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    淫羊藿素體外抗淋巴瘤細(xì)胞增殖效應(yīng)

    2011-02-01 09:28:40范雙翼余英豪
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    范雙翼,余英豪

    (南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科,福州 350025)

    抗腫瘤藥物的研究一直是藥物研發(fā)的熱點(diǎn),而植物藥成為抗腫瘤藥物的重要來(lái)源之一,如紫杉醇、長(zhǎng)春花堿等,都是一線(xiàn)抗腫瘤藥物。淫羊藿素(icaritin,ICT),是來(lái)源于小檗科淫羊藿屬植物的活性成分,其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬黃酮類(lèi)化合物。分子式為C20H20O6,分子量356.38。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:

    近年來(lái),ICT抗腫瘤作用備受人們關(guān)注[1,2],但對(duì)淋巴瘤的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇EL-4細(xì)胞做為載體,研究 ICT體外對(duì)淋巴瘤細(xì)胞的作用并分析其可能機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞株

    EL-4小鼠淋巴瘤細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。懸浮生長(zhǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。1~2 d換液一次,3~4 d傳代。

    1.2 主要試劑

    淫羊藿素(ICT)由第二軍醫(yī)大學(xué)殷正豐教授饋贈(zèng)(純度99%)。RPMI-1640為Hyclone公司產(chǎn)品。胎牛血清(FBS)為奧地利PAA公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)、MTT(噻唑藍(lán))為 Sigma公司產(chǎn)品。TrizolTM RNA Isolation Reagent、DEPC 為 美 國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品。AMV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega Reverse Transcription System A3500。PCR試劑盒為T(mén)akara rTaq。DNA Marker(600 bp)為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。Caspase-3、9分光光度法檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。DNA-PREP RENGENT KIT為美國(guó)COULER公司產(chǎn)品。

    1.3 M TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

    根據(jù) ICT濃度不同,分為1.25、2.5、5、10、20、40μmol/L組,同時(shí)設(shè)未加藥物的陰性對(duì)照組。每組樣本設(shè)4個(gè)平行孔,選取生長(zhǎng)狀況良好,活細(xì)胞數(shù)大于95%的細(xì)胞,起始濃度1×105個(gè)/L接種于96孔板中,在37℃,5%CO2及飽和濕度條件下,分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,置酶標(biāo)儀下測(cè)定OD值。以下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。量效關(guān)系曲線(xiàn)分析計(jì)算IC50值。

    1.4 超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

    未加藥物組EL-4細(xì)胞與40μmol/L ICT作用6 h細(xì)胞各一瓶,經(jīng) PBS漂洗,2.5%戊二醛-1.5%多聚甲醛及1%鋨酸固定,環(huán)氧樹(shù)脂618包埋,超薄切片,醋酸鈾及檸檬酸鉛染色,Philips-EM208S透射電鏡觀(guān)察并攝片。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

    實(shí)驗(yàn)組ICT濃度分別為40μmol/L、80μmol/L。對(duì)照組為未加藥物的細(xì)胞。收集細(xì)胞,離心,PBS洗滌,300目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/m L,按DNA-PREP RENGENT KIT試劑盒操作步驟進(jìn)行操作,在染色20 min后上機(jī)檢測(cè)。用COULER Muticycle分析系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

    1.6 基因m RNA表達(dá)的半定量RT-PCR檢測(cè)

    40μmol/L ICT處理6 h的EL-4細(xì)胞,用Trizol法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以獲得的cDNA為第一鏈,以Bcl-2、P21基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同時(shí)選用GAPDH作為內(nèi)參照。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析。

    1.7 Caspase-3與Caspase-9活力測(cè)定

    40μmol/L ICT作用EL-4細(xì)胞6 h,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組,用PBS洗滌細(xì)胞二次,收集細(xì)胞沉淀,加入裂解液置冰上裂解40 m in,離心后取少量上清,BCA法測(cè)定蛋白濃度。吸取50μL含100~200μg蛋白的細(xì)胞裂解上清,加入50μL的反應(yīng)液及5μL Caspase-3,于37℃避光孵育4 h。設(shè)立空白對(duì)照組,用分光光度計(jì)在λ=400 nm測(cè)定其吸光值。通過(guò)計(jì)算OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組的倍數(shù)來(lái)確定實(shí)驗(yàn)組 Caspase-3活化程度。同法確定Caspase-9活化程度。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì) Caspase-3、Caspase-9采用t檢驗(yàn)分析,抑制率采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P<0.05為有顯著性差異;P<0.01為極顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 M TT法檢測(cè) ICT對(duì) EL-4細(xì)胞增殖的抑制作用

    采用不同濃度ICT處理EL-4細(xì)胞24 h,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率比較均具有顯著性差異(P<0.05),見(jiàn)表1。算得ICT作用24 h IC50值為5.26μmol/L。10μmol/L ICT分別作用于 EL-4細(xì)胞12 h、24 h、48 h,各作用時(shí)間點(diǎn)EL-4細(xì)胞的增殖均受到抑制,與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P< 0.05),見(jiàn)表2。上述結(jié)果表明,ICT對(duì)EL-4細(xì)胞增殖的抑制作用有劑量和時(shí)間性。

    表1 不同濃度ICT處理24 h的EL-4細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 The inhibition ratio of EL-4 cells in differrent dose of ICT after 24 h

    圖1 倒置顯微鏡下不同濃度ICT處理24 h細(xì)胞形態(tài)比較Fig.1 Themorphology comparison of cells in different dose of ICT after 24 h under inverted microscope

    表2 10μmol/L ICT處理不同時(shí)間的EL-4細(xì)胞增殖抑制率Tab.2 The inhibition ratio of EL-4 cells in 10μmol/LICT after different time

    倒置顯微鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整,細(xì)胞內(nèi)顆粒增多,細(xì)胞數(shù)量減少,且隨著加藥濃度的增加,這種變化趨于明顯(圖1A-D)。

    2.2 ICT對(duì)EL-4細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

    2.2.1 EL-4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀(guān)察

    (1)對(duì)照組EL-4細(xì)胞:鏡下瘤細(xì)胞彌漫成片分布,細(xì)胞間不粘著,無(wú)連接復(fù)合體及橋粒。瘤細(xì)胞中等大小,形態(tài)單一,圓形或橢圓形,胞質(zhì)稍豐富,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器量中等,部分細(xì)胞表面有小突起。瘤細(xì)胞核較大,圓形或卵圓形,部分不規(guī)則。染色質(zhì)以常染色質(zhì)為主,異染色質(zhì)少,分散排列或位于核膜下,核仁明顯,1個(gè)或多個(gè)。瘤細(xì)胞核漿比例高??梢?jiàn)到個(gè)別凋亡細(xì)胞(彩插1圖2~4)。

    (2)40μmol/L ICT作用EL-4細(xì)胞6 h:出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞,呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。早期表現(xiàn)為核異染色質(zhì)增多、濃縮、結(jié)塊邊集,核膜水腫、間隙增寬,胞質(zhì)濃縮深染;中期染色質(zhì)聚集在核膜下形成半月形、環(huán)狀、塊狀和其它不規(guī)則形狀,核膜水腫加重,間隙加寬;后期核裂解,形成多個(gè)凋亡小體(彩插1圖5~7)。

    2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ICT作用后EL-4細(xì)胞凋亡

    40μmol/L、80μmol/L的 ICT作用 EL-4細(xì)胞6 h,凋亡細(xì)胞百分率分別為12.3%和71.7%。隨著劑量增高,凋亡百分率亦增高。如圖8~10所示。

    圖8 對(duì)照組Fig.8 The control group

    圖9 40μmol/L實(shí)驗(yàn)組,可見(jiàn)到明顯凋亡峰Fig.9 40μmol/L group,the apoptotic peak can be seen clearly

    2.3 ICT對(duì)EL-4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因m RNA表達(dá)的影響

    由圖11可見(jiàn)紫外光下顯示明亮清晰的18 s與28 s兩條rRNA帶,說(shuō)明提取的RNA完整。EL-4細(xì)胞處理組(40μmol/L ICT作用6 h)與對(duì)照組比較顯示,Bcl-2、P21的 mRNA在藥物作用后表達(dá)明顯下調(diào)(圖11)。

    圖10 80μmol/L實(shí)驗(yàn)組,凋亡峰愈加明顯Fig.10 80μmol/L group,the apoptotic peakbecame more obvious

    圖11 ICT對(duì)EL-4細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 mRNA表達(dá)的影響Fig.11 The effect of ICT on the expression ofmRNA of apoptosis-related gene of EL-4 cells

    2.4 ICT對(duì)EL-4細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9酶活性的影響

    經(jīng)40μmol/L、80μmol/L的 ICT處理 EL-4細(xì)胞6 h后 Caspase-3與 Caspase-9酶活性明顯提高(表3、圖12)。

    3 討論

    有研究表明,ICT具有雌激素樣活性[3],并可誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞[4];增強(qiáng)誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞共表達(dá)神經(jīng)元特異性微管蛋白(βtubulin III)和膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶[5]。近年來(lái),其抗腫瘤作用備受人們關(guān)注。文獻(xiàn)表明ICT可通過(guò)G1期阻滯抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[1],具有一定的抗腫瘤活性。但其對(duì)淋巴瘤的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

    表3 不同濃度ICT對(duì)Caspase-3與Caspase-9酶活性的影響Tab.3 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

    圖12 不同濃度ICT(μmol/L)對(duì)Caspase-3與Caspase-9酶活性的影響Fig.12 The effect on the enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9 of ICT in different dose

    本研究將不同濃度的ICT與EL-4細(xì)胞共培養(yǎng),采用 MTT比色法檢測(cè)其對(duì)EL-4細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示在5~20μmol/L濃度范圍內(nèi),ICT對(duì)EL-4細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用,并且隨著濃度的提高,作用時(shí)間的延長(zhǎng),抑制作用愈明顯,呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

    細(xì)胞凋亡(apoptosis)是為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。細(xì)胞凋亡失常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡對(duì)于腫瘤的治療具有重大意義[6]。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組在二倍體峰的左側(cè)出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡特征峰,且隨著劑量的增加,凋亡峰也愈加明顯,顯示出劑量依賴(lài)性。在透射電鏡下,可發(fā)現(xiàn)對(duì)照組很難見(jiàn)到凋亡細(xì)胞,而實(shí)驗(yàn)組則能觀(guān)察到成片較多的典型的凋亡細(xì)胞,不僅能看到凋亡各個(gè)時(shí)期的表現(xiàn),而且能看到大量凋亡小體。這些結(jié)果提示ICT能夠誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞的凋亡。

    在此基礎(chǔ)上,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了ICT誘導(dǎo)凋亡的可能機(jī)制。

    細(xì)胞凋亡受到各種凋亡調(diào)控蛋白的調(diào)控[7]。Bcl-2首先在人類(lèi)濾泡性淋巴瘤中被確認(rèn),是發(fā)現(xiàn)最早的抗凋亡基因[8],是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)者。這一家族的某些成員為凋亡激動(dòng)蛋白(如 Bax,Bak,Bcl-xs,Bad,Bid等),而另一些成員則為凋亡拮抗蛋白(如Bcl-2,Bcl-XL,Bcl-w等)。我們的研究結(jié)果顯示ICT能使 EL-4細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),提示Bcl-2參與了ICT誘導(dǎo)EL-4細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程。

    P21蛋白最初被認(rèn)為是一種能引起細(xì)胞周期停滯的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白,在藥物誘導(dǎo)的腫瘤抑制中起重要作用。近來(lái),大量研究表明根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型及微環(huán)境不同,P21既有促凋亡作用,也有抑制調(diào)亡作用[9]。其阻止凋亡作用的機(jī)制可能與 Caspase-3介導(dǎo)的 P21裂解使 cyclinA/CDK2活性改變有關(guān)。Adachi等[10]研究發(fā)現(xiàn)缺氧可增加 Caspase-3活性,裂解P21,使其表達(dá)下降而致cyclinA/CDK2活性上調(diào),引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ICT作用EL-4細(xì)胞后,P21 mRNA表達(dá)下調(diào),提示P21可能參與EL-4細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

    Caspase家族是一類(lèi)蛋白水解酶,在細(xì)胞內(nèi)以無(wú)活性的酶原形式存在。是執(zhí)行凋亡的主要酶類(lèi),絕大部分細(xì)胞凋亡依賴(lài)于其存在[11]。通常認(rèn)為Caspase-9屬于凋亡起始組,而 Caspase-3是凋亡的主要執(zhí)行者,屬于凋亡效應(yīng)組。一旦被激活,起始Caspase即轉(zhuǎn)活化其他 Caspase酶原,引起級(jí)聯(lián)激活效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。激活的 Caspase-3作用于底物PARP,使之發(fā)生水解,其水解產(chǎn)物促進(jìn)細(xì)胞骨架降解和 DNA片斷化[12]。本研究通過(guò)比色法Caspase-3、Caspase-9酶活性檢測(cè)顯示 40μmol/L ICT能夠顯著增強(qiáng) EL-4細(xì)胞 Caspase-3酶活性,也可同時(shí)增強(qiáng)Caspase-9酶活性,可能是促進(jìn) EL-4細(xì)胞的凋亡的因素之一。

    綜上所述,ICT體外可有效抑制EL-4細(xì)胞的生長(zhǎng),并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡??紤]其作用可能通過(guò)下調(diào)bcl-2、P21 mRNA表達(dá),激活Caspase-3、Caspase-9蛋白等途徑實(shí)現(xiàn)的。

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