水生實(shí)驗(yàn)動物劍尾魚的DNA指紋圖譜構(gòu)建

全迎春，劉宇飛，2，白俊杰

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380；2.上海靖麗信息科技有限公司，上海 200235）

劍尾魚（Xiphophorus hellerii）又名青劍、劍魚，屬花鳉科（Opecilidae），是小型熱帶淡水魚。具有食性雜、繁殖周期短、適應(yīng)性強(qiáng)，容易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)［1，2］。研究調(diào)查結(jié)果顯示劍尾魚對多種農(nóng)藥、重金屬等毒物較敏感，還對某些魚類病原體敏感性強(qiáng)，以及存在盲眼、畸形等諸多突變性狀，適合作為動物模型［1-3］。1987年，珠江水產(chǎn)研究所開始了劍尾魚實(shí)驗(yàn)動物化研究，通過定向培育和系統(tǒng)研究，育成RRB（紅眼紅體）、RW-H（紅眼白體）、BY-F（黑眼橘紅體）三個品系［1，3］。其中代表品系RR-B系劍尾魚近交達(dá)30代，通過了全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定，農(nóng)業(yè)部第348號公告公布：劍尾魚RR-B系是適用于水環(huán)境監(jiān)測［4］、水產(chǎn)藥物安全性評價(jià)［5］、化學(xué)品毒性檢測［6］、動物疾病檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停?］及遺傳生物學(xué)研究［8］等領(lǐng)域的水生實(shí)驗(yàn)動物。

傳統(tǒng)的品種鑒定方法存在很多不足，且易受環(huán)境影響、不能鑒定基因混雜程度等，而DNA指紋圖譜直接反映品種之間以及個體之間基因組序列的差異，具有多位點(diǎn)性、高變異性、簡單而穩(wěn)定的遺傳性，近年來引起人們的重視，表現(xiàn)出巨大的實(shí)用價(jià)值［9］。劍尾魚作為一種重要的水生實(shí)驗(yàn)動物，其種質(zhì)資源的鑒定方法仍有待完善，因此，本研究應(yīng)用擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰的46個微衛(wèi)星位點(diǎn)，對RR-B系（紅眼紅體）、RW-H系（紅眼白體）、野生種三個品系劍尾魚進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建，并將形成的數(shù)字化指紋輸入珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件V1.0形成種質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫。該圖譜不僅能呈現(xiàn)出劍尾魚的遺傳概貌，用于劍尾魚選育系及其野生品種的鑒定，而且也為水生實(shí)驗(yàn)動物劍尾魚的品種選育和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

RR-B系劍尾魚30尾（雌雄各15尾），從珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動物培育基地隨機(jī)抽取；RWH系劍尾魚30尾（雌雄各15尾），取自珠江水產(chǎn)研究所水生實(shí)驗(yàn)動物培育基地，已選育至15代；野生型劍尾魚（非選育群體）購自廣州觀賞魚市場。

1.2 基因組DNA樣品的制備

取劍尾魚背鰭約10 mg，參考《分子克隆試驗(yàn)指南》［10］方法提取基因組DNA。0.8％瓊脂糖電泳檢測DNA的完整性和純度并用紫外分光光度計(jì)（Eppendorf BioPhotometer）檢測其濃度，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星引物合成、PCR擴(kuò)增及電泳

參考已報(bào)道的文獻(xiàn)［11-12］及劍尾魚中心網(wǎng)站中有關(guān) 微 衛(wèi) 星 的 數(shù) 據(jù) （www.xiphophorus.org/-m icrosats/microsat.htm），選取有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物50對，由上海英駿公司合成。PCR反應(yīng)總體系為10μL，含有10×Buffer 1.0μL，MgCl2（25 mmol/L） 0.3～0.6μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2μL，上、下游引物（20 mmol/L）各 0.5μL，Taq酶 0.5 U，模板DNA 50 ng左右。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 m in后進(jìn)入循環(huán)體系，94℃變性30 s，各引物退火溫度48～60℃，退火時間30 s，72℃延伸45 s，25個循環(huán)，最后72℃延伸7 min。以8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，取3μL產(chǎn)物電泳，硝酸銀染色，染色方法參照文獻(xiàn)［13］。

1.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選

以8尾野生劍尾魚的 DNA樣本為模板，調(diào)節(jié)PCR的溫度（48℃ ～60℃）、鎂離子濃度（終濃度0.5～1.5 mmol/L），使PCR達(dá)到最佳擴(kuò)增效果。挑選擴(kuò)增效果穩(wěn)定，電泳條帶清晰的微衛(wèi)星位點(diǎn)用于劍尾魚DNA指紋圖譜的構(gòu)建。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯帶后用掃描儀掃描，根據(jù)凝膠上DNA泳動距離，用Gel-pro analyzer 4.5軟件分析條帶大小。統(tǒng)計(jì)劍尾魚個體在各個位點(diǎn)的條帶大小，用Excel軟件繪制散點(diǎn)圖，從而形成3個群體的指紋圖譜模式圖。選取在3個劍尾魚品系中具有特異擴(kuò)增條帶的5對微衛(wèi)星引物形成數(shù)字化指紋，以便于3個品系及其雜交種的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體的微衛(wèi)星擴(kuò)增結(jié)果

用8尾劍尾魚個體進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選合成的50對引物，經(jīng)PCR條件優(yōu)化，選取擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的引物，共篩選出46對引物。然后使用這些微衛(wèi)星標(biāo)記對劍尾魚RR-B系、RW-H系及野生群體進(jìn)行基因組掃描，46個位點(diǎn)在3個群體中共找到等位基因106個，平均每個位點(diǎn)2.3個，部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。

微衛(wèi)星標(biāo)記遵循孟德爾遺傳法則，呈共顯性遺傳，因此能很好的區(qū)分純合子和雜合子。如圖1中，微衛(wèi)星位點(diǎn)Msc036具有3種等位基因型，純合個體僅擴(kuò)增出其中一條帶型，雜合個體則可擴(kuò)增出其中二條帶型，圖中RR-H系劍尾魚在位點(diǎn)Msc036為純合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)劍尾魚 RR-B系在42個微衛(wèi)星位點(diǎn)上表現(xiàn)為純合、單態(tài)性，等位基因純合率為91.3％； RW-H系則為43個位點(diǎn)純合、單態(tài)性，等位基因純合率為且為93.5％；而這些野生群體在這些位點(diǎn)（除位點(diǎn)Msb030外）則表現(xiàn)為雜合，反映出這2個選育系已經(jīng)具有了很高的遺傳純度。

圖1 劍尾魚3個群體在微衛(wèi)星位點(diǎn)Msc036的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of locus Msd036 in three swordtail fish populations

2.2 劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖構(gòu)建

采用Excel軟件，根據(jù)46對微衛(wèi)星引物在3個劍尾魚群體中PCR擴(kuò)增條帶的大小，繪制劍尾魚微衛(wèi)星DNA指紋圖譜模式圖（見圖2～4）。

圖2 劍尾魚RR-B系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.2 DNA fingerprinting of RR-B strain of Xiphophorus helleri using Microsatellites

圖3 劍尾魚RW-H系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.3 DNA fingerprinting of RW-H strain of Xiphophorus helleri using M icrosatellites

圖4 劍尾魚非選育系的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜Fig.4 DNA fingerprinting of wild Xiphophorus helleri using Microsatellites

2.3 劍尾魚品系鑒定標(biāo)記及其數(shù)字化指紋

選取在劍尾魚RR-B系、RW-H系和非選育系中具有特異擴(kuò)增條帶的5對微衛(wèi)星引物，根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小，有帶的記為1，無帶的記為0，形成每個品系對應(yīng)的數(shù)字化指紋，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 劍尾魚特異微衛(wèi)星標(biāo)記的數(shù)字化指紋Tab.1 The digital fingerprint of Xiphophorus helleri on strain-specialm icrosatellite loci

2.4 劍尾魚DNA指紋圖譜鑒定數(shù)據(jù)及軟件應(yīng)用

珠江水產(chǎn)研究所魚類種質(zhì)鑒定軟件 V1.0 （PRIFRI1.0）是由珠江水產(chǎn)研究所根據(jù)魚類 DNA指紋數(shù)據(jù)特點(diǎn)開發(fā)的魚類種質(zhì)鑒定軟件，已獲得軟件著作權(quán)（證書號2010SR026776）。將劍尾魚數(shù)字化指紋數(shù)據(jù)根據(jù)軟件要求整理成DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫（如圖5所示），該軟件可從已建立的劍尾魚指紋圖譜數(shù)據(jù)庫中挑選任意幾個位點(diǎn)所形成的數(shù)字化指紋作為標(biāo)準(zhǔn)，以EXCEL形式導(dǎo)入軟件，應(yīng)用軟件中已嵌入的計(jì)算公式，經(jīng)基因頻率、遺傳相似度等計(jì)算，快速準(zhǔn)確的鑒定的某一未知個體與各已知品系的相似度并確定其種群分類歸屬。

以劍尾魚RR-B系的第一個個體在其中5個微衛(wèi)星位點(diǎn)（Msa007、Msa008、Msa010、Msa012和Msa014）的數(shù)據(jù)“11000 010 01 010 10000”為例，輸入該軟件后，運(yùn)行軟件，結(jié)果如下圖所示：

圖5 劍尾魚DNA指紋數(shù)據(jù)庫示意圖Fig.5 Part of the DNA fingerprinting database of Xiphophorus helleri

圖6 劍尾魚種質(zhì)資源鑒定軟件的運(yùn)行示意圖Fig.6 The software operation schematic of Xiphophorus germplasm resources appraisal software，PRIFRI1.0

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物是醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件，在疾病模型的構(gòu)建、藥物安全性評價(jià)、環(huán)境污染監(jiān)測、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)等眾多領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，劍尾魚在應(yīng)用中具有明顯的特色與優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。近交系動物中微衛(wèi)星長度變化發(fā)生率很低，近交系實(shí)驗(yàn)動物的顯著特征是基因純合性及遺傳穩(wěn)定性，用于實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，可比性強(qiáng)，微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因則可成為某一近交系動物的恒定參數(shù)［14-15］。

劍尾魚種質(zhì)資源監(jiān)測及近交系純度鑒定是劍尾魚作為實(shí)驗(yàn)動物的基礎(chǔ)。微衛(wèi)星DNA是對DNA的直接反應(yīng)，要比生化標(biāo)記更準(zhǔn)確、可靠，已經(jīng)廣泛應(yīng)用到大小鼠、倉鼠、沙鼠、家兔、犬、猴和豬等常用實(shí)驗(yàn)動物的遺傳監(jiān)測當(dāng)中［16-17］。本研究構(gòu)建的微衛(wèi)星DNA指紋圖譜可以用作劍尾魚品種鑒定，這幾個品系間具有特異擴(kuò)增條帶的5個微衛(wèi)星標(biāo)記將較好的用于區(qū)分劍尾魚的不同品系，同時PRIFRI1.0軟件的應(yīng)用也將簡化種質(zhì)鑒定步驟。另一方面微衛(wèi)星DNA指紋也可用于劍尾魚品系的純度檢測。歐陽兆和等［18］用14個微衛(wèi)星DNA對10個近交系小鼠多態(tài)分析表明，這些微衛(wèi)星DNA在同一品系不同個體間表現(xiàn)為單態(tài)性，在不同品系間表現(xiàn)為多態(tài)性，可快速、經(jīng)濟(jì)的對近交系小鼠進(jìn)行遺傳檢測和純度鑒定。本研究中46個微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增的結(jié)果顯示，在野生型劍尾魚中表現(xiàn)為多態(tài)性的46個微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，在RR-B系和RW-H系中分別有42和43個標(biāo)記表現(xiàn)為單態(tài)，基因純合率為91.3％、93.5％。這與李凱彬用生化標(biāo)記方法檢測出結(jié)果一致［8］，也證明了微衛(wèi)星標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)動物遺傳監(jiān)測中應(yīng)用的可行性。

［1］吳淑勤，黃志斌.水生實(shí)驗(yàn)動物——劍尾魚［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［2］黃志斌，吳淑勤，石存斌，等.劍尾魚的若干生物學(xué)特性研究［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2000，7（3）：107-109.

［3］Wu S，Huang Z，Yu R，et a1.Approach for the app lication of Xiphophorus helleri as experiment anima1［C］.Proceeding of the Fourth Asian Fisheries Forum，1995.101-107.

［4］王春鳳，方展強(qiáng).汞和硒對劍尾魚的急性毒性及其安全濃度評價(jià)［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2005，28：32-35.

［5］聶湘平，王翔，李凱斌，等.抗生素藥物環(huán)丙沙星對劍尾魚的毒性效應(yīng)［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，46（5）：70 -73.

［6］常藕琴，石存斌，潘厚軍，等.劍尾魚硫酸銅急性中毒的病理學(xué)研究［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26（7）：82-85.

［7］潘厚軍，吳淑勤，李凱彬，等.劍尾魚在檢測細(xì)菌毒力方面的應(yīng)用［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2000，24（5）：467-471.

［8］李凱彬，姜蘭，潘厚軍，等.RR-B系劍尾魚LDH和GDH同工酶的分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，13（3）：46-50.

［9］王忠華.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在作物品種資源中的應(yīng)用［J］.分子植物育種，2006，4（3）：425-430.

［10］薩姆布魯克，弗里奇，曼尼阿蒂斯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南：第2版［M］.北京：科學(xué)出版社，1999.

［11］李霞，白俊杰，吳淑勤，等.劍尾魚RW-H近交系的遺傳結(jié)構(gòu)分析［J］.水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2004，28（4）：365-370.

［12］李霞，白俊杰，吳淑勤，等.劍尾魚微衛(wèi)星DNA的篩選［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2004，11：196-201.

［13］張春雷，佟廣香，匡友誼，等.微衛(wèi)星產(chǎn)物變性與非變性PAGE-銀染方法比較［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志，2010，23（1）：11-14.

［14］Dallas JF.Estimation of microsatelite mutation rates in recombinant inbred strains ofmouse［J］.Mammalian Genome，1992，3：452-456.

［15］Martinez AM ，Delgado JV，Roder A.Genetic structure of the Ibereian pig breed using microsatellites［J］.Animal Genetics，2000，31：295-301.

［16］李瑞生，胡娟峰，曾林，等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在常用實(shí)驗(yàn)動物遺傳多態(tài)性的研究進(jìn)展［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，10：81 -81.

［17］李瑞生，陳振文，李曉娟，等.微衛(wèi)星DNA標(biāo)記在常用實(shí)驗(yàn)動物遺傳監(jiān)測中的分析［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，10：75 -76.

［18］歐陽兆和，陳振文，李瑞生等.微衛(wèi)星DNA多態(tài)性在十種近交系小鼠遺傳監(jiān)測中的應(yīng)用研究［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2004，14（2）：71-74.