丹參醇沉渣中有效成分的再提取

范步高

(上海長征富民金山制藥有限公司上海201506)

丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。所含的化學(xué)成分主要有兩大類:水溶性的酚酸類化合物和脂溶性的丹參酮類化合物［1］，在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的丹參類注射劑中，大多是以酚酸類化合物為指標(biāo)成分［2］，其中丹參素(丹參素鈉)具有抗血栓、抗氧化、抗炎和抗腫瘤等明顯的藥理活性［3-5］，隨著科學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)丹參的有效成分也有了更深一步認(rèn)識(shí)，并確認(rèn)了丹酚酸B是較丹參素活性更強(qiáng)的丹參酚酸類有效成分，并在丹參功效中占有相當(dāng)重要地位，對(duì)心、腦、肝、腎等多個(gè)器官均具有保護(hù)作用，具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化、抗心肌缺血及調(diào)血脂作用、清除自由基作用、內(nèi)皮素和釋放作用、鈣通道阻滯作用、TXA2/PG12平衡調(diào)節(jié)劑作用等［6-8］。

丹參酚酸類有效成分的提純一般采用傳統(tǒng)的水提醇沉法［2］，但有效成分極易被沉淀的“雜質(zhì)”所包裹。本文推薦簡便易行的用相同濃度的乙醇對(duì)醇沉渣再提取被包裹的有效成分，以提高產(chǎn)品有效成分的含量和保證臨床使用療效。

1 丹參注射液酚酸類有效成分的提取現(xiàn)狀

水提醇沉法，其原理即是利用經(jīng)水提取的(酚酸類)有效成分既能溶于水又能溶于乙醇，而淀粉、無機(jī)鹽、多糖、蛋白質(zhì)等“雜質(zhì)”則將會(huì)隨著乙醇的不斷加入而逐漸被析出、沉淀［9］。但酚酸類有效成分的損失也將隨著醇濃度增高而增加，有較多學(xué)者都認(rèn)為丹參水提液的醇沉最佳醇濃度為50% ～60%［10-15］(見表1)，而用于注射液的丹參二次醇沉最佳含醇量分別為①60%，②70%［16］。王曉泊等為提高注射用丹參成品收率及有效成分的相對(duì)含量，用大孔吸附樹脂對(duì)經(jīng)二次醇沉(含醇量分別為①60%，②85%)的醇沉渣進(jìn)行了回收，結(jié)果使成品收率增加了14.03%，丹參素鈉相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長了15.75%，總酚酸相對(duì)含量增加了22.46%［17］，這也充分說明了在丹參醇沉過程中，確有較多量的有效成分損失在醇沉渣中。而在丹參類注射液現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)［2，18-19］中，丹參的二次醇沉的含醇量均分別為①75%和②85%，所以，丹參的有效成分損失更大，但國家標(biāo)準(zhǔn)中的醇沉濃度屬于純化關(guān)鍵參數(shù)，不得隨意變更。所以，再加之藥材質(zhì)量和操作水平的差異，丹參成品質(zhì)量的波幅也隨之成倍加大［20］(見表2)。

表1 不同醇沉工藝的有效成分量損失率/%

表2 同一廠家不同批號(hào)及不同廠家丹參注射液含量測定結(jié)果(n=8)

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)器材及試劑 w501升降恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)，R501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)，SY3200超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)，DS-671電子秤(上海寺岡電子有限公司)，高效液相色譜儀(安捷倫1100)，紫外分光光度儀(島津UV-2401PC)，75%醇沉渣(上海長征富民金山制藥有限公司080601丹參提取)，乙醇(丹參醇沉液濃縮回收)。

2.2 檢測方法

2.2.1 丹參素鈉、原兒茶醛、總酚測定依據(jù)丹參滴注液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［2］進(jìn)行測定。

2.2.2 丹酚酸B測定照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄ⅥD)測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈為流動(dòng)相A，0.03%磷酸水溶液為流動(dòng)相B，按表3進(jìn)行梯度洗脫;體積流量為0.8 mL/min，柱溫:30℃;檢測波長:288 nm。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

表3 丹酚酸B檢測梯度洗脫

對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對(duì)照品適量，加10%甲醇制成每1 mL含丹酚酸 B 0.1 mg的溶液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液的制備 取提取液，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

測定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5～10 μL，注入液相色譜儀，測定，按峰面積用外標(biāo)法計(jì)算其含量。

2.3 再提取工藝 取丹參75%醇沉渣(含量折算約3.1 g生藥/g渣)適量，加入3倍量(mL/g)75% ～76%乙醇，50～60℃水浴，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)和超聲波清洗器超聲各1 h，放冷，取上清液，檢測丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、總酚量。

3 結(jié)果

75%醇沉渣再提取液含量檢測結(jié)果(見表4)同批次醇沉液制成品n=3。

表475 %醇沉渣再提取液含量檢測結(jié)果(mg/g生藥)(n=3)

4 討論

由表4可看出，丹參75%醇沉渣中有較多的有效成分被損失，可以最簡便易行的方法再提取，特別是對(duì)丹酚酸B(丹酚酸B在后續(xù)的濃縮和滅菌等高溫操作中有較大部分水解成丹參素鈉和原兒茶醛［21］)。綜合考慮3個(gè)有效成分和總酚，旋轉(zhuǎn)和超聲的效果相近。若應(yīng)用于生產(chǎn)，則可參照旋轉(zhuǎn)的方式，利用原有的醇沉罐生產(chǎn)設(shè)備，攪拌提取，液固接觸更完全，被包裹的有效成分的“轉(zhuǎn)溶”效果則會(huì)更佳。

選擇75%醇沉渣進(jìn)行再提取，是因?yàn)?第一次)75%醇沉的有效成分損失大于(第二次)85%醇沉的有效成分損失。若有操作不當(dāng)，如濃縮液的相對(duì)密度較大或醇沉用的乙醇濃度過高，則(第二次)85%醇沉有效成分損失較多時(shí)，也可對(duì)85%醇沉渣進(jìn)行再提取。

采用相同濃度的乙醇對(duì)醇沉渣再提取，除簡便易行外，另一最主要考量是此操作完全在法定的標(biāo)準(zhǔn)制法框架下、未涉及工藝改變，并能夠及時(shí)將再提取液進(jìn)行同批次合并進(jìn)入下道工序，完全符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的要求，且又不影響生產(chǎn)周期。

據(jù)查詢SFDA(國家食品藥品監(jiān)督管理局)數(shù)據(jù)庫，目前SFDA頒布的丹參注射液生產(chǎn)批文有101張，香丹注射液(復(fù)方:丹參、降香)生產(chǎn)批文也有165張，他們均屬“老”產(chǎn)品，由于原研時(shí)期的研究和檢測水平的限制等歷史原因，在最早的1977年版中國藥典(丹參注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn))及以后的各地方標(biāo)準(zhǔn)中，均無丹參有效成分含量的檢測要求［22-26］。1998年國家衛(wèi)生部頒布的藥品標(biāo)準(zhǔn)僅增加了對(duì)原兒茶醛有效成分含量的檢測［18-19］，直至2002年國家藥品監(jiān)督管理局頒布的“地標(biāo)升國標(biāo)”藥品標(biāo)準(zhǔn)中的丹參類注射液或滴注液又增加了對(duì)丹參素鈉有效成分含量及總酚的檢測［2］。但在所有這些注射劑的標(biāo)準(zhǔn)處方中，都遵循了傳統(tǒng)的一帖一煎中藥處方模式，即均是以中藥材作為注射劑的投料依據(jù)，規(guī)定了每1000 mL注射劑所需藥材投入量，未及考慮中藥材的采集地點(diǎn)、采收時(shí)間的不同，所富集的有效成分會(huì)有較大差異［27-29］，再加之提取設(shè)備型號(hào)的不同、操作人員對(duì)關(guān)鍵工序掌握的經(jīng)驗(yàn)差異等，也均會(huì)對(duì)提取質(zhì)量產(chǎn)生很大的差異。所以，雖然生產(chǎn)出的成品(見表2)都能符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最低要求，但可控性較差，故造成企業(yè)內(nèi)或企業(yè)間產(chǎn)品的實(shí)際質(zhì)量差異很大，使得臨床應(yīng)用中的療效也隨之產(chǎn)生很大波動(dòng)。系統(tǒng)的解決辦法之一是依據(jù)現(xiàn)有的相對(duì)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品為依據(jù)，提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。二是隨著研究的深入和檢測水平的提高，完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。三是改變處方投料依據(jù)，減少藥材提取和純化的中間不確定性環(huán)節(jié)，即改變?cè)兴幾⑸鋭┮灾兴幉耐读峡刂茷橹兴帢?biāo)準(zhǔn)提取物投料控制，以保證中藥注射劑或其他中藥制劑產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定、可控和臨床使用療效。而本文推薦的用相同濃度的乙醇對(duì)醇沉渣進(jìn)行“洗滌”再提取被包裹的有效成分，僅是在先行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的框架下，為提高丹參產(chǎn)品的有效成分含量，保證臨床使用療效的一種簡便易行、具有較高生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的實(shí)用方法。

致謝:本實(shí)驗(yàn)檢測工作由本公司質(zhì)檢科倪慧芳技師幫助完成。

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