各處理組仔魚存活率隨Cu2+濃度的升高而顯著降低（P ＜0.05），0.060 mg/L～0.500 mg/L處理組尤為明顯。整體上看，相同Cu2+濃度下，裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率隨日齡的升高而升高，其中4日齡處理組存活率在各 Cu2+濃度下均比20日齡處理組低40％左右。

2.3 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚的LC50及95％置信限

圖1 96 h時不同日齡裸項櫛鰕虎魚仔魚在各Cu2+濃度下的存活率；圖中同一日齡中帶有不同字母的數(shù)據(jù)表示差異顯著（P＜0.05）Fig.1 The survival rate of different daily age Bareneck goby larva at different Cu2+at 96 h；The data with different letter in the same daily agemeans significant difference each other（P＜0.05）

對裸項櫛鰕虎魚仔魚SDS毒性處理結果列于表2，24、48、72和96 h的SDS半致死濃度分別為1.278、1.116、0.783和0.432 mg/L，95％的置信區(qū)間分別為0.737～2.215 mg/L、0.626～1.987 mg/ L、0.383～1.603 mg/L和0.292～0.637 mg/L。

3討論

表2 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50及95％置信限Tab.2 LC50 and 95％confidence limits of Bareneck goby larva at different SDS at 24 h、48 h、72 h and 96 h

3.1 Cu2+對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

魚類的早期生活史階段是對污染物比較敏感的階段［14］。關于重金屬對魚類早期生活史階段的毒害效應，已有學者作了一定的工作［15-18］。了解重金屬對海洋魚卵孵化和仔稚魚成活的毒性規(guī)律，對于防止海洋污染，保護水產(chǎn)資源和發(fā)展綠色健康海水養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義。重金屬對小型魚類的毒性影響研究主要集中在斑馬魚、綿羊頭鰷魚、月銀漢魚、日本青鳉（Oryzias latipes）及黑頭軟口鰷（Pimephales promelas）上，這幾種魚都是毒性試驗方法中常用的受試魚，研究證明這些魚在早期階段對重金屬的敏感性普遍都高于成魚期［19-24］。

國內(nèi)外學者在Cu2+對魚類的致毒機理方面進行過相關研究。Mazon等［25］指出 Cu2+可引起美洲熱帶魚Prochilodus scrofa鰓的扁平上皮細胞和氯細胞增生肥大，血-水屏障增厚，而導致魚的呼吸困難甚至死亡。由于Cu2+抑制鰓Na+-K+-ATPase活性或者是殺死鰓上的起離子傳輸作用的成熟氯細胞群［26］從而破壞了魚體水氣交換機制［27］。Laurén等［28］報道 55μg/L Cu2+會使得虹鱒魚（Sa lmon gairdneri）鰓絲 Na+-K+-ATPase酶活性下降33％，鰓的能量利用和酸調(diào)節(jié)功能喪失或受阻。Nemcsók等［29］報道虹鱒魚在2mg/L Cu2+溶液中暴露24 h后，血液中 ASAT（天門冬氨酰轉(zhuǎn)氨酶）和ALAT（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶）和AChE（乙酰膽堿酯酶）活力分別增加2倍、4.5倍和1.2倍，肝糖水平增加3.2倍，表明鰓、腎臟和肝臟受到損傷。Gail等［30］報道莫桑比克羅非魚（Oreochrom is mossambicus）在0.4mg/L Cu2+暴露28d后，血液白細胞數(shù)量增加而紅細胞數(shù)量減少，且滲透調(diào)節(jié)能力受到抑制，說明Cu2+對其代謝過程產(chǎn)生了毒性作用。霓紅魚（Paracheirodom innesi）對Cu2+的吸收與環(huán)境暴露濃度呈線性關系，環(huán)境暴露濃度越高，進入魚鰓、肌肉、肝臟中的重金屬離子量越多［31］。不同形態(tài)的Cu2+在彩虹方頭魚魚體和魚鰓中的積累量均隨水相游離 Cu2+濃度增高、暴露時間增長而增加［32］。本實驗結果顯示，在本實驗條件下裸項櫛鰕虎魚仔魚的存活率受 Cu2+影響顯著，對 Cu2+的毒性具有很高的敏感性。毒性敏感性與仔魚的日齡負相關：日齡愈小，敏感性愈高。

3.2 SDS對裸項櫛鰕虎魚仔魚存活率的影響

作為為美國試驗材料協(xié)會推薦的生物毒性試驗方法中常用標準毒物之一，SDS對魚類具有一定的毒性。SDS對魚類的96 hLC50通常都在0.59～38 mg/L［33-35］。值得注意的是，檢測條件不同，可能導致SDS的毒性數(shù)據(jù)出現(xiàn)明顯的差異。例如，在Fogels［33］的試驗中，SDS對虹鱒的96hLC50為4.62 mg/L，而Buhl等［34］測的數(shù)值則為24.9 mg/L，遠高于前者，Vijayan等［35］測得的數(shù)據(jù)甚至達到38 mg/ L。這種差異主要歸因于測定溫度和魚類發(fā)育階段的不同。另外，實驗中采用的觀測指標不同也會對SDS的毒性數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。例如，Chen等［36］在用日本青鳉（Oryzias latipes）評估電鍍廢水的毒性時，將SDS作為參比毒物，獲得SDS對幼魚的96h LC50為12.5 mg/L。SDS對草魚（Ctenopharyngodon idellus）的48 h和96 hLC50分別為11.8 mg/L和5.2 mg/L，且 SDS對草魚抗氧化酶有顯著影響，對草魚鰓、血清和腎臟等細胞組織有明顯的毒性效應［37］。本實驗結果 24 h～96 h的 LC50變化在0.4315～1.2777 mg/L之間，低于上述各魚的SDSLC50濃度，這可能與實驗對象的種間差異有關，本實驗對象裸項櫛鰕虎魚為海水性魚類，且均為初孵仔魚，故相對具有更高的敏感性，這也正是新國標選用其作為標準生物的原因之一。根據(jù)化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則［38］，本實驗SDS對裸項櫛鰕虎魚的毒性屬于高毒性～中毒性。有研究表明國標GB/T 18420.2-2001海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法中選用的標準物種中，鹵蟲（Artem ia parthenogenetica）對SDS 96h的 LC50為13.9 mg/L，蒙古裸腹蚤（Moina mongolica Daday）對 SDS 72 h的 LC50為 3.5 mg/L［39］，脊尾白蝦（Palaemon carincauda）仔蝦對 SDS 96 h的 LC50為14.3 mg/L［40］。本實驗對象裸項櫛鰕虎魚仔魚與上述標準生物相比具有更高的生物敏感性，且隨日齡的變化其耐受力增長，故裸項櫛鰕虎魚仔魚被用于生物毒性檢測，具有更寬的適用范圍。

3.3 裸項櫛鰕虎魚仔魚對標準毒物耐受性的評價

裸項櫛鰕虎魚被選為國標“海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法”修訂版中的新增物種，用于生物毒性檢測，需要其對相關毒性物質(zhì)具有較寬的敏感性，以便對多種不同毒性程度的海洋石油勘探開發(fā)污染物進行毒性評估。本實驗條件下，裸項櫛鰕虎魚仔魚恰恰對標準毒物顯示出了很高的敏感性，驗證了不同日齡仔魚用于海洋生物毒性檢測的適宜性。即，選用不同日齡的裸項櫛鰕虎魚仔魚就能夠?qū)崿F(xiàn)對不同毒性污染物的生物毒性檢測。因此，裸項櫛鰕虎魚仔魚用于海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢測是切實可行且適宜的。

［1］Wolfe DA，Rice TR.Cycling of elements in esturies.Fish Bull［J］.1972，70：959-972.

［2］王百順，劉阿成，陳忠陽.1984—2000年長江口海域水質(zhì)重金屬濃度分布變化［J］.海洋通報，2003，22（2）：32-39.

［3］丘耀文，朱良生.海陵灣沉積物中重金屬污染及其潛在生態(tài)危害［J］.海洋環(huán)境科學，2004，23（1）：22-24.

［4］Oliver W，Jeffrey PO.A review of pollutants in the sea-surface microlayer（SML）：a unique habitat for marine organisms［J］.Marine Pollution Bulletin，2004，48：1016-1030.

［5］Sarkka J，Hatulla ML，Paasivirta J.Mercury and chlorinated hydrocarbons in food chain of lake Paijnne［J］.Finland Holaric Ecol，1978，1：326-332.

［6］Verbost，PM，Van RJ，F(xiàn)lik G.The movement of cadm ium through freshwater trout branchial epithelium and its interference with calcium transport［J］.JExp Biol，1989，145：185-197.

［7］Crosell MH，Hogstrand CM，Wood CM.Rental Cu and Na excretion and hepatic Cu metabolism in both Cu accumulation and non acclimated rainbow trout（Oncorhynchus mykiss） ［J］.Aquat Toxicol，1998，40：275-291.

［8］Sirisattha S，Momose Y，Kitagawa E.Toxicity of anionic detergents determined by Saccharomyces cerevisiae microarray analysis［J］.Water Research，2004，38，61-70.

［9］ASTM.Annual Book of ASTM［M］.Philadelpia PA：American Society for Testing and Materials，1988.

［10］劉群，蘇振明，曾曉起，等.渤海鰕虎魚類的生物學調(diào)查-關于區(qū)系分布與生態(tài)學基礎的研究［J］.青島海洋大學學報，1997，27（2）：157-165.

［11］鄒移海，黃韌，連至誠，等.中醫(yī)實驗動物學［M］.廣州：暨南大學出版社，1999：1.

［12］GB/T 18420.2-2001.海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法［G］.

［13］周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1989：109-168.

［14］Rice DW，Harrison JR，Jearld AJ.Effects of copper of early life history stages of northern anchovy（Engraulis mordax）［J］.Fishery Bulletin，1980，78（3）：675-682.

［15］崔可鐸，劉玉梅，侯蘭英.汞等六種重金屬對魚卵孵化和仔魚成活的影響［J］.海洋與湖沼，1987，18（2）：138-143.

［16］Spehar RL.Cadmium and zinc toxicity to flagfish （Jardanells floridea）［J］.J Fsih Res Board Can，1976，33：1939-1945.

［17］Harold H，CH Xu.Effects ofmetals on sea Urchin development： Arapid bioassay［J］. Mar Poll Bull，1984，15（1）：18-21.

［18］Weis JS，Weis P.Effects of heavy metals of embryonic development of the Killifish（Fundulus heferoclitus）［J］.JFish Biol，1977，11：49-54.

［19］Burton DT，F(xiàn)isher DJ.Acute toxicity of cadm ium，copper，zinc，zmmonia，3，3＇-dichlorobenzidine，2，6-dichloro-4-nitroaniline，methylene chloride，and 2，4，6-trichlorophenol to juvenile grass shrimp and killifish.Bull.Environ［J］.Contam Toxicol，1990，44：776-783.

［20］Weis JS，Weis P.Effects of heavy metals on embryonic development of the killfish（Fudulus heferoclitus）［J］.J Fish Biol，1977，11：49-54.

［21］Heitmuller PT，Hollister TA，Parrish PR.Acute toxicity of 54 industrial chemicals to sheepshead minnows（Cyprinodon variegatus）［J］.Bull Environm Contain Toxicol.1981，27： 596-604.

［22］Andreasen JK，Spears RW.Toxicity of Texan petroleum well brine to the sheepshead minnow（Cyprinodon variegatus），a common estuarine fish.Bull.Environ［J］.Contam Toxicol，1983，30：277-283.

［23］Hutchinson TH，W illiams TD.The use of sheepshead minnow （Cyprinodon variegatus） and a benthic copepod （Tisbe battagliai）in short-term tests for estimating the chronic toxicity of industrial effluents［J］.Hydrobiologia，1989，188：567 -572.

［24］Middaugh DP，Chapman PJ，Shelton ME.Effects of fractions from biodegraded Alaska north slope crude oil on embryonic inland silversides（Menidia beryllina） ［J］.Arch Environ Contam Toxicol，2002，42：236-243.

［25］Mazon AF，Cerqueira CC，F(xiàn)ernandes MN.Gill cellular changes induced by copper exposure in the south American tropical freshwater fish （Prochilodus scrofa） ［J］.Environmental Research，2002，88：52-63.

［26］Bury NR，Li J，Lock RAC.Cortisol protects against copper induced necrosis and promotes apoptosis in fish gill chloride cells in vitro［J］.Aquatic Toxicology.1998，40：193-202.

［27］Wendelaar BSE.The stress response in fish［J］.Physiology Reviews，1997，77：591-625.

［28］Laurén DJ，Mcdonals DG.Effects of copper on branchial ionoregulation in the rainbow trout（Salmo gairdneri Richardson ）［J］.JComp Physiol，1985，155B：635-643.

［29］Nemcsók JG，Hughes GM.The effect of copper sulphate on some biochemical parameters of rainbow trout［J］.Environmental Pollution.1988，49：77-85.

［30］Gail Nussey#.Effect of copper on the haematology and osmoregulation of the Mozambique tilapia， （Oreochrom is mossambicus Cichlidae）［J］.Comp Biochem Physiol，1995，111（3）：369-380.

［31］Tao S，Liang T，Cao J. Synergistic effect of copper and lead uptake by fish［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，1999（b），44：190-195.

［32］梁濤，陶澍，林健枝.魚體（去鰓）和魚鰓對不同形態(tài)Cu的積累特征［J］.生態(tài)學報，1999，19（5）：763-766.

［33］Fogels A，Sprague JB.Comparative short-term tolerance of zebrafish，flagfish，and rainbow trout to five poisons including potential reference toxicants［J］.Water Res，1977，11（9）： 811-817.

［34］Buhl KJ，Steven JH.Acute toxicity of fire-control chemicals，nitrogenous chemicals，and surfactants to rainbow trout［J］.Transact Amer Fish Soci，2000，129：408-418.

［35］Vijayan MM，Pereira C，Kruzynski G.Sublethal concentrations of contaminant induce the expression of hepatic heat shock protein 70 in two salmonids［J］.Aquat Toxicol，1988，140：101 -108.

［36］Chen CM，Yu SC，Liu MC.Use of Japanese medaka（Oryzias latipes）and Tilapia（Oreochrom is mossambicus）in toxicity tests on different industrial effluents in Taiwan［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology，2001，40（3）： 363-370.

［37］孫翰昌，黃麗英，丁詩華，等.表面活性劑SDS對草魚急性毒性效應的研究［J］.中國農(nóng)學通報，2005，21（11）：406 -408.

［38］化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則［M］.北京：國家環(huán)境保護局，1989，1-25.

［49］鄭琰晶，陳琳，陳燕平，等.十二烷基硫酸鈉對水生生物的急性毒性影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2006，25：496 -498.

［40］鄭琰晶，魏社林，吳進孝，等.Cu2+、Zn2+、SDS、DBS對脊尾白蝦的毒性實驗［J］.熱帶海洋學報，2006，25（5）：87-90.