• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    十七種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的制備和辣根過氧化物酶標(biāo)記

    2011-02-01 09:28:28林樹柱劉先菊張連峰
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2011年7期
    關(guān)鍵詞:倉鼠哺乳動(dòng)物醫(yī)學(xué)雜志

    林樹柱,劉先菊,楊 帆,張連峰

    (中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,北京 100021)

    近年來感染性疾病有了提高的趨勢(shì),而且傳播速度快、范圍廣。在人類的感染性疾病中有近2/3為人獸共患性疾病,而且這一比例是隨著時(shí)間提高的,在過去的十幾年中,動(dòng)物源性的感染性疾病已經(jīng)席卷了全球[1,2]。哺乳類動(dòng)物與人類關(guān)系密切,是很多人獸共患病病原的宿主、傳播媒介和傳染源。發(fā)展先進(jìn)的動(dòng)物病原檢測(cè)方法,不僅可以有效地保護(hù)動(dòng)物,而且可以防控新發(fā)傳染病。血清學(xué)檢測(cè)是動(dòng)物病原檢疫的重要手段,有著許多不可替代的優(yōu)勢(shì),而標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體是建立血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的重要工具,目前全世界都存在著標(biāo)記的動(dòng)物二級(jí)抗體缺乏的問題。為此本研究分離純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,免疫大耳白兔制備了兔抗這些動(dòng)物的二級(jí)抗體,并用辣根過氧化物酶(HRP)對(duì)制備的二級(jí)抗體進(jìn)行了標(biāo)記,為這些哺乳動(dòng)物血清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的建立提供了重要的工具。

    1 材料和方法

    1.1 17種哺乳動(dòng)物血清IgG的分離純化

    取恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂血,室溫靜置1 h,4℃過夜,4000 r/min離心20 min,得正常血清,分裝,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    恒河猴、東北虎、原駝、果子貍、食蟹猴、馬鹿、駱駝、熊猴和雪貂血清5 m L,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用HiTrap Protein A HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[3,4]。

    布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、梅花鹿、長爪沙鼠、大倉鼠、豚鹿和大耳羊血清5 mL,用生理鹽水等體積稀釋后,再以50%飽和硫酸銨和33%飽和硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀,獲得初步純化血清 IgG。初步純化的樣品再利用 HiTrap Protein G HP 5 m L預(yù)裝柱(GE公司)進(jìn)行親和純化[5,6]。

    1.2 兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清的制備及二級(jí)抗體IgG的純化

    利用親和純的17種哺乳動(dòng)物IgG免疫大耳白兔,制備兔抗這17種哺乳動(dòng)物一級(jí)抗體的抗血清,具體方法參照文獻(xiàn)進(jìn)行[5]??寡逍r(jià)用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散方法進(jìn)行測(cè)定[7]。2.5 m L兔抗血清用10 m L PBS(20 mmol/L,pH7.0)稀釋,0.45μm膜過濾,利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析[8],純度都經(jīng)SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3 兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的 HRP標(biāo)記和標(biāo)記抗體ELISA工作濃度測(cè)定

    兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體的HRP標(biāo)記采用過碘酸鈉法,具體操作參照文獻(xiàn)進(jìn)行[8,9]。

    用直接ELISA法測(cè)定標(biāo)記抗體的工作濃度,先利用親和純化的17種哺乳動(dòng)物的 IgG 10μg/m L,0.1 mL/孔包被 ELISA板,4℃過夜。次日洗滌、封閉,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶30000、1∶60000,分別加入反應(yīng)孔中,每個(gè)稀釋度二孔,每孔0.1 mL,37℃孵育1 h后洗滌3次,3 min/次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1 m L,37℃反應(yīng)15 min。以2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。用ELISA比色儀雙波長450 nm/630 nm讀取各孔A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度[10]。

    1.4 Westernblot方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

    純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)的適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光[10]。

    2 結(jié)果

    2.1 純化17種哺乳動(dòng)物血清IgG

    利用飽和硫酸銨鹽析方法,結(jié)合 Protein A或Protein G親和層析法純化了恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)其純度達(dá)到了免疫的要求(圖1)。

    圖1 親和層析純化哺乳動(dòng)物IgG的SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purified mammal IgG with Affinity chromatography

    2.2 ProteinA純化兔抗17種哺乳動(dòng)物二級(jí)抗體

    用純化的恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的IgG分別免疫大耳白兔4次后,利用瓊脂糖凝膠免疫雙擴(kuò)散的方法檢測(cè)抗血清效價(jià)達(dá)到1∶32以上,取血,制備抗血清,每只兔子得抗血清50 mL左右。

    通過Protein A親和層析純化兔抗17種哺乳動(dòng)物抗血清中的IgG,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在還原條件下呈現(xiàn)清晰的重鏈和輕鏈兩條帶,幾乎沒有其他雜帶。電泳圖未給出。

    2.3 ELISA方法鑒定HRP標(biāo)記抗體的效價(jià)

    采用過碘酸鈉法對(duì)兔抗17種哺乳動(dòng)物 IgG進(jìn)行了HRP標(biāo)記,并用ELISA方法對(duì)標(biāo)記產(chǎn)物的效價(jià)進(jìn)行了分析。以 10μg/m L的哺乳動(dòng)物 IgG包被ELISA板,0.1 m L/孔,相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體用 1% BSA-PBST進(jìn)行系列稀釋,每個(gè)稀釋度二孔,37℃孵育1h后洗滌3次。于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液 0.1 m L,37℃15 m in。以 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。在ELISA比色儀上采用450 nm/ 630 nm雙波長讀取各孔 A值。取A值為1.0左右的酶標(biāo)抗體稀釋度作為標(biāo)記抗體的ELISA工作濃度。結(jié)果如表1所示。

    2.4 Westernblotting方法檢測(cè)標(biāo)記抗體

    純化的17種哺乳動(dòng)物IgG利用12%的SDS-聚丙烯酰銨凝膠電泳分離,濕法轉(zhuǎn)移至NC膜上,封閉后分別與相應(yīng)適當(dāng)稀釋的標(biāo)記二級(jí)抗體進(jìn)行孵育,室溫 1 h,TBST洗膜 3次,10 m in/次,TBS洗膜10 min,與底物反應(yīng)后曝光,結(jié)果顯示標(biāo)記抗體具有很好的特異性。標(biāo)記二級(jí)抗體的稀釋倍數(shù)分別為:兔抗雪貂 IgG-HRP 1∶20000;兔抗恒河猴、虎 IgGHRP 1∶8000,兔抗布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、果子貍、食蟹猴、長爪沙鼠、豚鹿、熊猴 IgG-HRP 1∶4000;兔抗梅花鹿、駱駝、大倉鼠、大耳羊 IgG-HRP 1∶2000;兔抗原駝、馬鹿 IgG-HRP 1∶1000。Western blot結(jié)果見圖2。

    表1 ELISA方法檢測(cè)HRP標(biāo)記的抗體效價(jià)Tab.1 Determination of the titers of the IgG-HRP by ELISA

    圖2 Western blot檢測(cè)酶標(biāo)抗體的特異性Fig.2 Determination of the specificity of HRP-IgG of rabbit anti-mammals with Western blot

    3 討論

    哺乳動(dòng)物是與人類關(guān)系最為密切的物種之一,其作為寵物生活在人類家庭中,與人類日常生活關(guān)系密切,作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物又是人類經(jīng)濟(jì)生活的重要組成部分,是農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一,哺乳動(dòng)物還是人類食物的重要來源,有些哺乳動(dòng)物也是科學(xué)工作中重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。由于哺乳動(dòng)物與人類關(guān)系密切,親緣關(guān)系又比較近,所以哺乳動(dòng)物成為了許多人獸共患病的傳播媒介或傳染源[11],如狂犬病、弓形蟲病等就是由寵物狗、貓等傳染給人類的人獸共患性感染性疾病,流行性出血熱、鼠疫等就是由嚙齒類動(dòng)物傳播的嚴(yán)重的傳染病,布魯氏菌病等是由牛、羊等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物傳播的人獸共患疾病。動(dòng)物疫病的發(fā)生不僅威脅道人類的健康,也會(huì)給國民經(jīng)濟(jì)帶來重大損失。因此建立有效的哺乳動(dòng)物病原檢測(cè)技術(shù),控制哺乳動(dòng)物疫病的發(fā)生,對(duì)保障人類的健康和社會(huì)的發(fā)展具有重要的意義。

    血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)既可以檢測(cè)正在感染的動(dòng)物,又可以檢測(cè)既往感染的動(dòng)物,而且取材簡單,在病原檢測(cè)中具有不可替代的作用,因此建立這些動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)體系對(duì)保障社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人類健康具有重要的意義。標(biāo)記的二級(jí)抗體的缺乏是制約血清學(xué)檢測(cè)體系建立的重要因素,本研究制備了HRP標(biāo)記的兔抗恒河猴、東北虎、布氏田鼠、黑線姬鼠、斑羚、原駝、果子貍、食蟹猴、梅花鹿、長爪沙鼠、馬鹿、駱駝、大倉鼠、豚鹿、熊猴、大耳羊和雪貂等17種哺乳動(dòng)物的二級(jí)抗體,結(jié)合之前制備的HRP標(biāo)記的兔抗狗、家貓、豚鼠、金倉鼠、松鼠、花鼠和龍貓等7種寵物的二級(jí)抗體[12],和HRP標(biāo)記的兔抗家豬,綿羊、山羊、牛、馬、驢、狐貍、貉和黑貂等9種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的二級(jí)抗體[13],及 HRP標(biāo)記的兔抗蝙蝠IgG,共計(jì)制備了34種哺乳動(dòng)物的標(biāo)記二級(jí)抗體。這34種哺乳動(dòng)物分別分布在6個(gè)目、10個(gè)科中,既包含寵物、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物,也包含恒河猴、食蟹猴、雪貂等重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,還包括東北虎等珍稀動(dòng)物。這個(gè)標(biāo)記的二級(jí)抗體庫的建立,部分的解決了中國乃至世界范圍內(nèi)的動(dòng)物病原和新發(fā)傳染病病原學(xué)清學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)不完備的問題,為控制動(dòng)物疫病,保障國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展,保護(hù)珍稀動(dòng)物、保證人類健康和應(yīng)對(duì)新發(fā)傳染病做了技術(shù)儲(chǔ)備和資源儲(chǔ)備。

    [1]Kate EJ,Nikkita GP,Marc AL,et al.Global trends in emerging infectious diseases[J].Nature,2008,451:990-994.

    [2]S.Cleaveland,M.K.Laurenson,L.H.Taylor.Diseases of humans and their domestic mammals:pathogen characteristics,host range and the risk of emergence[J].Phil.Trans.R.Soc.Lond.B,2001,356:991-999.

    [3]劉先菊,楊帆,林樹柱,等.虎血清免疫球蛋白(IgG)的純化及純度、活性鑒定[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11): 637-640.

    [4]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.兩種果子貍血清IgG純化方法的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):681-S2.

    [5]劉先菊,楊帆,林樹柱,等.長爪沙鼠IgG的純化及抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):641-643.

    [6]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.黑線毛足鼠和金倉鼠血清 IgG的純化及抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17 (11):656-658.

    [7]林樹柱,李萬波,劉先菊,等.烏鱧血清免疫球蛋白IgM的分離純化及其兔抗血清的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2007,17(11):648-651.

    [8]林樹柱,李萬波,劉先菊,等.兔抗五種魚免疫球蛋白抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(5):45-49.

    [9]金伯泉,李恩善.醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(第1版)[M].北京:世界圖書出版社,1990.

    [10]劉先菊,林樹柱,楊帆,等.蝙蝠血清 IgG的純化及兔抗蝙蝠IgG酶標(biāo)抗體的制備[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(5): 37-40.

    [11]林樹柱,張連峰.寵物對(duì)人類健康的潛在威脅[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(4):80-86.

    [12]林樹柱,劉先菊,楊帆,等.七種常見寵物二級(jí)抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(6):51-54.

    [13]林樹柱,劉先菊,楊帆,等.九種重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物二級(jí)抗體的制備和HRP標(biāo)記[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志,2009,19(6):55 -58.

    猜你喜歡
    倉鼠哺乳動(dòng)物醫(yī)學(xué)雜志
    為什么鴨嘴獸被歸為哺乳動(dòng)物?
    《海軍醫(yī)學(xué)雜志》第二屆編委會(huì)名單
    當(dāng)倉鼠遇上小新
    童話世界(2020年32期)2020-12-25 02:59:12
    萌翻你的倉鼠君來了!
    《中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志》簡介
    倉鼠小黑
    2 從最早的哺乳動(dòng)物到人類
    哺乳動(dòng)物大時(shí)代
    哺乳動(dòng)物家族會(huì)
    《轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志》稿約
    午夜老司机福利片| 日韩欧美三级三区| 久久精品人妻少妇| 搞女人的毛片| 制服人妻中文乱码| 在线观看免费午夜福利视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 久久狼人影院| 亚洲成人免费电影在线观看| netflix在线观看网站| 精品午夜福利视频在线观看一区| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久久国产a免费观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜a级毛片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 高清在线国产一区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 午夜激情av网站| 国产激情欧美一区二区| 午夜成年电影在线免费观看| e午夜精品久久久久久久| 久久九九热精品免费| 淫秽高清视频在线观看| 一区福利在线观看| ponron亚洲| 久热爱精品视频在线9| 91老司机精品| 久久香蕉激情| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人18禁在线播放| 日本 欧美在线| 亚洲无线在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 自线自在国产av| 国产黄片美女视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 成人午夜高清在线视频 | 国产激情久久老熟女| 精品熟女少妇八av免费久了| 91成年电影在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 999久久久精品免费观看国产| 成人永久免费在线观看视频| 99精品在免费线老司机午夜| 欧美丝袜亚洲另类 | 一个人免费在线观看的高清视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲精品国产区一区二| av电影中文网址| 精品卡一卡二卡四卡免费| 啦啦啦观看免费观看视频高清| www.精华液| 两人在一起打扑克的视频| 欧美色视频一区免费| 制服丝袜大香蕉在线| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 丝袜在线中文字幕| 国产精品永久免费网站| 久久久国产成人免费| 精品久久久久久久毛片微露脸| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品二区激情视频| 美女大奶头视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲第一电影网av| 久久精品91无色码中文字幕| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 1024手机看黄色片| 丝袜人妻中文字幕| 禁无遮挡网站| 日韩高清综合在线| 日本 欧美在线| а√天堂www在线а√下载| 啪啪无遮挡十八禁网站| 麻豆av在线久日| 日韩欧美免费精品| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产精品香港三级国产av潘金莲| 91成人精品电影| 国产三级在线视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲av成人一区二区三| 在线国产一区二区在线| 脱女人内裤的视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产av不卡久久| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久久国产a免费观看| 99国产综合亚洲精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 十八禁网站免费在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲人成77777在线视频| 黄色视频不卡| 国产精品av久久久久免费| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产精品 国内视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一本久久中文字幕| 俺也久久电影网| 亚洲人成电影免费在线| 久久香蕉激情| 日本一区二区免费在线视频| 国产v大片淫在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 正在播放国产对白刺激| svipshipincom国产片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 少妇的丰满在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| www国产在线视频色| 精品午夜福利视频在线观看一区| 成人国语在线视频| av片东京热男人的天堂| √禁漫天堂资源中文www| 久久草成人影院| 最近最新中文字幕大全电影3 | 人人妻人人澡欧美一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 午夜福利视频1000在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 成人国产综合亚洲| 久热爱精品视频在线9| 国产亚洲av高清不卡| 女同久久另类99精品国产91| 在线观看免费视频日本深夜| 精品福利观看| 手机成人av网站| 欧美性长视频在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 色老头精品视频在线观看| 国产亚洲av高清不卡| 丝袜在线中文字幕| 丁香欧美五月| 精华霜和精华液先用哪个| 婷婷六月久久综合丁香| 精品国产美女av久久久久小说| 欧美激情 高清一区二区三区| 天堂√8在线中文| 久久久久久久午夜电影| 国产成年人精品一区二区| 成年免费大片在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品一区二区三区四区五区乱码| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲男人的天堂狠狠| 久久人妻av系列| 窝窝影院91人妻| 国产精品国产高清国产av| 亚洲专区字幕在线| 国产伦在线观看视频一区| 搡老熟女国产l中国老女人| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲色图av天堂| 精品福利观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久精品人妻少妇| www.自偷自拍.com| 神马国产精品三级电影在线观看 | 久热这里只有精品99| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99热只有精品国产| 长腿黑丝高跟| 听说在线观看完整版免费高清| 免费人成视频x8x8入口观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成人欧美在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 中文在线观看免费www的网站 | 精品日产1卡2卡| 国产高清videossex| 精品久久久久久久久久久久久 | 国产乱人伦免费视频| 国产亚洲av高清不卡| 久久久国产欧美日韩av| 在线免费观看的www视频| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品精品国产色婷婷| a级毛片在线看网站| 人妻久久中文字幕网| 无限看片的www在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 夜夜爽天天搞| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 又紧又爽又黄一区二区| 波多野结衣高清无吗| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产成人精品久久二区二区91| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品久久久av美女十八| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 长腿黑丝高跟| 日韩欧美免费精品| 成年人黄色毛片网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 91大片在线观看| 成人国产综合亚洲| 欧美三级亚洲精品| 在线观看一区二区三区| 99在线人妻在线中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| 久久久久国内视频| 很黄的视频免费| 日本在线视频免费播放| 男女那种视频在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 成人av一区二区三区在线看| 美女大奶头视频| 黄片小视频在线播放| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 99久久国产精品久久久| 欧美中文日本在线观看视频| 国内精品久久久久精免费| 中文字幕高清在线视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 在线免费观看的www视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 麻豆av在线久日| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色a级毛片大全视频| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 黄色 视频免费看| 一进一出好大好爽视频| 日本a在线网址| a在线观看视频网站| 麻豆成人午夜福利视频| 免费看日本二区| 成人欧美大片| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 露出奶头的视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人三级做爰电影| 一本综合久久免费| 黄色成人免费大全| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 嫁个100分男人电影在线观看| 热99re8久久精品国产| 亚洲色图av天堂| 日本熟妇午夜| 午夜福利18| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产伦人伦偷精品视频| 成人手机av| 亚洲第一电影网av| 欧美乱色亚洲激情| 国产成人欧美| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成人手机av| 男女那种视频在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www.自偷自拍.com| www.999成人在线观看| 免费搜索国产男女视频| 精品欧美一区二区三区在线| 国产亚洲精品av在线| 精品电影一区二区在线| 黄色视频不卡| 久久亚洲真实| 午夜久久久久精精品| 不卡av一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美午夜高清在线| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 老司机午夜十八禁免费视频| www.精华液| 国产精品亚洲美女久久久| 999精品在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜免费激情av| 两人在一起打扑克的视频| 免费在线观看日本一区| 久热爱精品视频在线9| 搡老岳熟女国产| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久精品成人免费网站| 午夜激情福利司机影院| 亚洲在线自拍视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久 | 十分钟在线观看高清视频www| 中文字幕久久专区| 午夜视频精品福利| 丰满的人妻完整版| 日韩欧美免费精品| 日本一区二区免费在线视频| 人人澡人人妻人| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成77777在线视频| 又大又爽又粗| 正在播放国产对白刺激| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 嫩草影视91久久| 99在线人妻在线中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久草成人影院| 欧美乱码精品一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 午夜老司机福利片| 中文字幕久久专区| 国产乱人伦免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲av美国av| 欧美乱妇无乱码| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜福利一区二区在线看| 国产黄色小视频在线观看| 一进一出抽搐动态| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品国产高清国产av| 一a级毛片在线观看| 午夜福利免费观看在线| 精品欧美国产一区二区三| 日韩欧美国产在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美黑人精品巨大| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 中文在线观看免费www的网站 | 欧美乱色亚洲激情| 91成人精品电影| 黄色视频,在线免费观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线国产一区二区在线| 亚洲精品一区av在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久热在线av| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久99热这里只有精品18| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美成人午夜精品| 久久天堂一区二区三区四区| 丝袜人妻中文字幕| 观看免费一级毛片| 亚洲三区欧美一区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品av久久久久免费| 亚洲免费av在线视频| 91在线观看av| 午夜福利欧美成人| 国产精品久久视频播放| 国产在线精品亚洲第一网站| www日本在线高清视频| 国产精品久久久av美女十八| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 男女床上黄色一级片免费看| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 最近在线观看免费完整版| 婷婷亚洲欧美| 天天添夜夜摸| 精品高清国产在线一区| 亚洲,欧美精品.| 日本在线视频免费播放| 18禁黄网站禁片免费观看直播| aaaaa片日本免费| 91字幕亚洲| 麻豆成人午夜福利视频| 手机成人av网站| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日本三级黄在线观看| 午夜福利高清视频| 又大又爽又粗| 国语自产精品视频在线第100页| 俄罗斯特黄特色一大片| 窝窝影院91人妻| 丰满的人妻完整版| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲全国av大片| 1024视频免费在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| av在线天堂中文字幕| 国产精品野战在线观看| 久久久久久久久久黄片| 精品欧美一区二区三区在线| 韩国精品一区二区三区| a在线观看视频网站| 精品国产国语对白av| 长腿黑丝高跟| 国内精品久久久久精免费| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品,欧美在线| 人妻久久中文字幕网| 久久国产乱子伦精品免费另类| xxxwww97欧美| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 国产欧美日韩一区二区三| 无人区码免费观看不卡| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 男男h啪啪无遮挡| 波多野结衣高清作品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 悠悠久久av| 男女之事视频高清在线观看| 99国产精品99久久久久| 亚洲激情在线av| 亚洲avbb在线观看| 91成人精品电影| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲中文字幕日韩| 色播亚洲综合网| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产成年人精品一区二区| 久久久国产成人精品二区| 悠悠久久av| www.www免费av| 日韩精品中文字幕看吧| 久久中文字幕人妻熟女| 91老司机精品| 国产高清激情床上av| 国产区一区二久久| www.自偷自拍.com| 亚洲国产精品成人综合色| 香蕉久久夜色| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲专区字幕在线| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 久久精品成人免费网站| 一本大道久久a久久精品| 国产一卡二卡三卡精品| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 婷婷丁香在线五月| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲七黄色美女视频| 真人做人爱边吃奶动态| 一a级毛片在线观看| 久久久国产成人免费| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲男人的天堂狠狠| 午夜福利18| 在线看三级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 在线观看免费午夜福利视频| 日韩免费av在线播放| 黄色片一级片一级黄色片| 999久久久国产精品视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美成人午夜精品| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产三级在线视频| 制服诱惑二区| 女性被躁到高潮视频| 哪里可以看免费的av片| 老司机福利观看| 国产成人欧美| 成人午夜高清在线视频 | 午夜福利一区二区在线看| 最近在线观看免费完整版| 91在线观看av| 色综合亚洲欧美另类图片| xxxwww97欧美| 欧美三级亚洲精品| 两个人视频免费观看高清| 在线国产一区二区在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲免费av在线视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久九九精品影院| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产av不卡久久| 精品久久久久久久久久久久久 | 欧美日韩乱码在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一进一出好大好爽视频| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产主播在线观看一区二区| 91大片在线观看| 十八禁网站免费在线| 热re99久久国产66热| 国产欧美日韩精品亚洲av| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费高清在线观看日韩| 又黄又粗又硬又大视频| a级毛片a级免费在线| 人人妻人人看人人澡| 99精品欧美一区二区三区四区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜福利在线在线| 麻豆成人午夜福利视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产高清有码在线观看视频 | tocl精华| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲av熟女| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品国产美女av久久久久小说| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 无遮挡黄片免费观看| 久久这里只有精品19| av中文乱码字幕在线| 成人国语在线视频| 国产精品影院久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日韩av在线大香蕉| 女性被躁到高潮视频| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| av在线天堂中文字幕| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 老司机午夜福利在线观看视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品影院久久| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美 国产精品| 制服诱惑二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产av又大| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精华一区二区三区| 少妇 在线观看| 一本久久中文字幕| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本a在线网址| 色播在线永久视频| a级毛片a级免费在线| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成人精品一区二区免费| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 日本 av在线| 日本在线视频免费播放| 欧美黑人精品巨大| 久久这里只有精品19| 午夜两性在线视频| 久久精品成人免费网站| 成人国产综合亚洲| 在线天堂中文资源库| 欧美大码av| 精品乱码久久久久久99久播| 免费观看精品视频网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| www日本在线高清视频| 午夜福利在线观看吧| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 色尼玛亚洲综合影院| 国产高清激情床上av| svipshipincom国产片| 国产精品久久久人人做人人爽|