十六種鳥類二級抗體的制備和辣根過氧化物酶標(biāo)記

林樹柱，楊 帆，劉先菊，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

鳥綱是動物種類最多的一個綱，世界上現(xiàn)存的鳥類有近9000種。鳥類與人類的關(guān)系也極為密切，有些鳥類作為寵物被人類豢養(yǎng)在家中，有些作為經(jīng)濟(jì)鳥類被大規(guī)模飼養(yǎng)，還有些鳥類是珍惜保護(hù)動物。鳥類的疫病常常會引起鳥的大量死亡，而且有些疫病甚至?xí)魅窘o人類，因此對鳥類疫病進(jìn)行監(jiān)測，對保障國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展與人類健康具有重要意義。血清學(xué)檢測是動物病原檢疫的重要手段，而標(biāo)記的動物二級抗體是建立血清學(xué)檢測技術(shù)的重要工具。但是世界范圍內(nèi)都缺乏標(biāo)記的抗鳥類的二級抗體，為此本研究分離純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種禽類的IgY，免疫大耳白兔制備了兔抗這些鳥類的二級抗體，并用辣根過氧化物酶（HRP）對制備的二級抗體進(jìn)行了標(biāo)記，為鳥類血清學(xué)檢測體系的建立提供了工具。

1 材料和方法

1.1 16種鳥類IgY的分離純化

孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺去脂的卵黃液，采用親和層析和飽和硫酸銨沉淀的方法進(jìn)一步純化IgY，去脂卵黃液稀釋后過 Hitrap IgY Purification HP親和柱，親和產(chǎn)物再利用飽和硫酸銨進(jìn)一步沉淀。具體純化方法參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。

赤嘴潛鴨、燕鷗、長腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨IgY通過切膠的方法進(jìn)行純化［3］。去脂卵黃液經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，得到 IgY的粗提液，再將粗提液在12％的SDS-PAGE上分離，電泳完畢后，小心將膠取下，從中間和兩側(cè)分別縱向切下三個條帶，寬度約0.5 mm。取下凝膠，切下的膠條常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250染色法染色15 m in。再置脫色液中脫色至條帶清晰可見。將膠條復(fù)位，對照染過色的膠條的目的條帶，用刀片切下未染色部分的凝膠相應(yīng)位置的目的條帶，加生理鹽水將膠條研碎，備免疫用。

1.2 兔抗16種鳥類抗血清的制備及二級抗體IgG的純化

利用純化的16種鳥類IgY免疫大耳白兔，制備兔抗這16種鳥類一級抗體的抗血清，具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行［4］。抗血清效價(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測定［5］。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS （20 mmol/L，pH 7.0）稀釋，0.45μm膜過濾，利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 m L的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析［6］，純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.3 兔抗16種鳥類二級抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測定

兔抗16種鳥類二級抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法，具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行［3，7］。

用直接ELISA法測定標(biāo)記抗體的工作濃度，利用非切膠純化的 11種鳥類的 IgY 10μg/m L，0.1 m L/孔包被 ELISA板，4℃過夜。次日洗滌、封閉，相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1％BSA-PBS液梯度稀釋，分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1 m L，37℃孵育1 h后洗滌3次，3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃反應(yīng)15 min。以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度［3］。

1.4 W estern blotting方法檢測標(biāo)記抗體

16種去脂的卵黃液利用12％的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級抗體進(jìn)行孵育，室溫1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 m in，與底物反應(yīng)后曝光。

2 結(jié)果

2.1 純化16種鳥類卵黃抗體IgY

利用水稀釋法、改良的飽和硫酸銨分級沉淀法、親和層析或SDS-PAGE凝膠切膠純化的方法純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種禽類的 IgY，11種非切膠純化的禽類 IgY經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求（圖1） 2.2 Protein A純化兔抗16種鳥類的二級抗體

圖1 純化的鳥類IgY的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified bird IgY

通過Protein A親和層析純化兔抗16種鳥類抗血清中的IgG，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶，幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。

2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)

采用過碘酸鈉法對兔抗16種鳥類IgY的二級抗體進(jìn)行了HRP標(biāo)記，并用ELISA方法對其中11種標(biāo)記二級抗體的效價(jià)進(jìn)行了分析。以10μg/m L鳥類的IgY包被ELISA板，0.1 m L/孔，相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1％BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋，每個稀釋度二孔，37℃孵育1 h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L，37℃15 m in。以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/630 nm雙波長讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。

2.4 W estern b lotting方法檢測標(biāo)記抗體

16種去脂的卵黃液利用12％的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離，濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上，封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級抗體進(jìn)行孵育，室溫1 h，TBST洗膜3次，10 min/次，TBS洗膜10 min，與底物反應(yīng)后曝光，結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級抗體的稀釋倍數(shù)分別為：HRP標(biāo)記的兔抗虎皮鸚鵡IgY的二級抗體1∶200；HRP標(biāo)記的兔抗灰雁、小鵜、鴿子、鵪鶉、草鷺、夜鷺、燕鷗IgY的二級抗體1∶500；HRP標(biāo)記的兔抗赤嘴潛鴨、翹鼻麻鴨、長腳鷸IgY的二級抗體1∶1000；HRP標(biāo)記的兔抗鵝、貴妃雞 IgY的二級抗體1∶2000；HRP標(biāo)記的兔抗鸕鶿、鴕鳥 IgY的二級抗1∶3000；HRP標(biāo)記的兔抗孔雀IgY的二級抗體1∶30000。Western blotting結(jié)果如圖2。

表1 ELISA方法檢測HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

圖2 Western blot檢測酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of rabbit IgG-HRP against the birds IgY with Western blot

3 討論

卵黃抗體IgY是鳥類的主要抗體，其在卵成熟過程中從血清傳遞到卵黃中，IgY在卵黃中的含量超過其在血清中的含量［4］。本文建立了多種鳥類IgY純化的方法，通過水稀釋去脂、改良飽和硫酸銨沉淀、親和層析、切膠回收等方法，純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種鳥類的 IgY。免疫大耳白兔制備了兔抗這些鳥類的二級抗體，并用辣根過氧化物酶（HRP）對制備的二級抗體進(jìn)行了標(biāo)記，結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗麻雀二級抗體，本項(xiàng)研究共建立了18種鳥類的血清學(xué)檢測系統(tǒng)。這18種鳥類中有鸚鵡等在家庭中廣泛豢養(yǎng)的鳥類，也有鵝、鴿子等大規(guī)模飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)鳥類，還有孔雀等觀賞鳥類，既有灰雁等長距離遷徙的鳥類，也有麻雀等生活在人類周圍的留鳥，這個標(biāo)記鳥類抗體庫的建立部分的解決了動物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測系統(tǒng)不完備的問題，為鳥類疫病的監(jiān)測和控制提供了有效的工具。

鳥類是與人類關(guān)系極為密切，其作為寵物生活在人類家庭中，與人類日常生活關(guān)系密切，作為經(jīng)濟(jì)動物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分，鳥類還是人類食物的重要來源。鳥類疫病常常會引起鳥類的大量死亡，同時(shí)也會給人類的健康帶來威脅。鳥類傳播的人獸共患病多數(shù)為無臨床癥狀或自限性的，但偶爾也會出現(xiàn)嚴(yán)重疾病。而且鳥類的活動范圍較大，尤其是遷徙鳥類，這種遠(yuǎn)距離的遷徙，增加了病原微生物擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，易導(dǎo)致爆發(fā)大范圍的感染性疾病。例如高致病性禽流感至今已蔓延了全球多個國家，數(shù)以百萬的禽類死亡，同時(shí)也引起感染病人的死亡。與鳥類相關(guān)病原體，引起人類呼吸系統(tǒng)或肺部疾病的有：鸚鵡熱，禽流感、組織胞漿菌病、新城疫等；引起胃腸系統(tǒng)癥狀的有：沙門氏菌感染、彎曲桿菌病、賈第鞭毛蟲病等；引起皮膚癥狀的有：丹毒絲菌病及一些由鳥類傳播的皮膚病等［8-11］。因此建立有效的鳥類病原檢測技術(shù)，控制鳥類疫病的發(fā)生，對保障人類的健康和社會的發(fā)展具有重要的意義。

［1］楊帆，劉先菊，林樹柱，等.三種雞形目雉科禽類卵黃抗體的純化及二抗的制備［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（11）： 652-655.

［2］楊帆，林樹柱，劉先菊，等.鷺科和鸕鶿科卵黃抗體的純化［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（11）：659-661.

［3］楊帆，劉先菊，林樹柱，等.兔抗麻雀 IgY酶標(biāo)抗體的制備［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（5）：41-44.

［4］楊帆，劉先菊，林樹柱，等.改良的硫酸銨沉淀法純化大雁的卵黃抗體［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（11）：625-628.

［5］林樹柱，李萬波，劉先菊，等.烏鱧血清免疫球蛋白IgM的分離純化及其兔抗血清的制備［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2007， 17（11）：648-651.

［6］林樹柱，李萬波，劉先菊，等.兔抗五種魚免疫球蛋白抗體的制備和HRP標(biāo)記［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（5）：45-49.

［7］金伯泉，李恩善.醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第1版）［M］.北京：世界圖書出版社，1990.

［8］Keels SJ，Kristine MT，Jan ML，et al.Polly canmake you sick： Pet bird-associated diseases［J］.Cleveland clinic journsl of medicine，2009，76（4）：235-243.

［9］Andersen AA，Vanrompay D.Avian chlamydiosis［J］.Rev Sci Tech.，2000，19（2）：396-404.

［10］Harris JM.Zoonotic diseases of birds［J］.Vet Clin North Am Small Anim Pract.1991，21（6）：1289-1298.

［11］林樹柱，張連峰.寵物對人類健康的潛在威脅［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（4）：80-86.