人胰腺癌裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和超聲成像比較

李小穎，董 偉，張連峰

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

胰腺癌是源發(fā)于胰腺的惡性腫瘤，文獻(xiàn)報(bào)道已建立胰 腺 癌 細(xì) 胞系有 SW1990［1］、Capan-2［1］、Patu8988［2］等約20余株［3］，其發(fā)病率和死亡率比大概是1：0.99。手術(shù)切除是胰腺癌能夠達(dá)到根治的唯一選擇，但胰腺癌早期缺少特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)比較晚。同時(shí)胰腺癌對(duì)放療、化療不敏感，因此建立適宜的人胰腺癌動(dòng)物模型，可以為深入研究胰腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制以及尋找新的治療策略提供有效的手段。

在臨床腫瘤學(xué)中，影像學(xué)方法測量腫瘤大小的改變是監(jiān)測患者對(duì)抗腫瘤治療反應(yīng)的常規(guī)方法，包括 CT（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發(fā)射 X線斷層攝影術(shù)（positron em ission tomography，PET）和超聲（ultrasound，US）。目前這些技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于小鼠腫瘤模型的監(jiān)測［4-7］。除此之外還有生物發(fā)光成像技術(shù)。每種技術(shù)都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)，但彼此可以互補(bǔ)［8］。本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記人胰腺癌細(xì)胞Capan-2并建立表達(dá)熒光素酶的胰腺癌裸鼠模型，利用生物發(fā)光成像和超聲成像技術(shù)對(duì)此模型內(nèi)的腫瘤生長進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測。同時(shí)評(píng)價(jià)了生物發(fā)光成像和小動(dòng)物超聲探測系統(tǒng)在胰腺癌裸鼠模型分析中的應(yīng)用和優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人胰腺癌細(xì)胞Capan-2本實(shí)驗(yàn)室凍存，L-谷氨酰胺（GIBCO公司）、雙抗（GIBCO公司）、DMEM（GIBCO公司）、胎牛血清（GIBCO公司）、G418（AMRESCO 公 司）、脂 質(zhì) 體 2000 （Invitrogene公司）?；铙w熒光影像系統(tǒng)（I.C.E.，日本 Roper公司）、倒置顯微鏡（Nikon TS100）。Vevo770TM小動(dòng)物超聲探測系統(tǒng)（加拿大Visualsonics公司）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（京）2007-0001］，6周齡，體重18～20 g，在本實(shí)驗(yàn)室無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）的飼養(yǎng)間［SYXK （京）2009-0003］飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為GC-09-2001）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10％胎牛血清、100 IU/m L青霉素，100μg/m L鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為Capan-2細(xì)胞的培養(yǎng)液，于5％CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［8］

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選：采用脂質(zhì)體 2000轉(zhuǎn)染Capan-2細(xì)胞（具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2000操作說明）。轉(zhuǎn)染后24 h，用含1000μg/m L G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞，直至形成肉眼可見的單克隆，挑取單克隆于96孔板培養(yǎng)至匯合度達(dá)70％ ～90％后，傳代（1∶2傳代），取其中一塊96孔板加入用DMEM配置的底物luciferin（1 mg/m L）20μL，放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 裸鼠胰腺癌移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，稀釋至1× 107cells/m L。取0.1 m L細(xì)胞懸液接種于裸鼠右后肢皮下；同時(shí)三溴乙醇腹腔內(nèi)麻醉裸鼠，75％酒精消毒皮膚，左上腹直腸旁線處行1.5 cmd的縱行切口，仔細(xì)分開胃和脾之間的薄膜，暴露胰腺，取0.1 m L細(xì)胞懸液接種于裸鼠胰腺被膜，并可見被膜下鼓起一透亮小泡為標(biāo)志，各接種3只。分別在接種的7 d、14 d、21 d和28 d4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察腫瘤的生長情況。觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物（1.5 mg/10 g），飽和三溴乙醇（0.18 m L/10 g）麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 超聲圖像采集：實(shí)驗(yàn)小鼠用三溴乙醇注射麻醉后（0.18 m L/10 g體重），置于檢測臺(tái)上，將臺(tái)溫設(shè)定為40℃，小鼠四肢用醫(yī)用膠布固定于涂有導(dǎo)電膠的電極上，記錄生理指標(biāo)。用 VisualSonics? Vevo770?操作系統(tǒng)和專門用于小鼠的 RMV704高頻超聲探頭，進(jìn)行 B型檢測。通過 VisualSonics? Vevo770?高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)Luc的單克隆細(xì)胞株

經(jīng)過轉(zhuǎn)染，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克?。ǚ?圖1），經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定，標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長方式、生長速度等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異，選取高表達(dá)Luc的克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)并接種裸鼠。

2.2 裸鼠胰腺癌腫瘤模型的生物發(fā)光成像和小動(dòng)物超聲影像學(xué)觀察

在胰腺原位裸鼠接種胰腺癌腫瘤細(xì)胞后第7天，用生物發(fā)光成像系統(tǒng)可以觀察到腫瘤發(fā)光（封2圖2，A-D），隨著觀察天數(shù)的增加，發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。超聲影像系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大小，細(xì)胞接種第14天能測量腫瘤的大小，隨著接種時(shí)間的增加，腫瘤的面積逐漸增大（封2圖2，E-H）。

2.3 胰腺癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型的小動(dòng)物超聲影像學(xué)觀察

小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞皮下接種第7天，可以測量腫瘤的大?。▓D3，A），但在腫瘤細(xì)胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大?。▓D3，E）。腫瘤細(xì)胞皮下和原位接種第14天后，隨著接種時(shí)間的增加，腫瘤的面積逐漸增大（圖3，I）。腫瘤細(xì)胞在皮下生長的速度比原位生長速度快3倍左右。

3 討論

圖3 人胰腺癌皮下和原位移植瘤的小動(dòng)物超聲成像比較A-D為原位移植瘤的小動(dòng)物超聲成像；E-H為皮下移植瘤的小動(dòng)物超聲成像，綠圈所指為腫瘤的面積；I為皮下和原位移植瘤生長曲線的比較Fig.3 Comparison of subcutaneous and orthotopically implanted cancer cells by ultrasound imaging A-D was the ultrasound imaging of orthotopic xenografts.E-H was the ultrasound imaging of subcutaneous xenografts.Green circles point to the tumor size.Iwas the comparison of tumor grow th between subcutaneous and orthotopic xenografts

高分清晰小動(dòng)物活體影像實(shí)時(shí)顯微成像系統(tǒng)是小動(dòng)物成像的專用設(shè)備，空間分辨率可達(dá)到30～ 100μm，已被廣泛應(yīng)用于各種小動(dòng)物的成像研究。如觀測小鼠胚胎在子宮內(nèi)的生長狀態(tài)、引導(dǎo)顯微穿刺或吸引操作、神經(jīng)發(fā)育監(jiān)測、心血管功能量化檢測、微血管血液流量評(píng)估、腫瘤生長進(jìn)行量化追蹤等。也可用于活體探測與癌相關(guān)的生物標(biāo)記早期分子的表達(dá)［9-11］。

作為分子影像學(xué)的方法之一，生物發(fā)光成像技術(shù)因其操作簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高的特點(diǎn)，越來越廣泛地被應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記人胰腺癌細(xì)胞 Capan-2，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆，將其接種于裸鼠胰腺被膜及右后肢皮下，利用生物發(fā)光成像和超聲成像技術(shù)對(duì)此模型內(nèi)的腫瘤生長進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞裸鼠胰腺原位移植成功率為75％，裸鼠皮下移植成功率為100％。人胰腺癌腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下生長的速度比原位生長速度快3倍左右。

生物發(fā)光成像和小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，從而對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異，與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比，可以大大減少動(dòng)物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則。生物發(fā)光成像與小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)相比具有（1）靈敏度高：生物發(fā)光成像系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞原位接種第7天，可以觀察到腫瘤發(fā)光；小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大小。（2）直觀簡便：試驗(yàn)中只需將動(dòng)物置于圖像采集箱中，即可見腫瘤的生長部位，大小。（3）視野大：可對(duì)小動(dòng)物整體成像。但是由于腫瘤細(xì)胞通常沒有特定的光學(xué)性質(zhì)來區(qū)分正常組織，多采取可檢測的特異性標(biāo)記物來標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，使腫瘤細(xì)胞成為發(fā)光源，然后接種活體實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的活體成像，實(shí)驗(yàn)周期較長；腫瘤的大小以靶細(xì)胞單位時(shí)間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)的絕對(duì)值表示，不能直接測量腫瘤的大?。?2］。小動(dòng)物超聲影像與生物發(fā)光成像相比具有（1）實(shí)驗(yàn)周期短：小動(dòng)物超聲成像是利用不同介質(zhì)對(duì)超聲波的回波強(qiáng)度不同成像的，因此不需要用特異性標(biāo)記物來標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)周期較小動(dòng)物活體成像短。（2）實(shí)時(shí)生成圖像，檢查操作者可動(dòng)態(tài)選擇對(duì)診斷最有用的部分觀察記錄，也可邊操作邊記錄。但超聲的檢查視野較生物發(fā)光成像小，探查深度有限，且不能為骨骼或者存在氣體的結(jié)構(gòu)成像，成像質(zhì)量有賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)。

人胰腺癌皮下移植瘤模型，雖能維持來源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)和生化特性，但由于皮下移植瘤易形成纖維性假胞膜，腫瘤呈局限性、膨脹式生長，很少發(fā)生遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移［13］，不符合人胰腺癌的生物學(xué)特性。人胰腺癌原位移植瘤模型不僅維持了原有瘤組織的結(jié)構(gòu)，還更好地模擬人胰腺癌在體內(nèi)的血供和生長環(huán)境，它在宿主體內(nèi)能以類似于患者體內(nèi)的方式顯示其惡性行為包括了原發(fā)腫瘤的生長、局部的浸潤和隨后遠(yuǎn)處臟器的轉(zhuǎn)移整個(gè)過程［13］。

綜上，生物發(fā)光成像和超聲成像系統(tǒng)能夠無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的監(jiān)測在體腫瘤的生長情況，生物發(fā)光成像與超聲成像相比，具有早期敏感和直觀簡便的優(yōu)點(diǎn)，為腫瘤模型的研究提供了理想工具。

［1］李小穎，蘇衛(wèi)，張連峰，等.SW1990和Capan-2紅色熒光標(biāo)記胰腺癌移植腫瘤模型的建立和比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2010，20（3）：12-18.

［2］王鳳力，李德春，張子祥，等.胰腺癌裸鼠皮下瘤模型建立的比較研究［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2007，27（3）：359 -360.

［3］崔全才，陳杰，顧長芳，等.一株人胰腺癌細(xì)胞系的建立極其特性［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1992，12（6）：50-52.

［4］Deroose CM，De A，Loening AM，et al.Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined smallanimal PET，small-animal CT and bioluminescence imaging［J］.JNucl Med，2007，48（2）：295-303.

［5］Hsu CX，Ross BD，Chrisp CE，et al.Longitudinal cohort analysis of lethal prostate cancer progression in transgenic mice［J］.JUorl，1998，160（4）：1500-1505.

［6］Snyder CS，Kaushal S，Kono Y，et al.Comp lementarity of ultrasound and fluorenscence imaging in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer［J］.BMC Cancer，2009，1471-2407/9/106.

［7］Turnbull DH，Ramsay JA，Shivji GS，et al.Ultrasound Backscatter Microscope Analysis of Mouse Melanoma Progression［J］.Ultrasound in Med＆Biol，1996，22（7）：845-853.

［8］李小穎，高 凱，董 偉，等.熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志

［9］武國軍，王福利，李曉武，等.轉(zhuǎn)基因小鼠前列腺癌及轉(zhuǎn)移的三維超聲微成像［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（3）：354-356.

［10］楊婭，李治安，王艷紅，等.小鼠心血管超聲生物顯微鏡顯像與磁共振成像的對(duì)照研究［J］.中華超聲影像學(xué)雜志，2010，19（1）：56-60.

［11］Beronja S，Livshits G，W illiams S，et al.Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos［J］.Nat Med，2010，16（7）：821-827.doi：10.1038/nm.2167.

［12］李小穎，高凱，劉學(xué)麗，等.人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HCT-8綠色熒光標(biāo)記腫瘤模型的建立［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（7）： 19-22.

［13］余澤前，周家華，胡亮，等.人胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1裸小鼠原位移植瘤模型的建立［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2008，27 （1）：27-30.