淫羊藿素體外抗淋巴瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)

范雙翼，余英豪

（南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科，福州 350025）

抗腫瘤藥物的研究一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，而植物藥成為抗腫瘤藥物的重要來源之一，如紫杉醇、長春花堿等，都是一線抗腫瘤藥物。淫羊藿素（icaritin，ICT），是來源于小檗科淫羊藿屬植物的活性成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬黃酮類化合物。分子式為C20H20O6，分子量356.38。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

近年來，ICT抗腫瘤作用備受人們關(guān)注［1，2］，但對淋巴瘤的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇EL-4細(xì)胞做為載體，研究 ICT體外對淋巴瘤細(xì)胞的作用并分析其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

EL-4小鼠淋巴瘤細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。懸浮生長于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置5％CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1～2 d換液一次，3～4 d傳代。

1.2 主要試劑

淫羊藿素（ICT）由第二軍醫(yī)大學(xué)殷正豐教授饋贈（純度99％）。RPMI-1640為Hyclone公司產(chǎn)品。胎牛血清（FBS）為奧地利PAA公司產(chǎn)品。二甲基亞砜（DMSO）、MTT（噻唑藍(lán)）為 Sigma公司產(chǎn)品。TrizolTM RNA Isolation Reagent、DEPC 為 美 國Invitrogen公司產(chǎn)品。AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega Reverse Transcription System A3500。PCR試劑盒為Takara rTaq。DNA Marker（600 bp）為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。Caspase-3、9分光光度法檢測試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。DNA-PREP RENGENT KIT為美國COULER公司產(chǎn)品。

1.3 M TT法檢測細(xì)胞增殖

根據(jù) ICT濃度不同，分為1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L組，同時設(shè)未加藥物的陰性對照組。每組樣本設(shè)4個平行孔，選取生長狀況良好，活細(xì)胞數(shù)大于95％的細(xì)胞，起始濃度1×105個/L接種于96孔板中，在37℃，5％CO2及飽和濕度條件下，分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，置酶標(biāo)儀下測定OD值。以下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（％）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100％。量效關(guān)系曲線分析計(jì)算IC50值。

1.4 超微結(jié)構(gòu)觀察

未加藥物組EL-4細(xì)胞與40μmol/L ICT作用6 h細(xì)胞各一瓶，經(jīng) PBS漂洗，2.5％戊二醛-1.5％多聚甲醛及1％鋨酸固定，環(huán)氧樹脂618包埋，超薄切片，醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，Philips-EM208S透射電鏡觀察并攝片。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測

實(shí)驗(yàn)組ICT濃度分別為40μmol/L、80μmol/L。對照組為未加藥物的細(xì)胞。收集細(xì)胞，離心，PBS洗滌，300目過濾網(wǎng)過濾后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/m L，按DNA-PREP RENGENT KIT試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，在染色20 min后上機(jī)檢測。用COULER Muticycle分析系統(tǒng)對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 基因m RNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測

40μmol/L ICT處理6 h的EL-4細(xì)胞，用Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以獲得的cDNA為第一鏈，以Bcl-2、P21基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時選用GAPDH作為內(nèi)參照。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

1.7 Caspase-3與Caspase-9活力測定

40μmol/L ICT作用EL-4細(xì)胞6 h，同時設(shè)立陰性對照組，用PBS洗滌細(xì)胞二次，收集細(xì)胞沉淀，加入裂解液置冰上裂解40 m in，離心后取少量上清，BCA法測定蛋白濃度。吸取50μL含100～200μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，加入50μL的反應(yīng)液及5μL Caspase-3，于37℃避光孵育4 h。設(shè)立空白對照組，用分光光度計(jì)在λ=400 nm測定其吸光值。通過計(jì)算OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組的倍數(shù)來確定實(shí)驗(yàn)組 Caspase-3活化程度。同法確定Caspase-9活化程度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對 Caspase-3、Caspase-9采用t檢驗(yàn)分析，抑制率采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為有顯著性差異；P＜0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 M TT法檢測 ICT對 EL-4細(xì)胞增殖的抑制作用

采用不同濃度ICT處理EL-4細(xì)胞24 h，各實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞增殖抑制率比較均具有顯著性差異（P＜0.05），見表1。算得ICT作用24 h IC50值為5.26μmol/L。10μmol/L ICT分別作用于 EL-4細(xì)胞12 h、24 h、48 h，各作用時間點(diǎn)EL-4細(xì)胞的增殖均受到抑制，與對照組比較具有顯著性差異（P＜ 0.05），見表2。上述結(jié)果表明，ICT對EL-4細(xì)胞增殖的抑制作用有劑量和時間性。

表1 不同濃度ICT處理24 h的EL-4細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 The inhibition ratio of EL-4 cells in differrent dose of ICT after 24 h

圖1 倒置顯微鏡下不同濃度ICT處理24 h細(xì)胞形態(tài)比較Fig.1 Themorphology comparison of cells in different dose of ICT after 24 h under inverted microscope

表2 10μmol/L ICT處理不同時間的EL-4細(xì)胞增殖抑制率Tab.2 The inhibition ratio of EL-4 cells in 10μmol/LICT after different time

倒置顯微鏡下可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞數(shù)量減少，且隨著加藥濃度的增加，這種變化趨于明顯（圖1A-D）。

2.2 ICT對EL-4細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

2.2.1 EL-4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

（1）對照組EL-4細(xì)胞：鏡下瘤細(xì)胞彌漫成片分布，細(xì)胞間不粘著，無連接復(fù)合體及橋粒。瘤細(xì)胞中等大小，形態(tài)單一，圓形或橢圓形，胞質(zhì)稍豐富，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器量中等，部分細(xì)胞表面有小突起。瘤細(xì)胞核較大，圓形或卵圓形，部分不規(guī)則。染色質(zhì)以常染色質(zhì)為主，異染色質(zhì)少，分散排列或位于核膜下，核仁明顯，1個或多個。瘤細(xì)胞核漿比例高?？梢姷絺€別凋亡細(xì)胞（彩插1圖2～4）。

（2）40μmol/L ICT作用EL-4細(xì)胞6 h：出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。早期表現(xiàn)為核異染色質(zhì)增多、濃縮、結(jié)塊邊集，核膜水腫、間隙增寬，胞質(zhì)濃縮深染；中期染色質(zhì)聚集在核膜下形成半月形、環(huán)狀、塊狀和其它不規(guī)則形狀，核膜水腫加重，間隙加寬；后期核裂解，形成多個凋亡小體（彩插1圖5～7）。

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測ICT作用后EL-4細(xì)胞凋亡

40μmol/L、80μmol/L的 ICT作用 EL-4細(xì)胞6 h，凋亡細(xì)胞百分率分別為12.3％和71.7％。隨著劑量增高，凋亡百分率亦增高。如圖8～10所示。

圖8 對照組Fig.8 The control group

圖9 40μmol/L實(shí)驗(yàn)組，可見到明顯凋亡峰Fig.9 40μmol/L group，the apoptotic peak can be seen clearly

2.3 ICT對EL-4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因m RNA表達(dá)的影響

由圖11可見紫外光下顯示明亮清晰的18 s與28 s兩條rRNA帶，說明提取的RNA完整。EL-4細(xì)胞處理組（40μmol/L ICT作用6 h）與對照組比較顯示，Bcl-2、P21的 mRNA在藥物作用后表達(dá)明顯下調(diào)（圖11）。

圖10 80μmol/L實(shí)驗(yàn)組，凋亡峰愈加明顯Fig.10 80μmol/L group，the apoptotic peakbecame more obvious

圖11 ICT對EL-4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 mRNA表達(dá)的影響Fig.11 The effect of ICT on the expression ofmRNA of apoptosis-related gene of EL-4 cells

2.4 ICT對EL-4細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響

經(jīng)40μmol/L、80μmol/L的 ICT處理 EL-4細(xì)胞6 h后 Caspase-3與 Caspase-9酶活性明顯提高（表3、圖12）。

3 討論

有研究表明，ICT具有雌激素樣活性［3］，并可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞［4］；增強(qiáng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞共表達(dá)神經(jīng)元特異性微管蛋白（βtubulin III）和膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶［5］。近年來，其抗腫瘤作用備受人們關(guān)注。文獻(xiàn)表明ICT可通過G1期阻滯抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖［1］，具有一定的抗腫瘤活性。但其對淋巴瘤的作用尚未見報(bào)道。

表3 不同濃度ICT對Caspase-3與Caspase-9酶活性的影響Tab.3 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

圖12 不同濃度ICT（μmol/L）對Caspase-3與Caspase-9酶活性的影響Fig.12 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

本研究將不同濃度的ICT與EL-4細(xì)胞共培養(yǎng)，采用 MTT比色法檢測其對EL-4細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示在5～20μmol/L濃度范圍內(nèi)，ICT對EL-4細(xì)胞的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，并且隨著濃度的提高，作用時間的延長，抑制作用愈明顯，呈時間和濃度依賴性。

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動死亡的過程。細(xì)胞凋亡失常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡對于腫瘤的治療具有重大意義［6］。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在二倍體峰的左側(cè)出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡特征峰，且隨著劑量的增加，凋亡峰也愈加明顯，顯示出劑量依賴性。在透射電鏡下，可發(fā)現(xiàn)對照組很難見到凋亡細(xì)胞，而實(shí)驗(yàn)組則能觀察到成片較多的典型的凋亡細(xì)胞，不僅能看到凋亡各個時期的表現(xiàn)，而且能看到大量凋亡小體。這些結(jié)果提示ICT能夠誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞的凋亡。

在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了ICT誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。

細(xì)胞凋亡受到各種凋亡調(diào)控蛋白的調(diào)控［7］。Bcl-2首先在人類濾泡性淋巴瘤中被確認(rèn)，是發(fā)現(xiàn)最早的抗凋亡基因［8］，是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者。這一家族的某些成員為凋亡激動蛋白（如 Bax，Bak，Bcl-xs，Bad，Bid等），而另一些成員則為凋亡拮抗蛋白（如Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-w等）。我們的研究結(jié)果顯示ICT能使 EL-4細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào)，提示Bcl-2參與了ICT誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程。

P21蛋白最初被認(rèn)為是一種能引起細(xì)胞周期停滯的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在藥物誘導(dǎo)的腫瘤抑制中起重要作用。近來，大量研究表明根據(jù)細(xì)胞類型及微環(huán)境不同，P21既有促凋亡作用，也有抑制調(diào)亡作用［9］。其阻止凋亡作用的機(jī)制可能與 Caspase-3介導(dǎo)的 P21裂解使 cyclinA/CDK2活性改變有關(guān)。Adachi等［10］研究發(fā)現(xiàn)缺氧可增加 Caspase-3活性，裂解P21，使其表達(dá)下降而致cyclinA/CDK2活性上調(diào)，引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ICT作用EL-4細(xì)胞后，P21 mRNA表達(dá)下調(diào)，提示P21可能參與EL-4細(xì)胞凋亡的過程。

Caspase家族是一類蛋白水解酶，在細(xì)胞內(nèi)以無活性的酶原形式存在。是執(zhí)行凋亡的主要酶類，絕大部分細(xì)胞凋亡依賴于其存在［11］。通常認(rèn)為Caspase-9屬于凋亡起始組，而 Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者，屬于凋亡效應(yīng)組。一旦被激活，起始Caspase即轉(zhuǎn)活化其他 Caspase酶原，引起級聯(lián)激活效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。激活的 Caspase-3作用于底物PARP，使之發(fā)生水解，其水解產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞骨架降解和 DNA片斷化［12］。本研究通過比色法Caspase-3、Caspase-9酶活性檢測顯示 40μmol/L ICT能夠顯著增強(qiáng) EL-4細(xì)胞 Caspase-3酶活性，也可同時增強(qiáng)Caspase-9酶活性，可能是促進(jìn) EL-4細(xì)胞的凋亡的因素之一。

綜上所述，ICT體外可有效抑制EL-4細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡?？紤]其作用可能通過下調(diào)bcl-2、P21 mRNA表達(dá)，激活Caspase-3、Caspase-9蛋白等途徑實(shí)現(xiàn)的。

［1］Huang X，Zhu D，Lou Y.A novel anticancer agent，icaritin，induced cell growth inhibition，G1 arrest and mitochondrial transmembrane potential drop in human prostate carcinoma PC-3 cells［J］.Eur JPharmacol，2007；564（1）：26-36.

［2］Ye HY，Lou YJ.Estrogenic effects of two derivatives of icariin on human breast cancer MCF-7 cells［J］.Phytomedicine.2005； 12：735-741.

［3］Wang ZQ，Lou YJ.Proliferation-stimulating effects of icaritin and desmethylicaritin in MCF-7 cells［J］.Eur J Pharmacol.2004，504（3）：147-153.

［4］Zhu DY，Zhang XN，Du Y.Directed differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells induced by icaritin in vitro［J］.Journal of ZheJiang University（Medical Sciences）.2007，36（3）：217-223.

［5］Wang Z，Wang H，Wu J，et al.Enhanced co-expression of betatubulin III and choline acetyltransferase in neurons from mouse embryonic stem cells promoted by icaritin in an estrogen receptorindependentmanner［J］.Chem Biol Interact.2009，179（2-3）：375-85.

［6］Kataoka S，Tsuruo T.Physician Education：Apoptosis［J］.Oncologist.1996，1（6）：399-401.

［7］Nagata S.Apoptosis by death factor［J］.Cell，1997；88（3）： 355-336.

［8］Kockenbery D，Nunez G，Milliman C，et al.Bcl-2 is an inner m itochondrial membrane protein that blocks programmed cell death［J］.Nature，1990，348（6299）：334-336.

［9］Liu S，Bishop WR，Liu M.Differential effects of cell cycle regulatory protein p21（WAF1/Cip1）on apoptosis and sensitivity to cancer chemotherapy［J］.Drug Resist Updat.2003，6（4）： 183-195.

［10］Adachi S，Ito H，Tamamori-Adachi M，et al.Cyclin A/cdk2 activation is involved in hypoxia-induced apoptosis in cardiomyocytes［J］.Circ Res.2001，88（4）：408-414.

［11］袁長青，丁振華.Caspase的結(jié)構(gòu)與功能［J］.國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊，2002，24（3）：146-150.

［12］Perfettini JL，Kroemer RT，Kroemer G.Fatal liaisons of p53 with Bax and Bak［J］.Nature Cell Biology，2004，6：386-388.