林樹柱,楊 帆,劉先菊,張連峰
(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)
鳥綱是動(dòng)物種類最多的一個(gè)綱,世界上現(xiàn)存的鳥類有近9000種。鳥類與人類的關(guān)系也極為密切,有些鳥類作為寵物被人類豢養(yǎng)在家中,有些作為經(jīng)濟(jì)鳥類被大規(guī)模飼養(yǎng),還有些鳥類是珍惜保護(hù)動(dòng)物。鳥類的疫病常常會(huì)引起鳥的大量死亡,而且有些疫病甚至?xí)魅窘o人類,因此對(duì)鳥類疫病進(jìn)行監(jiān)測(cè),對(duì)保障國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展與人類健康具有重要意義。血清學(xué)檢測(cè)是動(dòng)物病原檢疫的重要手段,而標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體是建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要工具。但是世界范圍內(nèi)都缺乏標(biāo)記的抗鳥類的二級(jí)抗體,為此本研究分離純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長(zhǎng)腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種禽類的IgY,免疫大耳白兔制備了兔抗這些鳥類的二級(jí)抗體,并用辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記,為鳥類血清學(xué)檢測(cè)體系的建立提供了工具。
1.1 16種鳥類IgY的分離純化
孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺去脂的卵黃液,采用親和層析和飽和硫酸銨沉淀的方法進(jìn)一步純化IgY,去脂卵黃液稀釋后過 Hitrap IgY Purification HP親和柱,親和產(chǎn)物再利用飽和硫酸銨進(jìn)一步沉淀。具體純化方法參照文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。
赤嘴潛鴨、燕鷗、長(zhǎng)腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨IgY通過切膠的方法進(jìn)行純化[3]。去脂卵黃液經(jīng)飽和硫酸銨沉淀,得到 IgY的粗提液,再將粗提液在12%的SDS-PAGE上分離,電泳完畢后,小心將膠取下,從中間和兩側(cè)分別縱向切下三個(gè)條帶,寬度約0.5 mm。取下凝膠,切下的膠條常規(guī)考馬斯亮藍(lán)R-250染色法染色15 m in。再置脫色液中脫色至條帶清晰可見。將膠條復(fù)位,對(duì)照染過色的膠條的目的條帶,用刀片切下未染色部分的凝膠相應(yīng)位置的目的條帶,加生理鹽水將膠條研碎,備免疫用。
1.2 兔抗16種鳥類抗血清的制備及二級(jí)抗體IgG的純化
利用純化的16種鳥類IgY免疫大耳白兔,制備兔抗這16種鳥類一級(jí)抗體的抗血清,具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[4]??寡逍r(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)定[5]。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS (20 mmol/L,pH 7.0)稀釋,0.45μm膜過濾,利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 m L的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析[6],純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
1.3 兔抗16種鳥類二級(jí)抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測(cè)定
兔抗16種鳥類二級(jí)抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法,具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行[3,7]。
用直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記抗體的工作濃度,利用非切膠純化的 11種鳥類的 IgY 10μg/m L,0.1 m L/孔包被 ELISA板,4℃過夜。次日洗滌、封閉,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液梯度稀釋,分別加入反應(yīng)孔中,每個(gè)稀釋度二孔,每孔0.1 m L,37℃孵育1 h后洗滌3次,3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L,37℃反應(yīng)15 min。以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長(zhǎng)450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度[3]。
1.4 W estern blotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體
16種去脂的卵黃液利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,TBS洗膜10 m in,與底物反應(yīng)后曝光。
2.1 純化16種鳥類卵黃抗體IgY
利用水稀釋法、改良的飽和硫酸銨分級(jí)沉淀法、親和層析或SDS-PAGE凝膠切膠純化的方法純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長(zhǎng)腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種禽類的 IgY,11種非切膠純化的禽類 IgY經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求(圖1) 2.2 Protein A純化兔抗16種鳥類的二級(jí)抗體
圖1 純化的鳥類IgY的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified bird IgY
通過Protein A親和層析純化兔抗16種鳥類抗血清中的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶,幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。
2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)
采用過碘酸鈉法對(duì)兔抗16種鳥類IgY的二級(jí)抗體進(jìn)行了HRP標(biāo)記,并用ELISA方法對(duì)其中11種標(biāo)記二級(jí)抗體的效價(jià)進(jìn)行了分析。以10μg/m L鳥類的IgY包被ELISA板,0.1 m L/孔,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋,每個(gè)稀釋度二孔,37℃孵育1 h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L,37℃15 m in。以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。
2.4 W estern b lotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體
16種去脂的卵黃液利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光,結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)分別為:HRP標(biāo)記的兔抗虎皮鸚鵡IgY的二級(jí)抗體1∶200;HRP標(biāo)記的兔抗灰雁、小鵜、鴿子、鵪鶉、草鷺、夜鷺、燕鷗IgY的二級(jí)抗體1∶500;HRP標(biāo)記的兔抗赤嘴潛鴨、翹鼻麻鴨、長(zhǎng)腳鷸IgY的二級(jí)抗體1∶1000;HRP標(biāo)記的兔抗鵝、貴妃雞 IgY的二級(jí)抗體1∶2000;HRP標(biāo)記的兔抗鸕鶿、鴕鳥 IgY的二級(jí)抗1∶3000;HRP標(biāo)記的兔抗孔雀IgY的二級(jí)抗體1∶30000。Western blotting結(jié)果如圖2。
表1 ELISA方法檢測(cè)HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA
圖2 Western blot檢測(cè)酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of rabbit IgG-HRP against the birds IgY with Western blot
卵黃抗體IgY是鳥類的主要抗體,其在卵成熟過程中從血清傳遞到卵黃中,IgY在卵黃中的含量超過其在血清中的含量[4]。本文建立了多種鳥類IgY純化的方法,通過水稀釋去脂、改良飽和硫酸銨沉淀、親和層析、切膠回收等方法,純化了灰雁、鸕鶿、鴕鳥、小鵜、鴿子、鵝、孔雀、鵪鶉、貴妃雞、草鷺、夜鷺、赤嘴潛鴨、燕鷗、長(zhǎng)腳鷸、虎皮鸚鵡、翹鼻麻鴨等16種鳥類的 IgY。免疫大耳白兔制備了兔抗這些鳥類的二級(jí)抗體,并用辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記,結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗麻雀二級(jí)抗體,本項(xiàng)研究共建立了18種鳥類的血清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)。這18種鳥類中有鸚鵡等在家庭中廣泛豢養(yǎng)的鳥類,也有鵝、鴿子等大規(guī)模飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)鳥類,還有孔雀等觀賞鳥類,既有灰雁等長(zhǎng)距離遷徙的鳥類,也有麻雀等生活在人類周圍的留鳥,這個(gè)標(biāo)記鳥類抗體庫(kù)的建立部分的解決了動(dòng)物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不完備的問題,為鳥類疫病的監(jiān)測(cè)和控制提供了有效的工具。
鳥類是與人類關(guān)系極為密切,其作為寵物生活在人類家庭中,與人類日常生活關(guān)系密切,作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分,鳥類還是人類食物的重要來源。鳥類疫病常常會(huì)引起鳥類的大量死亡,同時(shí)也會(huì)給人類的健康帶來威脅。鳥類傳播的人獸共患病多數(shù)為無臨床癥狀或自限性的,但偶爾也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重疾病。而且鳥類的活動(dòng)范圍較大,尤其是遷徙鳥類,這種遠(yuǎn)距離的遷徙,增加了病原微生物擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn),易導(dǎo)致爆發(fā)大范圍的感染性疾病。例如高致病性禽流感至今已蔓延了全球多個(gè)國(guó)家,數(shù)以百萬的禽類死亡,同時(shí)也引起感染病人的死亡。與鳥類相關(guān)病原體,引起人類呼吸系統(tǒng)或肺部疾病的有:鸚鵡熱,禽流感、組織胞漿菌病、新城疫等;引起胃腸系統(tǒng)癥狀的有:沙門氏菌感染、彎曲桿菌病、賈第鞭毛蟲病等;引起皮膚癥狀的有:丹毒絲菌病及一些由鳥類傳播的皮膚病等[8-11]。因此建立有效的鳥類病原檢測(cè)技術(shù),控制鳥類疫病的發(fā)生,對(duì)保障人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要的意義。
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