• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    十七種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的制備和辣根過氧化物酶標(biāo)記

    2011-02-01 09:28:28林樹柱劉先菊張連峰
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2011年7期
    關(guān)鍵詞:倉鼠哺乳動(dòng)物醫(yī)學(xué)雜志

    林樹柱,劉先菊,楊 帆,張連峰

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    近年來感染性疾病有了提高的趨勢(shì),而且傳播速度快、范圍廣。在人類的感染性疾病中有近2/3為人獸共患性疾病,而且這一比例是隨著時(shí)間提高的,在過去的十幾年中,動(dòng)物源性的感染性疾病已經(jīng)席卷了全球[1,2]。哺乳類動(dòng)物與人類關(guān)系密切,是很多人獸共患病病原的宿主、傳播媒介和傳染源。發(fā)展先進(jìn)的動(dòng)物病原檢測(cè)方法,不僅可以有效地保護(hù)動(dòng)物,而且可以防控新發(fā)傳染病。血清學(xué)檢測(cè)是動(dòng)物病原檢疫的重要手段,有著許多不可替代的優(yōu)勢(shì),而標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體是建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要工具,目前全世界都存在著標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體缺乏的問題。為此本研究分離純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,免疫大耳白兔制備了兔抗這些動(dòng)物的二級(jí)抗體,并用辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記,為這些哺乳動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的建立提供了重要的工具。

    1 材料和方法

    1.1 17種哺乳動(dòng)物血清IgG的分離純化

    取恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂血,室溫靜置1 h,4℃過夜,4000 r/min離心20 min,得正常血清,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    恒河猴、東北虎、原駝、果子貍、食蟹猴、馬鹿、駱駝、熊猴和雪貂血清5 m L,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用HiTrap Protein A HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[3,4]。

    布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、梅花鹿、長爪沙鼠、大倉鼠、豚鹿和大耳羊血清5 mL,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用 HiTrap Protein G HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[5,6]。

    1.2 兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清的制備及二級(jí)抗體IgG的純化

    利用親和純的17種哺乳動(dòng)物IgG免疫大耳白兔,制備兔抗這17種哺乳動(dòng)物一級(jí)抗體的抗血清,具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]??寡逍r(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)定[7]。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS(20 mmol/L,pH7.0)稀釋,0.45μm膜過濾,利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析[8],純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3 兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測(cè)定

    兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法,具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8,9]。

    用直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記抗體的工作濃度,先利用親和純化的17種哺乳動(dòng)物的 IgG 10μg/m L,0.1 mL/孔包被 ELISA板,4℃過夜。次日洗滌、封閉,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶30000、1∶60000,分別加入反應(yīng)孔中,每個(gè)稀釋度二孔,每孔0.1 mL,37℃孵育1 h后洗滌3次,3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L,37℃反應(yīng)15 min。以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度[10]。

    1.4 Westernblot方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

    純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光[10]。

    2 結(jié)果

    2.1 純化17種哺乳動(dòng)物血清IgG

    利用飽和硫酸銨鹽析方法,結(jié)合 Protein A或Protein G親和層析法純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求(圖1)。

    圖1 親和層析純化哺乳動(dòng)物IgG的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified mammal IgG with Affinity chromatography

    2.2 ProteinA純化兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體

    用純化的恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG分別免疫大耳白兔4次后,利用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散的方法檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32以上,取血,制備抗血清,每只兔子得抗血清50 mL左右。

    通過Protein A親和層析純化兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清中的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶,幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。

    2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)

    采用過碘酸鈉法對(duì)兔抗17種哺乳動(dòng)物 IgG進(jìn)行了HRP標(biāo)記,并用ELISA方法對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物的效價(jià)進(jìn)行了分析。以 10μg/m L的哺乳動(dòng)物 IgG包被ELISA板,0.1 m L/孔,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用 1% BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋,每個(gè)稀釋度二孔,37℃孵育1h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液 0.1 m L,37℃15 m in。以 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/ 630 nm雙波長讀取各孔 A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。

    2.4 Westernblotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

    純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫 1 h,TBST洗膜 3次,10 m in/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光,結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)分別為:兔抗雪貂 IgG-HRP 1∶20000;兔抗恒河猴、虎 IgGHRP 1∶8000,兔抗布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、果子貍、食蟹猴、長爪沙鼠、豚鹿、熊猴 IgG-HRP 1∶4000;兔抗梅花鹿、駱駝、大倉鼠、大耳羊 IgG-HRP 1∶2000;兔抗原駝、馬鹿 IgG-HRP 1∶1000。Western blot結(jié)果見圖2。

    表1 ELISA方法檢測(cè)HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

    圖2 Western blot檢測(cè)酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of HRP-IgG of rabbit anti-mammals with Western blot

    3 討論

    哺乳動(dòng)物是與人類關(guān)系最為密切的物種之一,其作為寵物生活在人類家庭中,與人類日常生活關(guān)系密切,作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分,是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一,哺乳動(dòng)物還是人類食物的重要來源,有些哺乳動(dòng)物也是科學(xué)工作中重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于哺乳動(dòng)物與人類關(guān)系密切,親緣關(guān)系又比較近,所以哺乳動(dòng)物成為了許多人獸共患病的傳播媒介或傳染源[11],如狂犬病、弓形蟲病等就是由寵物狗、貓等傳染給人類的人獸共患性感染性疾病,流行性出血熱、鼠疫等就是由嚙齒類動(dòng)物傳播的嚴(yán)重的傳染病,布魯氏菌病等是由牛、羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳播的人獸共患疾病。動(dòng)物疫病的發(fā)生不僅威脅道人類的健康,也會(huì)給國民經(jīng)濟(jì)帶來重大損失。因此建立有效的哺乳動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù),控制哺乳動(dòng)物疫病的發(fā)生,對(duì)保障人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要的意義。

    血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)既可以檢測(cè)正在感染的動(dòng)物,又可以檢測(cè)既往感染的動(dòng)物,而且取材簡單,在病原檢測(cè)中具有不可替代的作用,因此建立這些動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)體系對(duì)保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康具有重要的意義。標(biāo)記的二級(jí)抗體的缺乏是制約血清學(xué)檢測(cè)體系建立的重要因素,本研究制備了HRP標(biāo)記的兔抗恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的二級(jí)抗體,結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗狗、家貓、豚鼠、金倉鼠、松鼠、花鼠和龍貓等7種寵物的二級(jí)抗體[12],和HRP標(biāo)記的兔抗家豬,綿羊、山羊、牛、馬、驢、狐貍、貉和黑貂等9種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的二級(jí)抗體[13],及 HRP標(biāo)記的兔抗蝙蝠IgG,共計(jì)制備了34種哺乳動(dòng)物的標(biāo)記二級(jí)抗體。這34種哺乳動(dòng)物分別分布在6個(gè)目、10個(gè)科中,既包含寵物、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,也包含恒河猴、食蟹猴、雪貂等重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,還包括東北虎等珍稀動(dòng)物。這個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體庫的建立,部分的解決了中國乃至世界范圍內(nèi)的動(dòng)物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不完備的問題,為控制動(dòng)物疫病,保障國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展,保護(hù)珍稀動(dòng)物、保證人類健康和應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染病做了技術(shù)儲(chǔ)備和資源儲(chǔ)備。

    [1]Kate EJ,Nikkita GP,Marc AL,et al.Global trends in emerging infectious diseases[J].Nature,2008,451:990-994.

    [2]S.Cleaveland,M.K.Laurenson,L.H.Taylor.Diseases of humans and their domestic mammals:pathogen characteristics,host range and the risk of emergence[J].Phil.Trans.R.Soc.Lond.B,2001,356:991-999.

    [3]劉先菊,楊帆,林樹柱,等.虎血清免疫球蛋白(IgG)的純化及純度、活性鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11): 637-640.

    [4]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.兩種果子貍血清IgG純化方法的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):681-S2.

    [5]劉先菊,楊帆,林樹柱,等.長爪沙鼠IgG的純化及抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):641-643.

    [6]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.黑線毛足鼠和金倉鼠血清 IgG的純化及抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17 (11):656-658.

    [7]林樹柱,李萬波,劉先菊,等.烏鱧血清免疫球蛋白IgM的分離純化及其兔抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):648-651.

    [8]林樹柱,李萬波,劉先菊,等.兔抗五種魚免疫球蛋白抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(5):45-49.

    [9]金伯泉,李恩善.醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第1版)[M].北京:世界圖書出版社,1990.

    [10]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.蝙蝠血清 IgG的純化及兔抗蝙蝠IgG酶標(biāo)抗體的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(5): 37-40.

    [11]林樹柱,張連峰.寵物對(duì)人類健康的潛在威脅[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(4):80-86.

    [12]林樹柱,劉先菊,楊帆,等.七種常見寵物二級(jí)抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(6):51-54.

    [13]林樹柱,劉先菊,楊帆,等.九種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物二級(jí)抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(6):55 -58.

    猜你喜歡
    倉鼠哺乳動(dòng)物醫(yī)學(xué)雜志
    為什么鴨嘴獸被歸為哺乳動(dòng)物?
    《海軍醫(yī)學(xué)雜志》第二屆編委會(huì)名單
    當(dāng)倉鼠遇上小新
    童話世界(2020年32期)2020-12-25 02:59:12
    萌翻你的倉鼠君來了!
    《中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志》簡介
    倉鼠小黑
    2 從最早的哺乳動(dòng)物到人類
    哺乳動(dòng)物大時(shí)代
    哺乳動(dòng)物家族會(huì)
    《轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志》稿約
    国产伦一二天堂av在线观看| cao死你这个sao货| 一进一出抽搐动态| 一级毛片高清免费大全| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲av成人av| 久久久国产成人免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲av成人一区二区三| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 真人一进一出gif抽搐免费| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美日韩国产亚洲二区| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲性夜色夜夜综合| 欧美色视频一区免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 搞女人的毛片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 视频区欧美日本亚洲| 国产av又大| 一本精品99久久精品77| 亚洲中文字幕日韩| 88av欧美| 麻豆成人午夜福利视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产黄片美女视频| 久久99热这里只有精品18| 岛国在线免费视频观看| 国产日本99.免费观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美中文综合在线视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品,欧美在线| 男女视频在线观看网站免费 | 精品高清国产在线一区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 脱女人内裤的视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久精品国产综合久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产91精品成人一区二区三区| av超薄肉色丝袜交足视频| 最新在线观看一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲在线自拍视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 精华霜和精华液先用哪个| 久久中文看片网| 嫩草影院精品99| 1024视频免费在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 成人亚洲精品av一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 手机成人av网站| 亚洲熟女毛片儿| 少妇被粗大的猛进出69影院| tocl精华| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲av熟女| 特大巨黑吊av在线直播| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品一及| 在线观看午夜福利视频| 免费观看精品视频网站| 18禁观看日本| 我要搜黄色片| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久天堂一区二区三区四区| tocl精华| 麻豆一二三区av精品| 91字幕亚洲| 国产亚洲欧美在线一区二区| 老司机午夜福利在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 黄色女人牲交| 亚洲人成电影免费在线| 91在线观看av| 久久久国产欧美日韩av| 69av精品久久久久久| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩精品中文字幕看吧| 免费av毛片视频| 99riav亚洲国产免费| 观看免费一级毛片| ponron亚洲| 亚洲无线在线观看| 91麻豆av在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 国产精品 国内视频| 精品欧美国产一区二区三| 成人欧美大片| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 人成视频在线观看免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩欧美精品v在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 少妇的丰满在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产av一区在线观看免费| 亚洲成人免费电影在线观看| a级毛片a级免费在线| 桃色一区二区三区在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲人成77777在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看66精品国产| 国产精品,欧美在线| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 免费观看精品视频网站| 不卡一级毛片| 香蕉av资源在线| 欧美黑人巨大hd| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 18禁观看日本| 欧美黄色片欧美黄色片| 免费搜索国产男女视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久99久视频精品免费| 看免费av毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄色女人牲交| 免费搜索国产男女视频| xxxwww97欧美| 久久热在线av| 国产乱人伦免费视频| 精品久久久久久,| videosex国产| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲在线自拍视频| 精品不卡国产一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人精品久久二区二区91| 国产高清有码在线观看视频 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲一区中文字幕在线| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久天堂一区二区三区四区| 国产黄a三级三级三级人| a级毛片在线看网站| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线视频色国产色| 国产亚洲精品久久久久5区| 久久草成人影院| 久久久久久久久中文| 欧美又色又爽又黄视频| 国产精品精品国产色婷婷| av片东京热男人的天堂| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久精品人妻少妇| 哪里可以看免费的av片| 国产成人影院久久av| 亚洲免费av在线视频| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 桃红色精品国产亚洲av| 婷婷丁香在线五月| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久久九九精品二区国产 | 久久国产精品人妻蜜桃| av免费在线观看网站| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品免费久久久久久久清纯| aaaaa片日本免费| 在线观看舔阴道视频| 国产真人三级小视频在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 精品欧美国产一区二区三| 特级一级黄色大片| 色综合站精品国产| 亚洲av成人精品一区久久| av天堂在线播放| 国模一区二区三区四区视频 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 嫁个100分男人电影在线观看| 人人妻人人看人人澡| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日韩有码中文字幕| 日本成人三级电影网站| 91av网站免费观看| 一级毛片高清免费大全| 国产精品久久久久久精品电影| 久久这里只有精品19| 亚洲av五月六月丁香网| 叶爱在线成人免费视频播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久国产欧美日韩av| 女警被强在线播放| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 成人午夜高清在线视频| 中文字幕高清在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 女人被狂操c到高潮| 亚洲中文字幕日韩| 久久亚洲真实| 国产亚洲精品av在线| 他把我摸到了高潮在线观看| 精品日产1卡2卡| 黄色 视频免费看| 欧美在线一区亚洲| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产三级黄色录像| 九色国产91popny在线| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一进一出抽搐动态| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美+亚洲+日韩+国产| www.www免费av| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲无线在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费电影在线观看免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 免费在线观看黄色视频的| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久国产精品麻豆| 在线播放国产精品三级| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人国语在线视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产真实乱freesex| 亚洲专区国产一区二区| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲午夜理论影院| av有码第一页| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品一及| 亚洲国产精品久久男人天堂| 午夜福利欧美成人| e午夜精品久久久久久久| 国产99白浆流出| 大型av网站在线播放| 看片在线看免费视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲国产看品久久| 国产97色在线日韩免费| 男人舔奶头视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 色老头精品视频在线观看| 久久久久久大精品| 一级毛片精品| www.999成人在线观看| 色av中文字幕| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美zozozo另类| 在线国产一区二区在线| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲av成人精品一区久久| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲自拍偷在线| 国产真实乱freesex| 在线观看免费视频日本深夜| 老鸭窝网址在线观看| 无限看片的www在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产人伦9x9x在线观看| 两个人免费观看高清视频| xxxwww97欧美| 国产精品久久久久久久电影 | 国产成年人精品一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 又紧又爽又黄一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久久精品大字幕| 美女黄网站色视频| 最新美女视频免费是黄的| avwww免费| 精品久久蜜臀av无| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲美女视频黄频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 嫩草影视91久久| 欧美色视频一区免费| 亚洲中文字幕日韩| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久性视频一级片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产成人精品无人区| 国产午夜精品论理片| 久久精品综合一区二区三区| 国产1区2区3区精品| 五月玫瑰六月丁香| 脱女人内裤的视频| 国产精品九九99| 国产在线精品亚洲第一网站| 日韩欧美三级三区| 91老司机精品| 波多野结衣高清作品| 精品第一国产精品| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 波多野结衣巨乳人妻| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲国产精品成人综合色| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品一区二区三区四区五区乱码| 桃色一区二区三区在线观看| 中文资源天堂在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产成人影院久久av| 色综合婷婷激情| 婷婷六月久久综合丁香| 久久久国产成人免费| 日韩国内少妇激情av| 免费电影在线观看免费观看| 99热6这里只有精品| 午夜激情av网站| 色综合站精品国产| 亚洲avbb在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 黄色a级毛片大全视频| 色在线成人网| 亚洲五月婷婷丁香| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本精品一区二区三区蜜桃| 91麻豆av在线| 国产三级中文精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲九九香蕉| 亚洲欧美日韩东京热| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产亚洲精品一区二区www| 嫩草影院精品99| netflix在线观看网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 香蕉久久夜色| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 又紧又爽又黄一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品久久久久久久电影 | 一级片免费观看大全| 亚洲国产精品合色在线| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品免费视频内射| 在线观看午夜福利视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| av福利片在线| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美黄色淫秽网站| 午夜a级毛片| 国产精品永久免费网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 免费观看精品视频网站| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人精品久久二区二区免费| 免费观看人在逋| 亚洲最大成人中文| 亚洲精华国产精华精| 国产视频一区二区在线看| 午夜免费激情av| 中文亚洲av片在线观看爽| 两性夫妻黄色片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 黄色片一级片一级黄色片| av天堂在线播放| 欧美黄色淫秽网站| av在线播放免费不卡| 成人18禁在线播放| 深夜精品福利| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩欧美免费精品| 又黄又爽又免费观看的视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 老司机靠b影院| 午夜老司机福利片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 在线播放国产精品三级| 国产高清视频在线观看网站| 人人妻人人看人人澡| 精品国产乱码久久久久久男人| 特级一级黄色大片| 一级片免费观看大全| 日韩中文字幕欧美一区二区| 操出白浆在线播放| 久久人人精品亚洲av| 成年女人毛片免费观看观看9| av国产免费在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 黄片小视频在线播放| 免费观看精品视频网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 日本成人三级电影网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久99热这里只有精品18| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久久久久久午夜电影| 亚洲国产欧美网| 一夜夜www| 欧美日韩精品网址| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久精品人妻少妇| 成人三级做爰电影| 免费电影在线观看免费观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美乱妇无乱码| 999久久久国产精品视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲国产看品久久| 国产在线精品亚洲第一网站| a级毛片a级免费在线| www日本在线高清视频| 欧美黑人巨大hd| 在线观看www视频免费| 亚洲人成电影免费在线| 久久人人精品亚洲av| 国产成人啪精品午夜网站| 美女黄网站色视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产一区二区三区视频了| 午夜老司机福利片| 一区福利在线观看| 久久久精品大字幕| 久久中文字幕人妻熟女| 在线观看66精品国产| 午夜精品久久久久久毛片777| av中文乱码字幕在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产高清视频在线观看网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久久久久久久黄片| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲国产精品成人综合色| 在线观看www视频免费| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99re在线观看精品视频| 日本一本二区三区精品| 天天添夜夜摸| 成人国产综合亚洲| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲乱码一区二区免费版| 在线播放国产精品三级| 视频区欧美日本亚洲| 激情在线观看视频在线高清| 麻豆成人午夜福利视频| 一级a爱片免费观看的视频| 久久人妻av系列| 91成年电影在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲无线在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 麻豆国产av国片精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 九色国产91popny在线| 午夜福利免费观看在线| 精品福利观看| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲 欧美一区二区三区| 日本免费a在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 很黄的视频免费| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 国产精品,欧美在线| 日韩欧美在线乱码| 日本 欧美在线| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 手机成人av网站| 99精品久久久久人妻精品| 国产在线观看jvid| 黄色a级毛片大全视频| 日本免费a在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 成人欧美大片| 亚洲电影在线观看av| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产亚洲精品久久久久5区| 一级毛片女人18水好多| 亚洲av成人av| 一级毛片精品| 国产精品爽爽va在线观看网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久久国产a免费观看| 脱女人内裤的视频| 国产精品九九99| 色综合婷婷激情| 91av网站免费观看| 国内精品一区二区在线观看| 国产成人精品无人区| 亚洲av五月六月丁香网| 午夜福利在线观看吧| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲成av人片免费观看| 少妇粗大呻吟视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| av中文乱码字幕在线| www国产在线视频色| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 看片在线看免费视频| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 高清在线国产一区| 国产精品av久久久久免费| 小说图片视频综合网站| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲最大成人中文| av福利片在线| 99久久精品热视频| 欧美高清成人免费视频www| 在线观看午夜福利视频| 午夜福利18| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲专区中文字幕在线| 伦理电影免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久国产a免费观看| 久热爱精品视频在线9| 成年免费大片在线观看| 十八禁网站免费在线| 成人国产综合亚洲| 三级毛片av免费| 丰满人妻一区二区三区视频av | 青草久久国产| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线观看午夜福利视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲精品av麻豆狂野| 免费搜索国产男女视频| 国产av在哪里看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美zozozo另类| 波多野结衣高清无吗| 99热这里只有是精品50| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 老熟妇仑乱视频hdxx| svipshipincom国产片| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲成人久久性| 色尼玛亚洲综合影院| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 一本久久中文字幕| 精华霜和精华液先用哪个| 中文字幕高清在线视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日韩欧美在线乱码| 久久午夜亚洲精品久久| 草草在线视频免费看| 国产亚洲精品一区二区www| 99在线视频只有这里精品首页| 黄色女人牲交| 亚洲专区字幕在线| 麻豆av在线久日| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品日产1卡2卡|