林樹柱,劉先菊,楊 帆,張連峰
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)
近年來感染性疾病有了提高的趨勢(shì),而且傳播速度快、范圍廣。在人類的感染性疾病中有近2/3為人獸共患性疾病,而且這一比例是隨著時(shí)間提高的,在過去的十幾年中,動(dòng)物源性的感染性疾病已經(jīng)席卷了全球[1,2]。哺乳類動(dòng)物與人類關(guān)系密切,是很多人獸共患病病原的宿主、傳播媒介和傳染源。發(fā)展先進(jìn)的動(dòng)物病原檢測(cè)方法,不僅可以有效地保護(hù)動(dòng)物,而且可以防控新發(fā)傳染病。血清學(xué)檢測(cè)是動(dòng)物病原檢疫的重要手段,有著許多不可替代的優(yōu)勢(shì),而標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體是建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要工具,目前全世界都存在著標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體缺乏的問題。為此本研究分離純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,免疫大耳白兔制備了兔抗這些動(dòng)物的二級(jí)抗體,并用辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記,為這些哺乳動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的建立提供了重要的工具。
1.1 17種哺乳動(dòng)物血清IgG的分離純化
取恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂血,室溫靜置1 h,4℃過夜,4000 r/min離心20 min,得正常血清,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
恒河猴、東北虎、原駝、果子貍、食蟹猴、馬鹿、駱駝、熊猴和雪貂血清5 m L,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用HiTrap Protein A HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[3,4]。
布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、梅花鹿、長爪沙鼠、大倉鼠、豚鹿和大耳羊血清5 mL,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用 HiTrap Protein G HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[5,6]。
1.2 兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清的制備及二級(jí)抗體IgG的純化
利用親和純的17種哺乳動(dòng)物IgG免疫大耳白兔,制備兔抗這17種哺乳動(dòng)物一級(jí)抗體的抗血清,具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]??寡逍r(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)定[7]。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS(20 mmol/L,pH7.0)稀釋,0.45μm膜過濾,利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析[8],純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
1.3 兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測(cè)定
兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法,具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8,9]。
用直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記抗體的工作濃度,先利用親和純化的17種哺乳動(dòng)物的 IgG 10μg/m L,0.1 mL/孔包被 ELISA板,4℃過夜。次日洗滌、封閉,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶30000、1∶60000,分別加入反應(yīng)孔中,每個(gè)稀釋度二孔,每孔0.1 mL,37℃孵育1 h后洗滌3次,3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L,37℃反應(yīng)15 min。以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度[10]。
1.4 Westernblot方法檢測(cè)標(biāo)記抗體
純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光[10]。
2.1 純化17種哺乳動(dòng)物血清IgG
利用飽和硫酸銨鹽析方法,結(jié)合 Protein A或Protein G親和層析法純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求(圖1)。
圖1 親和層析純化哺乳動(dòng)物IgG的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified mammal IgG with Affinity chromatography
2.2 ProteinA純化兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體
用純化的恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG分別免疫大耳白兔4次后,利用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散的方法檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32以上,取血,制備抗血清,每只兔子得抗血清50 mL左右。
通過Protein A親和層析純化兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清中的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶,幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。
2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)
采用過碘酸鈉法對(duì)兔抗17種哺乳動(dòng)物 IgG進(jìn)行了HRP標(biāo)記,并用ELISA方法對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物的效價(jià)進(jìn)行了分析。以 10μg/m L的哺乳動(dòng)物 IgG包被ELISA板,0.1 m L/孔,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用 1% BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋,每個(gè)稀釋度二孔,37℃孵育1h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液 0.1 m L,37℃15 m in。以 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/ 630 nm雙波長讀取各孔 A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。
2.4 Westernblotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體
純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫 1 h,TBST洗膜 3次,10 m in/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光,結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)分別為:兔抗雪貂 IgG-HRP 1∶20000;兔抗恒河猴、虎 IgGHRP 1∶8000,兔抗布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、果子貍、食蟹猴、長爪沙鼠、豚鹿、熊猴 IgG-HRP 1∶4000;兔抗梅花鹿、駱駝、大倉鼠、大耳羊 IgG-HRP 1∶2000;兔抗原駝、馬鹿 IgG-HRP 1∶1000。Western blot結(jié)果見圖2。
表1 ELISA方法檢測(cè)HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA
圖2 Western blot檢測(cè)酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of HRP-IgG of rabbit anti-mammals with Western blot
哺乳動(dòng)物是與人類關(guān)系最為密切的物種之一,其作為寵物生活在人類家庭中,與人類日常生活關(guān)系密切,作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分,是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一,哺乳動(dòng)物還是人類食物的重要來源,有些哺乳動(dòng)物也是科學(xué)工作中重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于哺乳動(dòng)物與人類關(guān)系密切,親緣關(guān)系又比較近,所以哺乳動(dòng)物成為了許多人獸共患病的傳播媒介或傳染源[11],如狂犬病、弓形蟲病等就是由寵物狗、貓等傳染給人類的人獸共患性感染性疾病,流行性出血熱、鼠疫等就是由嚙齒類動(dòng)物傳播的嚴(yán)重的傳染病,布魯氏菌病等是由牛、羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳播的人獸共患疾病。動(dòng)物疫病的發(fā)生不僅威脅道人類的健康,也會(huì)給國民經(jīng)濟(jì)帶來重大損失。因此建立有效的哺乳動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù),控制哺乳動(dòng)物疫病的發(fā)生,對(duì)保障人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要的意義。
血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)既可以檢測(cè)正在感染的動(dòng)物,又可以檢測(cè)既往感染的動(dòng)物,而且取材簡單,在病原檢測(cè)中具有不可替代的作用,因此建立這些動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)體系對(duì)保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康具有重要的意義。標(biāo)記的二級(jí)抗體的缺乏是制約血清學(xué)檢測(cè)體系建立的重要因素,本研究制備了HRP標(biāo)記的兔抗恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的二級(jí)抗體,結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗狗、家貓、豚鼠、金倉鼠、松鼠、花鼠和龍貓等7種寵物的二級(jí)抗體[12],和HRP標(biāo)記的兔抗家豬,綿羊、山羊、牛、馬、驢、狐貍、貉和黑貂等9種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的二級(jí)抗體[13],及 HRP標(biāo)記的兔抗蝙蝠IgG,共計(jì)制備了34種哺乳動(dòng)物的標(biāo)記二級(jí)抗體。這34種哺乳動(dòng)物分別分布在6個(gè)目、10個(gè)科中,既包含寵物、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,也包含恒河猴、食蟹猴、雪貂等重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,還包括東北虎等珍稀動(dòng)物。這個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體庫的建立,部分的解決了中國乃至世界范圍內(nèi)的動(dòng)物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不完備的問題,為控制動(dòng)物疫病,保障國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展,保護(hù)珍稀動(dòng)物、保證人類健康和應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染病做了技術(shù)儲(chǔ)備和資源儲(chǔ)備。
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