苷泰膠囊抗乙肝病毒的實驗研究

楊 坤， 賈 雷， 魏思思， 江鳳娟

(1.軍事醫(yī)學科學院北京100850;2.解放軍302醫(yī)院全軍中藥研究所北京100039)

乙肝病毒的慢性感染是臨床的常見病和多發(fā)?。?-2］，嚴重危害了世界人民的健康。全球有約3.5億的 HBV感染者，其中，我國的感染率高達10% ～20%。目前，臨床上使用干擾素和腺苷類似物治療乙肝病毒的慢性感染，但是依然無法從“根”上治療慢性乙肝。因此，尋找安全、有效的抗HBV藥物是當前要務。

苷泰膠囊來源于我院多年使用的協定方，主要由葉下珠、甘草、苦參等組成，在臨床上用于治療慢性病毒感染性肝炎伴有肝郁脾虛及濕熱互結證，治療效果顯著。本實驗分別使用2.2.15細胞和感染鴨乙型肝炎病毒的北京鴨為模型對其抗乙肝病毒作用進行檢測和評價，為苷泰膠囊進一步的研究提供一定的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗試劑 苷泰膠囊，由解放軍第302醫(yī)院提供(090915);拉米夫啶，由英國葛蘭素有限公司生產(09020018)。胎牛血清，由美國Hyclone Lab公司生產;HB-sAg和HBeAg固相放射免疫測定盒，由北方免疫試劑研究所生產;α-32P-dCTP，由北京福瑞生物科技公司生產;Sephadex G-50，Ficoll PVP，由瑞典Pharmacia公司生產;魚精 DNA和牛血清白蛋白均由中科院生理研究所提供;0.45 μm硝酸纖維素膜，由Amersham公司生產。其它試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 1日齡的北京鴨，80～100 g，北京藥植所動物飼養(yǎng)場。動物飼養(yǎng)條件:貳級標準，(軍醫(yī)動字第B98006號)。

1.3 鴨乙型肝炎病毒 強陽性血清由中國醫(yī)學科學院生物技術研究所提供，均采自然感染的上海麻鴨，選用其中DHBV DNA強陽性者(+++)，-70℃保存。

1.4 2.2.15細胞 HBV DNA轉染人的肝癌克隆細胞，由中科院醫(yī)藥生物技術研究所提供。

1.5 儀器 BS-224型生物化學分析測定儀，由北京生化儀器廠生產。

2 實驗方法

2.1 對體內鴨乙型肝炎病毒的影響 將上海麻鴨的DHBV DNA強陽性血清按照0.3 mL/只的劑量經腿脛靜脈內注射入1日齡的北京鴨體內，染毒7 d后取血，檢測提取血清中DHBV DNA的含量。雛鴨的血清經檢測呈DHBV陽性后，將雛鴨隨機分為6組，即病毒對照(模型)組、拉米夫定(0.05 g/kg)和苷泰膠囊(1.15、2.3、4.6 g/kg)3個劑量組，每組6只。按照1.5 mL/只，灌胃給藥，每天2次;病毒對照組給予同體積的生理鹽水。連續(xù)給藥或生理鹽水10 d。分別在給藥后第5天(T5)、第10天(T10)及停藥后第3天(P3)經鴨脛靜脈取血，并分離血清，按照試劑盒中說明書的方法，做血清的斑點雜交，測定OD值(濾光片為490 nm)，計算血清DHBV-DNA光密度。

2.2 對2.2.15細胞內乙型肝炎病毒的抑制作用

2.2.1 對2.2.15細胞的毒性作用:取2.2.15細胞制備成單細胞懸液，計數后調整細胞濃度至10萬個/mL，接種96孔培養(yǎng)板，每孔1 mL，置CO2孵箱(37℃ 5%CO2)培養(yǎng)24 h。用培養(yǎng)基將苷泰膠囊配制成含原藥16 g/L的溶液，分別稀釋至 8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL，加入培養(yǎng)板，每個濃度 3個孔，以無藥細胞組為空白對照，每4天換同濃度藥液。以細胞病變?yōu)橛^察指標，于8 d后在顯微鏡下觀察其病變情況。完全破壞為4;75%破壞為3;50%破壞為2;25%破壞為1;無病變則為0。計算平均細胞病變程度及抑制百分率。按照ReedMeuench法計算TC50，TC0。見表2。

2.2.2 對乙型肝炎病毒表面抗原、e抗原的抑制作用:同上法培養(yǎng)2.2.15細胞，接種24孔培養(yǎng)板。在無毒濃度下，將分別為 500、250、125、62.5 μg/mL 4 個稀釋度的藥液加入培養(yǎng)板，每個濃度3孔，每4天換同濃度藥液，在第8天時收集培養(yǎng)液，-20℃下冰凍保存。用γ計數儀測量每孔的cpm值，計算其抑制率。

2.2.3 對2.2.15細胞DNA抑制實驗:同上法吸除培養(yǎng)液收取細胞，加入裂解液裂解細胞，用等體積的苯酚∶三氯甲烷∶異戊醇抽提2次，加入無水乙醇沉淀核酸，抽干，重新溶于20 μL TE緩沖液作為樣品。取20 μL(DNA含量25 μg)，經變性和中和，以20X SSC緩沖液于硝酸纖維素膜上稀釋至1∶8倍，干烤、預雜交、雜交、洗膜、放射自顯影。沖洗X光片，用gel-pro軟件測定其密度，計算其抑制率。

2.3 統計學方法 用SPSS 11.0軟件進行統計分析，采用齊性資料用單因素方差分析(ANOVA)和配對t檢驗，選擇P＜0.05為其統計學意義。

3 實驗結果

3.1 對體內鴨乙型肝炎病毒的影響 病毒對照組雛鴨感染血清DHBV-DNA后全部呈陽性，實驗全過程中血清DHBV-DNA的水平無明顯變動(P＞0.05)。與自身給藥前比較，苷泰膠囊高、中、低劑量組鴨在給藥后第10天，停藥后第3天，均能顯著地降低DHBV-DNA的水平(P＜0.01);陽性藥在給藥后第5、10天可以顯著地降低血清中DHBV-DNA的水平(P＜0.01)，但停藥3 d時，血清中DHBV-DNA的水平恢復至給藥前，呈現“反跳現象”。實驗結果表明，苷泰膠囊高、中、低劑量均可以有效地抑制DHBV-DNA的水平升高，并且呈現劑量依賴性。見表1，圖1，圖2。

3.2 苷泰膠囊對2.2.15細胞內乙型肝炎病毒的抑制作用

表1 苷泰膠囊在鴨體內對乙型肝炎病毒DHBV-DNA的影響 (±s)

表1 苷泰膠囊在鴨體內對乙型肝炎病毒DHBV-DNA的影響 (±s)

各組給藥后 (T5、T10、P3)OD值與同組給藥前(T0)OD值比較。*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 劑量/(g/kg)bid，po 動物/只 DHBV-DNA 水平T0 T5 T10 P3病毒對照組 6 0.982±0.24 0.996±0.17 0.988±0.20 1.017±.30苷泰 1.15 6 0.835±0.13 0.856±0.15 0.769±0.23＊＊ 0.741±0.10＊＊2.3 6 0.934±0.18 0.748±0.25＊＊ 0.569±0.17＊＊ 0.689±0.09＊＊4.6 6 0.989±0.005 0.716±0.090＊＊ 0.478±0.25＊＊ 0.588±0.05＊＊拉米夫定 0.1 6 0.951±0.06 0.621±0.15＊＊ 0.424±0.07＊＊0.968±0.09

圖1 苷泰膠囊組與病毒對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制率比較

3.2.1 苷泰膠囊對2.2.15細胞的毒性作用 表2表明，苷泰膠囊對2.2.15細胞產生50%抑制作用質量濃度為793.7 μg/mL，無毒性濃度為500 μg/mL，提示苷泰膠囊的藥效濃度應選擇500 μg/mL以下。

3.2.2 苷泰膠囊對2.2.15細胞分泌HbsAg、HbeAg的抑制作用

圖2 鴨血清中DHBV-DNA斑點雜交放射自顯影照片

結果見表3，圖3。實驗結果:苷泰膠囊質量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL 時，對 2.2.15 細胞 HbsAg分泌的抑制率分別為16.80%、11.22%、8.94%、4.18%，與病毒對照組比較均有顯著差異(P ＜0.01)，IC50=1 158.92 μg/mL;苷泰膠囊質量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL 時，對 2.2.15 細胞HbeAg分泌的抑制率分別為26.07%、14.31%、11.16%、4.28%，與細胞比較均有顯著性差異(P＜0.01)，IC50=1 794.14 μg/mL。實驗結果提示，苷泰膠囊對2.2.15細胞HBsAg、HBeAg的分泌具有一定的抑制作用并呈劑量依賴性。

表2 苷泰膠囊對2.2.15細胞的毒性作用 (n=3)

表3 苷泰膠囊在2.2.15細胞中對HbsAg和HbeAg分泌的影響

圖3 苷泰膠囊對2.2.15細胞分泌HbsAg和HbeAg的抑制作用量-效關系圖

3.2.3 苷泰膠囊對2.2.15細胞HBV-DNA的抑制實驗

結果見表4，圖4。苷泰膠囊質量濃度在500、250、125、62.5 μg/mL時，對細胞HBV-DNA的抑制率分別為21.67%、13.71%、2.08%、3.24%，IC50=701.27 μg/mL;拉米夫定藥物質量濃度在 500、250、125、62.5 μg/mL 時，對細胞 HBVDNA的抑制率分別為34.33%、21.44%、15.74%、0.02%，IC50=1 096.27 μg/mL。實驗結果表明，苷泰膠囊對細胞HBV-DNA水平具有一定的抑制作用并呈劑量依賴性。

4 討論

2.2.15 細胞系最早是由美國MountSinai醫(yī)學中心以HBV-DNA轉染人類肝癌細胞株，可以長期穩(wěn)定地分泌HB-sAg和HBeAg，是目前篩選抗乙肝病毒藥物的常用細胞模型［3］。鴨感染DHBV DNA模型可以長期維持病毒血癥，建立方便，并且該病毒與人乙肝病毒同屬嗜肝DNA病毒，復制過程相似，是國家認可的體內評價藥物抗乙肝病毒效果的重要模型［4］。2.2.15細胞及鴨乙肝病毒感染模型是研究乙肝發(fā)病機制、病毒復制過程及篩選有效藥物的理想模型，故本研究選用此兩種模型對苷泰膠囊的抗乙肝病毒活性進行定量評價。

表4 苷泰膠囊在2.2.15細胞中對HBV-DNA水平的抑制作用

圖4 苷泰膠囊對2.2.15細胞中HBV-DNA的抑制作用量-效關系圖

乙型肝炎病毒在肝細胞內持續(xù)復制會引起宿主產生免疫應答，造成細胞的免疫病理損害，是導致肝炎慢性化的病理學基礎。因此針對乙肝病毒的慢性感染的抗病毒治療，是阻斷慢性乙型肝炎發(fā)展的主要措施。慢性病毒性肝炎屬中醫(yī)“黃疸”、“癥積”和“虛損”等病癥范疇。中醫(yī)認為，慢性病毒性肝炎的主要病機多為濕熱夾注，或見虛實互見及本虛標實。治當清肝解毒、健脾益氣。本方中葉下珠可以清熱，涼血，解毒，利濕，以祛濕、瘀、熱、毒之邪，其化學成分主要有木脂素類及生物堿類鞣質等多種成分［5-6］，是目前臨床上應用廣泛的抗肝炎病毒中草藥之一［7-8］。苦參性寒，味苦，可清熱解毒，主要含有具有抗腫瘤、降低轉氨酶、抗乙肝病毒等作用的氧化苦參堿和苦參堿等生物堿成分。在臨床上廣泛用于病毒性肝炎的治療。人參莖葉總皂苷用于肝炎的治療，可起到扶正作用。甘草健脾益氣，固本扶正，以補其虛。綜合全方，共奏清肝解毒、健脾益氣之功。

實驗結果表明，苷泰膠囊可以較好地在體外及體內抑制乙肝病毒的復制，并且，隨著給藥劑量和時間的增加，對乙肝病毒的抑制作用逐漸增強，呈現一定的劑量和時間依賴性。停藥后，沒有出現由于病毒再復制而產生的“反跳”現象。至于其活性部位有待于進一步研究。

［1］Simonetti J，Bulkow L，McMahon B J，et al.Clearance of hepatitis B surface antigen and risk of hepatocellular carcinoma in a co-hort chronically infected with hepatitis B virus［J］.Hepatology，2010，51(5):1531-1537.

［2］Ponsiano O，Christopher K O，William M L.Hepatitis B virus infection:current status［J］.Am J of Med，2005，118(12):1413.

［3］鄭浩杰，劉國強.利用2.2.15細胞株篩選抗乙肝病毒中草藥的體外實驗研究進展［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2003，26:61-63.

［4］Msaon W S，Seal G，Summers J.Virus of Pekin ducks with structural and biological relatedness to human hepatitis B virus［J］.J Virol，1980，36(3):829-836.

［5］仲 英，左春旭，李鳳琴，等.葉下珠化學成分級其抗乙肝病毒活性的研究［J］.中國中藥雜志，1998，23(6):363-364.

［6］張?zhí)m珍，郭亞建，涂光忠，等.葉下珠新鞣質的分離與鑒定［J］.藥學學報，2004，39(2):119-122.

［7］Chia C C，Yu C L，Karin C S，et al.Lignans from Phyllanthus unnaria［J］.Phytochmistry，2003，63:825-833.

［8］周 軍，李 茂，樊亦軍.葉下珠醇提取物對實驗性肝損傷的保護作用［J］.廣西中醫(yī)學學院學報，2004，7(1):5-7.