季節(jié)性流感病毒H1N1實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

許黎黎，鮑琳琳，秦 川

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，其流行特點(diǎn)是傳播迅速，波及范圍廣。迄今為止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，給人類社會(huì)的經(jīng)濟(jì)及健康造成了巨大損失［1］。

流感病毒屬于正黏病毒科，其基因組為分節(jié)段負(fù)鏈RNA，根據(jù)病毒核衣殼蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（M）不同可分為甲、乙、丙三種型別，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，甲型流感病毒根據(jù)病毒表面血凝素抗原的不同分為16個(gè)HA亞型；根據(jù)神經(jīng)氨酸酶抗原的不同分為9個(gè)NA亞型［2］。甲型流感病毒中的 H1N1亞型曾經(jīng)在1918年引起世界流感的大流行，自 1997年以后，H1N1亞型與 H3N2亞型交替在人群中流行。從2002開始我國(guó)的流感一直由H3N2占優(yōu)勢(shì)，持續(xù)了近3年后，2005年的9月以后H1N1亞型流感毒株重新成為我國(guó)的流感流行的優(yōu)勢(shì)毒株［3，4］，已對(duì)人類的健康及社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成極大的威脅。因此，研究快速、敏感、特異的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)是早期發(fā)現(xiàn)病人，掌握傳播途徑和制定預(yù)防措施的根本。

目前國(guó)內(nèi)診斷流感病毒的主要方法包含病毒分離和血清學(xué)診斷反應(yīng)等，但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不宜于疾病初期的快速診斷與篩查，而核酸檢測(cè)靈敏度高、快速、特異等優(yōu)勢(shì)決定了其在臨床檢測(cè)中的重要地位，傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）不僅無(wú)法對(duì)樣本中的病毒進(jìn)行定量檢測(cè)，而且擴(kuò)增反應(yīng)后需要電泳檢測(cè)，這不僅不適于大批量樣本的篩選，而且容易因操作污染造成假陽(yáng)性。近年發(fā)展起來(lái)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（Real-time quantitative PCR）是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，不僅具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且通過(guò)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀，并有效地減少了假陽(yáng)性發(fā)生的機(jī)會(huì)，已成為病原體檢測(cè)的重要方法。

SYBR GreenⅠ是一種非探針型熒光染料，可以與雙鏈DNA非特異性結(jié)合而發(fā)出熒光，由于其相對(duì)探針型染料價(jià)格低廉，因此已被廣泛應(yīng)用于不同病原體的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中。從目前的文獻(xiàn)查詢結(jié)果得知，尚未有基于SYBR GreenⅠ染料法的季節(jié)性流感病毒H1N1的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，我們建立了一種可以快速定量檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1的方法，靈敏度高，可用作基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)季節(jié)性流感病毒H1N1感染的輔助診斷方法和臨床效果的監(jiān)測(cè)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

季節(jié)性流感病毒H1N1分離株A/Brisbane/59/ 2007由香港大學(xué)陳鴻霖教授提供，MDCK細(xì)胞由本所保存，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購(gòu)自 QIAGEN公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System 購(gòu)自Invitrogen公司，熒光染料 Power SYBR Green PCR Master M ix，48孔0.2 m L PCR反應(yīng)管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光學(xué)反應(yīng)蓋膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均購(gòu)自ABI公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 特異性引物的設(shè)計(jì)與合成：

選擇季節(jié)性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作為檢測(cè)靶目標(biāo)，首先從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載季節(jié)性流感病毒H1N1、H3N2、高致病性禽流感病毒H5N1、2009年新型甲型H1N1病毒等代表株的NP基因全序列，使用Clustal W軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，篩選出季節(jié)性流感病毒H1N1特異性的保守序列作為引物候選區(qū)域。

應(yīng)用Primer Express及Primer Prem ier 5.0軟件包對(duì)候選引物進(jìn)行進(jìn)一步配對(duì)及篩選，得到最優(yōu)特異性檢測(cè)引物。引物設(shè)計(jì)及挑選遵循下列原則：①選用的引物位于季節(jié)性流感病毒H1N1 NP基因的保守區(qū)，與新型H1N1、H3N2、H5N1等其他亞型無(wú)交叉反應(yīng)；②引物長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基；③引物的GC％要求在40％～60％，理論Tm＞50℃；④引物自身之間盡可能避免堿基配對(duì)；⑤擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度介于100～500 bp之間。

1.1.2 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的制備

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的 MDCK細(xì)胞接種 A/ Brisbane/59/2007毒株48 h后，取100μL細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照RNeasy Mini Kit說(shuō)明書提取病毒RNA，溶于30μL RNase-free H2O中。

取8μL病毒 RNA，按照 SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System說(shuō)明書合成第一鏈cDNA。

基于NP基因5’及3’端序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物，由病毒全長(zhǎng) cDNA擴(kuò)增出 NP基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)NP基因的擴(kuò)增情況，并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收及純化。

用紫外分光光度計(jì)對(duì)回收后的NP全長(zhǎng)基因進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，并換算成拷貝數(shù)。

1.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將計(jì)算好拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，從1×1010copies/μL稀釋至1×102copies/μL，共9個(gè)梯度。

配置 real-time PCR Mix，按順序依次加入： SYBR Green PCR Master Mix（2×）10μL；5μM正反向引物各1μL；RNase-free H2O 6μL。將混合液均分至48孔0.2 m L PCR反應(yīng)管 Fast Optical 48-well RXN Plate中，每管各加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品2μL，貼上光學(xué)反應(yīng)蓋膜 48-Well Optical Adhesive Film 25PK。打開 ABI STEPONE PCR儀及電腦，運(yùn)行real-time PCR主程序。將48孔反應(yīng)板放置在PCR儀上，開始以下 PCR程序：94℃預(yù)變性3 m in；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，重復(fù)35次，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后收集熒光信號(hào)。熔解曲線從 60℃至 95℃，每0.3℃讀取一次吸光值。

1.1.4 重復(fù)性測(cè)試

每個(gè)梯度樣品均平行設(shè)三個(gè)重復(fù)樣，PCR重復(fù)三次，最終通過(guò) MicroOffice Excel軟件計(jì)算循環(huán)閾值（Ct）的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV）。

2 結(jié)果

2.1 季節(jié)性流感病毒H1N1的特異性引物的設(shè)計(jì)

經(jīng)序列同源性比對(duì)分析，篩選出季節(jié)性流感病毒H1N1特異性的保守序列作為引物候選區(qū)域后，再依據(jù)引物設(shè)計(jì)及挑選基本原則，本實(shí)驗(yàn)最終采用的特異性檢測(cè)引物序列如下：SF-F（1141-1160）：5’-ctgagaagcagatactgggc-3’，SF-R（1460-1480）：5’-ctgcattgtctccgaagaaat-3’。擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為340 bp，退火溫度55℃。

2.2 季節(jié)性流感病毒H1N1N基因標(biāo)準(zhǔn)品的制備

基于NP基因5’及3’端序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物，由 A/Brisbane/59/2007毒株全長(zhǎng) cDNA擴(kuò)增出NP基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)NP基因的擴(kuò)增情況，結(jié)果如圖1所示。對(duì)目的條帶（1497 bp）進(jìn)行切膠回收及純化后，用紫外分光光度計(jì)對(duì)回收后的NP全長(zhǎng)基因進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，依據(jù)公式計(jì)算出拷貝數(shù)。

2.3 擴(kuò)增曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線的建立及靈敏度和特異性評(píng)估

圖1 季節(jié)性流感病毒H1N1全長(zhǎng)N基因的PCR擴(kuò)增及檢測(cè)Fig.1 PCR amplification and detection of full length N gene of seasonal influenza H1N1 virus

將標(biāo)準(zhǔn)品做10倍梯度稀釋，從1×1010copies/ μL稀釋至1×102copies/μL，共9個(gè)梯度。標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，其中不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品間線性關(guān)系（R2）達(dá)0.999，斜率介于-3.0至 -3.5之間，為 -0.3433，擴(kuò)增效率為95.572％，亦位于標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增效率范圍內(nèi)。熔解曲線

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1的熔解曲線Fig.4 Melting curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

如圖4所示，所有標(biāo)準(zhǔn)品均在83.2℃出現(xiàn)尖且窄的特異性熔解峰。將熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示，特異性條帶亮度隨模板拷貝數(shù)梯度降低而等倍下降。綜上評(píng)估結(jié)果，可見本定量檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度達(dá)102copies/μL，無(wú)非特異性擴(kuò)增，定量結(jié)果真實(shí)可靠。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1后瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.5 Results of electrophoresis after the real-timePCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

2.4 重復(fù)性驗(yàn)證

將9個(gè)梯度樣品均平行設(shè)三個(gè)重復(fù)樣，PCR重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)Ct的的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV），結(jié)果如表1所示，CV值均低于1％，證明所有數(shù)據(jù)重復(fù)性良好，檢測(cè)系統(tǒng)非常穩(wěn)定。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1數(shù)據(jù)的重復(fù)性驗(yàn)證Tab.1 Reproducibility of the real-time PCR for seasonal influenza virus H1N1 detection

3 討論

流感病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括病毒細(xì)胞培養(yǎng)、血清學(xué)診斷以及抗原檢測(cè)。病毒通過(guò)感染敏感的組織細(xì)胞可以被分離鑒定出來(lái)，這可以作為流感病毒感染最直接，最可靠的依據(jù)。另外，急性期血清較恢復(fù)期血清抗體有4倍增加也是流感病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)。但是前者耗時(shí)長(zhǎng)，一般來(lái)說(shuō)細(xì)胞培養(yǎng)需要3～4 d，而后者需采集患者急性期及恢復(fù)期雙份血清進(jìn)行抗體測(cè)定，且很容易出現(xiàn)與其他亞型的交叉反應(yīng)，這些缺陷限制了兩種方法在臨床上的快速診斷?？乖闹苯訖z測(cè)包括對(duì)病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及核酸的檢測(cè)。病毒結(jié)構(gòu)蛋白的檢測(cè)基于抗原抗體的反應(yīng)、偶聯(lián)酶或者化學(xué)生色原或者熒光染料，包括免疫熒光（immunofluorescence，IF）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA），直接或間接免疫熒光試驗(yàn)的敏感度波動(dòng)在40％ ～100％，特異性在86％ ～99％，但是由于需要熒光顯微鏡特殊儀器而限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前對(duì)流感病毒抗原核酸的最優(yōu)檢測(cè)手段是實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，它將高靈敏性、高特異性和高準(zhǔn)確性結(jié)為一體，克服了傳統(tǒng)PCR費(fèi)時(shí)、易污染、低通量等缺點(diǎn)，可對(duì)樣本中的流感病毒核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)［5-7］。

SYBR GreenⅠ是一種結(jié)合于雙鏈 DNA小溝中的熒光染料，與雙鏈 DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)，這一性質(zhì)使其用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常理想。在 PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR GreenⅠ熒光染料，其特異性地?fù)饺?DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與 PCR產(chǎn)物的增加完全同步［8］。

SYBR GreenⅠ在核酸的實(shí)時(shí)檢測(cè)方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，因此通用性好，且價(jià)格相對(duì)較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔解曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增，進(jìn)一步地還可以實(shí)現(xiàn)單色多重測(cè)定。此外，由于一個(gè) PCR產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合，因此SYBR GreenⅠ的靈敏度很高。但是，由于 SYBR GreenⅠ與所有的雙鏈 DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽(yáng)性會(huì)影響定量的精確性。通過(guò)測(cè)量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響［9］。

NP基因在流感病毒的8個(gè)基因片段中相對(duì)保守［1］，選取NP基因作為擴(kuò)增的模板能兼顧同亞型不同毒株之間的保守序列，保證了該檢測(cè)方法對(duì)于H1N1病毒的通用性。同時(shí)，在進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，注意同流感病毒H3、H5、H7、H9等其它亞型之間的序列比較，選取的序列應(yīng)與其它亞型有較大差異，以保證擴(kuò)增的特異性。將上、下游引物進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與上、下游引物完全匹配的序列都是H1N1亞型序列，除此以外沒有找到與引物有很大相似性的其它核酸序列。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)沒有發(fā)現(xiàn)任何非特異性條帶，表明PCR擴(kuò)增的特異性。

季節(jié)性流感病毒H1N1的RT-PCR檢測(cè)靈敏度在1000 copies/μL左右，從病毒核酸提取、RT-PCR反應(yīng)到瓊脂糖凝膠電泳，整個(gè)過(guò)程大約需要6～7 h左右，而本方法靈敏度可達(dá)100 copies/μL，比普通RT-PCR提高了10倍左右，從核酸提取至完成檢測(cè)，僅需要4 h左右，并且能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多樣本的高通量檢測(cè)。

綜上所述，我們建立了一套快速定量檢測(cè)季節(jié)性流感病毒H1N1的方法，特異性及靈敏度高，可用作基礎(chǔ)及臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)季節(jié)性流感病毒H1N1感染的輔助診斷方法和臨床效果的監(jiān)測(cè)手段，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者要求相對(duì)較低，具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。

（本研究成果已申請(qǐng)專利，專利受理號(hào)： 201010278683.9。感謝香港大學(xué)陳鴻霖教授提供季節(jié)性流感病毒H1N1分離株A/Brisbane/59/2007。）

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