西藏小型豬Leptin及其受體胞外區(qū)片段的克隆及原核表達

吳麗紅，范 沛，王叢莉，劉玉鵬，黃黎珍，施振旦，顧為望

（1.南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510515；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642）

1994年Zhang等［1］在肥胖小鼠（ob/ob）中發(fā)現(xiàn)了肥胖基因，其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為瘦素（leptin）。體內(nèi)瘦素水平的高低影響脂肪的沉積。但后來有人在先天肥胖動物（如db/db小鼠和fa/fa大鼠）和過量攝食導(dǎo)致的肥胖動物中血 leptin的水平升高，說明這些動物體內(nèi)對leptin的反應(yīng)減弱或無反應(yīng)，此現(xiàn)象稱為 leptin抵抗［2］。Brown等［3］發(fā)現(xiàn)瘦素受體（leptin receptor，OBR）基因第12外顯子一個鳥苷酸殘基缺失，導(dǎo)致編碼序列框架移碼，小鼠出現(xiàn)糖尿病和肥胖。1995年，Tartaglia等［4］第一個成功地從小鼠脈絡(luò)叢中克隆出瘦素受體基因。

瘦素進入血液循環(huán)后游離或與瘦素受體結(jié)合，通過多種組織及多種形式的瘦素受體，作用于中樞及外周的多個位點，影響機體的許多生理和代謝過程，參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞的合成，進而使體重減輕，從而維持體內(nèi)脂肪或能量平衡［5-7］。

本實驗主要通過體外克隆西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼的部分基因，在大腸桿菌中定向表達重組豬瘦素成熟肽和瘦素受體蛋白片段，為進一步研究瘦素及其受體蛋白的生物學(xué)功能和利用瘦素及其受體重組融合蛋白預(yù)防與控制肥胖奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

皮下脂肪、肝臟組織取自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心暨比較醫(yī)學(xué)研究所提供的西藏小型豬（1頭、1周歲、雄性、25 kg、實驗動物合格證號：粵監(jiān)證字2006A055號），液氮運輸，-80℃低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。DH5α大腸桿菌、BL21（DE3）大腸桿菌和pRSETA載體均在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院遺傳與育種實驗室保存。

1.2 試劑和酶類

用于RNA抽提的Trizol，pMD18-T載體試劑盒，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，Taq DNA聚合酶，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000），T4連接酶均為 TaKaRa產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒為Omega產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本東洋紡（Toyobo）產(chǎn)品；用于純化的、帶有 His-tag的 50％ Ni-NTA 凝膠（Qiagen）和生物素化分子量標(biāo)準(zhǔn)（CST）購自基因公司（廣州）；OBR基因引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；其它試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.3 RNA抽提與反轉(zhuǎn)錄

RNA抽提按照Trizol試劑盒說明書操作，反轉(zhuǎn)錄根據(jù)日本東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1.4 套式PCR引物的設(shè)計

根據(jù)公布的西藏小型豬瘦素基因序列（GenBank號：GQ240885.1）和豬瘦素受體基因胞外域序列（GenBank號：AF167719.1）設(shè)計引物序列如下：

1.5 OBR基因片段擴增（套式PCR法）

瘦素成熟肽PCR反應(yīng)擴增體系為：上下游引物（20μmol/L）各 1μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1μL、2× GC buffer I 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、雙蒸 H2O 16.75μL。反應(yīng)條件： 98℃ 3 m in；98℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s；30個循環(huán)；72℃5 m in；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，-20℃保存?zhèn)溆?。以F1、R1為引物擴增得到的PCR產(chǎn)物命名為 OB。再以 OB為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：引物（M1+N1）（20μmol/ L）1μL、OB 1.5μL、2×GC buffer I 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、LA Taq（5U/μL）0.25μL、ddH2O 17.25μL。反應(yīng)條件：98℃ 3 m in；98℃ 30 s，69℃30 s，72℃ 30 s；30個循環(huán)；72℃ 5 min；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后 -20℃保存?zhèn)溆谩U增得到的PCR產(chǎn)物命名為mOB。

瘦素受體片段PCR反應(yīng)擴增體系為：上下游引物（20μmol/L）各1μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL、10×Ex Taq緩沖液 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、Ex Taq（5U/μL）0.25μL、ddH2O 16.75μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 m in；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min；30個循環(huán)；72℃5 min；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訤2、R2為引物擴增得到的PCR產(chǎn)物命名為AQ。再以AQ為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系為：引物（M2+N2）（20 μmol/L）1μL、AQ1.5μL、10×Ex Taq緩沖液2.5 μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、Ex Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL。反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s；30個循環(huán)；72℃ 5 m in；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后-20℃保存?zhèn)溆谩U增得到的PCR產(chǎn)物命名為mAQ。

1.6 OBR基因片段的T-A克隆和序列分析

將 PCR純化得到片段 mOB、mAQ分別與pMD18-T vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，挑取單菌落 7℃振蕩培養(yǎng) 12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng) PCR和BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒分別命名為TmOB、TmAQ，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.7 原核表達載體的構(gòu)建

將經(jīng)測序的陽性重組質(zhì)粒 TmOB、TmAQ用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切，切膠回收目的片段，同時將pRSETA質(zhì)粒載體用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切并切膠回收。然后將目的片段與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，小量提取質(zhì)粒DNA進行PCR、酶切和測序鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pR-OB、pROBR-a。將鑒定正確的質(zhì)粒細(xì)菌-20℃保種備用。

1.8 pR-OB、pR-OBR-a重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達和蛋白檢測、純化

將含有重組質(zhì)粒pR-OB、pR-OBR-a的保種菌液劃板接種于含有終濃度為2.5％的氨芐青霉素鈉LB平板上，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h。隨機挑取單菌落于2 m L離心管，37℃ 220 r/m in搖床培養(yǎng)過夜。次日吸取50μL菌液接種于含有1 m LLB培養(yǎng)基的4 m L離心管中，37℃ 220 r/m in搖床培養(yǎng)3 h后，加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，于37℃220 r/ m in繼續(xù)培養(yǎng)5 h，離心收集菌液。菌體加入適量的buffer B（8 mol/L尿素溶液）和5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5 m in，快速離心取上清于12％ SDS-PAGE進行電泳分析。并用 Ni-NTA凝膠在變性條件下按說明書純化蛋白，最后用含有 8 mol/L尿素的洗脫液洗脫下pR-OB、pR-OBR-a重組融合蛋白。

2 結(jié)果

2.1 西藏小型豬組織總RNA提取

將提取的西藏小型豬組織總RNA進行瓊脂糖電泳檢測，電泳結(jié)果顯示28S、18S、5SRNA條帶清晰（見圖1），并且用核酸蛋白測定 RNA純度 A260/ A280=1.89（肝組織）、A260/A280=1.81（脂肪組織），說明提取的總RNA的完整性良好。

2.2 西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼基因cDNA片段的擴增

圖1 組織總RNA瓊脂糖（1％）電泳圖Fig.1 Fig.1 Electrophoresismapping of tissuetotal RNA on 1％agarose gel.（A）L：liver tissue RNA；（B）F：adipose tissue RNA

采用套式PCR法擴增后，兩個片段分別取5μL PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在溴化乙錠染色后的凝膠上分別出現(xiàn)大小約為460 bp、660 bp左右的單一條帶，與預(yù)計結(jié)果相符。

2.3 西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼基因片段的T-A克隆與測序

將套式PCR產(chǎn)物切膠回收純化mOB、mAQ分別與pMD18-T Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落7℃振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng) PCR和BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后，將含正確插入片段的重組質(zhì)粒分別命名為TmOB、TmAQ，由海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定。測序結(jié)果與GenBank上公布的序列對比（GenBank登錄號： GQ240885.1、AF167719.1）顯示，TmAQ與GenBank上公布的序列一致，TmOB與GenBank上公布的序列對比第 246位點堿基發(fā)生突變，但氨基酸序列一致。

2.4 重組原核表達載體的鑒定

將重組好的原核表達載體pR-OB、pR-OBR-a用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ進行PCR和雙酶切鑒定。結(jié)果如圖2所示。圖2A在＞2 kb和460 kb處左右有明顯的條帶，圖2B在 ＞2 kb和660 kb處左右有明顯的條帶，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.5 重組質(zhì)粒 pR-OB、pR-OBR-a誘導(dǎo)表達與純化

圖2 重組原核表達載體PCR和雙酶切鑒定瓊脂糖（1.2％）電泳圖Fig.1 The electrophoresis results of PCRand enzyme digestion of recombined prokaryote expression vector by 1.2％agarose.

經(jīng)SDS-PAGE分析，大腸桿菌 BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達、純化，pR-OB在14.3～20.1×103之間約18×103處出現(xiàn)一條蛋白條帶（圖3B），占菌體總蛋白40％左右。pR-OBR-a在20.1～29.0× 103之間約27×103處出現(xiàn)一條蛋白條帶（圖3A），占菌體總蛋白值＜10％，分子量大小與預(yù)計的相符。而pRsetA空菌體均無相應(yīng)的表達帶。說明重組質(zhì)粒pR-OB、pR-OBR-a分別在大腸桿菌BL21（DE3）中可表達西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體片段蛋白。

圖3 重組質(zhì)粒pR-OBR-a和pR-OB誘導(dǎo)表達與純化12％SDS-PAGE電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of induced expression and purification of recombined pR-OBR-a and pR-OB by 12％SDS-PAGE.

3 討論

豬的物質(zhì)代謝形式與人非常接近。西藏小型豬為新型的實驗動物，作為一種稀有的動物資源，其體形小，屬于瘦肉型的豬種，其在體脂調(diào)節(jié)機制上可能與其它豬種存在差異［8］。本研究對西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體胞外區(qū)部分基因片段進行克隆和測序，為日后進行西藏小型豬與不同豬種間、不同物種間瘦素基因及瘦素受體基因的對比分析奠定工作基礎(chǔ)。

已有研究表明，動物免疫瘦素重組融合蛋白后，抗體阻斷瘦素與瘦素受體結(jié)合，Leptin的作用得不到發(fā)揮，采食量下降，脂肪生長沉積，引起動物肥胖及與肥胖相關(guān)醫(yī)學(xué)并發(fā)癥出現(xiàn)。利用受體蛋白片段免疫，產(chǎn)生的抗體可以結(jié)合到受體胞外區(qū)［9，10］，根據(jù)不同的片段、不同的動物，抗體可能阻斷瘦素或抑制瘦素功能的發(fā)揮。如果抗體阻斷瘦素的作用，那么可以在促進脂肪沉積的作用，導(dǎo)致動物肥胖綜合癥的發(fā)生。如果受體上某個區(qū)域肽片段產(chǎn)生的抗體能夠模擬瘦素抑制脂肪生長沉積的作用，這將更好地改善動物肉質(zhì)及控制肥胖，同時也可能通過影響營養(yǎng)水平而對生殖性能產(chǎn)生影響［11，12］。

國內(nèi)廣西大學(xué)蘭干球等對巴馬小型豬leptin克隆，利用pRSETA載體進行原核表達載體的構(gòu)建且酶切位點選擇EcoRⅠ和HindⅢ，在大腸桿菌BL21中表達［13］；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)胡曉湘等［14］對豬 leptin受體基因進行表達檢測與部分片段克隆分析，但豬瘦素受體重組融合蛋白的研究幾乎空白。本實驗對西藏小型豬 leptin的克隆和原核表達，與巴馬小型豬leptin原核表達相比，酶切位點選用的是BamHⅠ和HindⅢ，并在下游酶切位點增加終止密碼的一個堿基A。這使得所表達出來的重組融合蛋白大小更接近自然蛋白；對西藏小型豬瘦素受體胞外區(qū)片段的克隆和原核表達，制備重組融合蛋白，為研究瘦素及其受體的生理功能和應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

本實驗在基因片段克隆時，采用了套式PCR的方法以獲得目的片段。套式PCR的優(yōu)點在于其特異性較高，如果第一次擴增產(chǎn)生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，本實驗采用套式PCR法，提高PCR擴增獲得的目的基因片段的準(zhǔn)確性。另外，瘦素基因編碼區(qū)序列中GC值較高，本實驗使用了LA酶搭配GC Buffer進行 PCR擴增，以保證擴增的效率和準(zhǔn)確性。

重組質(zhì)粒pR-OB誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果顯示，所表達的蛋白量占菌體總蛋白的40％左右，表達量相對較高，純化的結(jié)果也比較理想。這為日后制備融合蛋白作為抗原免疫動物，提供足夠的高純度瘦素奠定了基礎(chǔ)。

重組質(zhì)粒 pR-OBR-a誘導(dǎo)表達與純化結(jié)果顯示，所表達的蛋白量少，不到菌體總蛋白的10％。表達菌的活性、誘導(dǎo)條件、目的蛋白毒性、蛋白的空間構(gòu)型等可影響重組質(zhì)粒表達效率。若日后需要大部分蛋白時，還需要優(yōu)化表達的系統(tǒng)。

瘦素及其受體可用于調(diào)控人和動物的脂肪沉積。在畜牧業(yè)上主要用于動物生產(chǎn)性能的調(diào)控；在醫(yī)學(xué)上主要用于肥胖綜合癥的研究。本文通過對西藏小型豬瘦素成熟肽及瘦素受體胞外域克隆和原核表達，為探討用主動免疫方法建立西藏小型豬人類肥胖癥、糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病等疾病動物模型，研究疾病發(fā)病機制、預(yù)防與控制肥胖提供方法和材料。

4 結(jié)論

本研究主要通過提取西藏小型豬肝組織、脂肪組織總RNA，進行RT-套式PCR擴增，獲得了瘦素成熟肽及瘦素受體基因編碼區(qū)的基因片段，并進行T-A克隆、測序分析。在核酸水平上為進一步研究瘦素及瘦素受體基因表達提供了條件；成功構(gòu)建原核表達載體pR-OB、pR-OBR-a，并成功誘導(dǎo)表達純化西藏小型豬瘦素受體pR-OB、pR-OBR-a蛋白。

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