血管外膜炎癥大鼠核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、白介素-6、白介素-10的表達(dá)及通心絡(luò)的干預(yù)研究

魯葉弘，付 強(qiáng)，曾定尹

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院心內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng) 110001

近來，大多數(shù)學(xué)者肯定動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的炎癥學(xué)說[1]，在該過程中血管外膜的作用日益受到重視，并逐漸被深入研究。故本研究采用硅膠管包裹大鼠頸動(dòng)脈誘導(dǎo)血管外膜炎癥致動(dòng)脈粥樣硬化樣改變的動(dòng)物模型，觀察各組大鼠頸動(dòng)脈血管信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子活化和循環(huán)血細(xì)胞因子表達(dá)情況。中醫(yī)傳統(tǒng)通絡(luò)方藥通心絡(luò)超微粉劑具有化瘀通絡(luò)和搜風(fēng)解痙之功效，本研究通過其抑制IL-6、IL-10的表達(dá)及其抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，進(jìn)一步證實(shí)其抑制動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

由石家莊以嶺藥業(yè)公司提供通心絡(luò)超微粉；大鼠IL-6、IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；大鼠NF-κB P65免疫組化試劑盒購(gòu)于美國(guó)ZYMED公司。

1.2 動(dòng)物及分組

健康Wistar大鼠30只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。造模成功喂養(yǎng)1周后隨隨機(jī)選取20只隨機(jī)分為兩組：①外膜組，10 只，給予生理鹽水 400 mg/（kg·d）灌胃，1 周；②通心絡(luò)組，10 只，給予通心絡(luò)超微粉 400 mg/（kg·d）灌胃，1 周。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型制作：用10%水合氯醛液，按照30 mg/kg體重腹腔注射麻醉大鼠后，術(shù)區(qū)碘伏消毒。切開頸前正中線皮膚，鈍性分離出左頸總動(dòng)脈，用硅膠管（內(nèi)徑1.0 mm、長(zhǎng)10 mm縱向剖開后）包裹左頸總動(dòng)脈，創(chuàng)口縫合，術(shù)后給予適量青霉素注射5 d，預(yù)防感染，飼養(yǎng)1周。

1.3.2 1 周后用水合氯醛液腹腔注射麻醉動(dòng)物后，處死動(dòng)物，處死前從左心室采血10 ml，取血清備檢。留取包裹硅膠管處的血管段檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的表達(dá)。

1.3.3測(cè)定血清IL-6，IL-10水平：采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3.4 包管段切片核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65的表達(dá)：采用免疫組化法進(jìn)行測(cè)定。 一抗為核因子-κB p65（1∶250） PBS 緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照，根據(jù)ABC法試劑盒進(jìn)行操作，DAB顯色。400倍顯微鏡下觀察，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；等級(jí)資料組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白介素-6、白介素-10（ng/L）的表達(dá)

見表1。

表1 術(shù)后1周各組白介素-6、白介素-10的表達(dá)（±s,ng/L,n=10）

表1 術(shù)后1周各組白介素-6、白介素-10的表達(dá)（±s,ng/L,n=10）

注：與外膜組比較，▲P＜0.01

外膜組TXL組組別 IL-6 147.40±4.65 143.85±2.66▲IL-10 44.78±1.27 42.35±2.31▲

2.2 通心絡(luò)對(duì)炎癥病變血管外膜核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB表達(dá)的比較

見表2。

表2 術(shù)后1周各組核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在各組中的表達(dá)比較（例）

鏡下可見：NF-κB p65活化后進(jìn)入核內(nèi)，呈棕黃色顆粒，胞核幾乎無(wú)染色。外膜組血管壁細(xì)胞較多棕黃色細(xì)胞核（圖1A）；通心絡(luò)組只見極少的棕黃色細(xì)胞核（圖1B），同外膜組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=2.88,P＜0.005）。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用半定量積分分析法。

3 討論

NF-κB是目前發(fā)現(xiàn)的最為重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，NF-κB的活化在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。嚴(yán)重創(chuàng)傷后，通過自分泌或旁分泌等途徑產(chǎn)生的IL-6等因子嚴(yán)重影響傷后組織器官的修復(fù)[2-3]，而產(chǎn)生的中心環(huán)節(jié)是NF-κB的活化[4]。IL-6在炎癥反應(yīng)中起核心調(diào)節(jié)作用，是參與機(jī)體各種調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞因子。由于單一抑炎因子IL-10能抑制多數(shù)促炎因子，所以在AS進(jìn)展中受極大關(guān)注。無(wú)論是促炎因子IL-6，還是抑炎因子IL-10的活化表達(dá)均與核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化密不可分的。通心絡(luò)主要有人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、土鱉蟲、赤芍和冰片等成分，對(duì)血管病均具有明顯的藥理作用，而合劑有協(xié)同增強(qiáng)作用。本實(shí)驗(yàn)觀察到外膜組血管壁NF-κB p65和血清中炎癥細(xì)胞表達(dá)明顯增多，給予通心絡(luò)治療后均可使其表達(dá)明顯減少，且觀察到通心絡(luò)可使IL-10的表達(dá)減少，可能部分與阻斷NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)IL-10抗炎基因的表達(dá)有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明，通心絡(luò)通過穩(wěn)定易損斑塊，降低斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量及炎癥因子斑塊局部的表達(dá)而發(fā)揮作用[5]。本研究結(jié)果顯示，通心絡(luò)具有阻斷炎癥反應(yīng)減輕AS病變的作用，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1]Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2)：115.

[2]Qu JF,Cheng TM.Cells participated in cutaenous wound healing[J].J Zhongguo Lichuang Kangfu,2001,5(12)：74-75.

[3]Qu JF,Hao L,Cheng TM.Stem cells and cutaenous wound healing[J].J Zhongguo Lichuang Kangfu,2002,6(4)：534-535.

[4]Baeuerle P,Henkel T.Function and activation of NF-κB in immune system[J].J Annu ReV Immunol,1994,2(1)：141-179.

[5]吳以嶺.絡(luò)病學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究[M].北京：中國(guó)科學(xué)技術(shù)出版社,2005：208-210.