熱痹消顆粒提取純化工藝研究

王寧，陳曉斌，劉志輝，劉漢清*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210046;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)一附院，江蘇南京210036)

熱痹消顆粒由粉萆薢、黃柏、景天三七等八味藥組成，具有清熱解毒、泄?jié)嵬ńj(luò)、消腫定痛的功效，臨床用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、高尿酸血癥及痛風(fēng)性腎病等疾病。為建立科學(xué)合理的提取純化工藝，本研究采用正交試驗(yàn)考察醇提黃柏時回流提取時間、提取次數(shù)、乙醇濃度對小檗堿含量的影響［1］，優(yōu)選出黃柏提取工藝條件;考察水提粉萆薢等七味時加水倍量、提取時間、提取次數(shù)對虎杖苷含量和干膏得率的影響［2-3］，優(yōu)選出最佳水提工藝條件;并通過對醇沉工藝的優(yōu)選確立熱痹消顆粒的提取純化工藝。

1 儀器和試藥

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司);十萬分之一電子分析天平(德國SARTOIUS，型號BP211D);鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:0713-9906)、虎杖苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:090318);甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純;粉萆薢等飲片均購自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，符合中國藥典2010版一部要求。

2 方法和結(jié)果

2.1 工藝路線根據(jù)熱痹消各味藥所含成分的特點(diǎn)，確定制備工藝為:黃柏:醇提→合并濾液→回收乙醇→浸膏Ⅰ;黃柏藥渣與其余七味:水提→合并濾液→濾過→濃縮至清膏→醇沉→靜置24 h→回收乙醇→浸膏Ⅱ;混合浸膏Ⅰ和浸膏Ⅱ→加入輔料→制粒。

2.2 黃柏醇提工藝優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選定提取時間、提取次數(shù)、乙醇濃度作為考察因素，以鹽酸小檗堿為指標(biāo)性成分［4-6］，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。見表1。

表1 因素與水平

2.2.2 黃柏的提取稱取黃柏飲片9份，每份50 g，加入10倍量的乙醇，按正交試驗(yàn)表回流提取，過濾，合并濾液，備用。

2.2.3 鹽酸小檗堿測定

2.2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)［7］色譜柱:Hedera-ODS-3 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈－0.448%磷酸二氫鉀(35∶65);體積流量:1 mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:265 nm。理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算不低于4 000。

2.2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸小檗堿4.98 mg，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，精密量取5 mL，置25 mL的量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得(鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度0.039 8 mg/mL)。

2.2.3.3 供試品溶液的制備精密吸取黃柏醇提取液1 mL至25 mL的量瓶中，甲醇定容，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3.4 線性關(guān)系考察精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=31 635X－16.604，r=0.999 8。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿在0.119 4～1.393 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3.5 測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定即得。計(jì)算，鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.91%、3.07%、3.39%、2.83%、3.25%、2.52%、2.55%、2.46%、3.48%。

直觀分析知，以鹽酸小檗堿含量為評價(jià)指標(biāo)，最佳提取工藝條件為A2B3C2，各因素的主次順序?yàn)镃、B、A。方差分析(表2)表明:A、B因素對鹽酸小檗堿含量無顯著性影響(P＞0.05)，C因素對鹽酸小檗堿含量有顯著性影響(P＜0.05)。綜上，從節(jié)約成本和提高效率的角度考慮，確定優(yōu)選提取工藝為A2B2C2，即10倍量的60%的乙醇提取2次，每次1 h。

表2 鹽酸小檗堿含量方差分析表

2.3 粉萆薢等七味藥水提工藝優(yōu)選根據(jù)單因素考察實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定粉萆薢等七味藥最佳水提取工藝為:8倍量的水提取3次，每次1 h。正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，虎杖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.52、0.66、1.06、0.73、1.28、0.60、1.18、0.55、0.72 mg/g;干膏得率分別為13.09%、16.51%、21.94%、17.60%、23.62%、10.41%、20.38%、16.38%、14.96%;綜合評分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分別為0.46、0.59、0.87、0.64、1.00、0.45、0.90、0.53、0.59。

2.4 醇沉工藝

2.4.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以浸膏的相對密度、醇沉濃度為考察因素，每個因素3水平，將最佳水提工藝的提取液，按下表的因素水平，選用L9(34)正交表安排醇沉實(shí)驗(yàn)，見表3。

表3 因素與水平

2.4.2 提取液的制備按醇提最佳工藝和水提取最佳工藝分別提取黃柏飲片45 g、含粉萆薢的復(fù)方飲片540 g，所得提取液平均分為9份(每份相當(dāng)于飲片65 g)，分別按照因素水平表和正交試驗(yàn)表所列實(shí)驗(yàn)參數(shù)，濃縮至不同程度，冷卻，攪拌下緩慢加入95%乙醇沉至不同濃度，冷處放置24 h，過濾，備用。

2.4.3 干膏得率測定精密量取上述醇沉液5 mL，置干燥恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中烘至恒重，取出，迅速置干燥器中冷卻30 min，精密稱定。計(jì)算，結(jié)果見2.4.4.5項(xiàng)。

2.4.4 虎杖苷測定

2.4.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)［8］流動相:乙腈-水(23∶77);體積流量:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:306 nm。理論塔板數(shù)按虎杖苷峰計(jì)算不低于3 000。

2.4.4.2 對照品溶液的制備精密稱取虎杖苷12.74 mg，置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，精密量取1.5 mL置25 mL的量瓶中，稀乙醇定容，搖勻即得(虎杖苷質(zhì)量濃度0.015 29 mg/mL)。

2.4.4.3 供試品溶液的制備精密量取水提醇沉液1 mL，置25 mL量瓶中，稀乙醇定容，即得。

2.4.4.4 線性關(guān)系考察精密吸取虎杖苷對照品溶液3、5、10、15、25、35 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為:Y=3 862.41X+27.463，r=0.999 9，結(jié)果表明虎杖苷在進(jìn)樣量0.045 87～0.535 1 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.4.5 測定法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。計(jì)算，虎杖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.94、1.17、0.71、0.89、0.96、0.52、0.86、0.99、0.50 mg/g;干膏得率分別為11.00%、9.80%、8.77%、9.35%、10.20%、8.36%、6.27%、7.07%、6.10%;綜合評分［(虎杖苷含量/虎杖苷含量最大值)×0.6+(干膏得率/干膏得率最大值)×0.4)］分別為0.88、0.97、0.68、0.79、0.86、0.57、0.67、0.76、0.48。

方差分析(見表4):A和B因素對虎杖苷含量和干膏得率均有顯著影響(P＜0.01)，確定最佳工藝為A1B2，即提取液的相對密度為1.05～1.10(60℃)，醇沉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%。

表4 方差分析

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)按處方比例取粉萆薢、黃柏、景天三七等飲片，共3份，按最佳醇提取工藝提取黃柏:加10倍量60%的乙醇，回流提取2次，每次1 h，測定鹽酸小檗堿量;按最佳水提取工藝提取粉萆薢等七味:加8倍量的水，回流提取3次，每次1 h;水提液的醇沉:浸膏相對密度1.05～1.10(60℃)，加95%乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%，冷處放置24 h，水提取和醇沉實(shí)驗(yàn)分別測定虎杖苷含量和干膏得率。結(jié)果(見表5)表明優(yōu)選出的工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好，該提取純化工藝優(yōu)選條件經(jīng)中試放大驗(yàn)證，結(jié)果與小試基本吻合，證明為穩(wěn)定可行的工藝。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 粉萆薢等七味水提實(shí)驗(yàn)表明:提取次數(shù)對結(jié)果有顯著性影響。在篩選出的其它參數(shù)不變的情況下，提取3次和4次的虎杖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和干膏得率分別為1.27 mg/g、1.28 mg/g;21.51%、22.02%，結(jié)果差異不大，故從生產(chǎn)周期和成本角度考慮將提取次數(shù)定為3次。

3.2 虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛［8］，虎杖苷是虎杖的有效成分之一［9-10］，具有抵抗內(nèi)毒素休克、抗病原微生物等作用［11］，與熱痹消的主治功能一致，干膏得率是評價(jià)水提取效率和醇沉效率的傳統(tǒng)手段，綜合評分時，兼顧上述兩個關(guān)鍵指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)定位0.6、0.4，具有一定的合理性。

3.3 最佳醇沉工藝所得樣品中虎杖苷的轉(zhuǎn)移率為92.9%，干膏得率降為原來的52.7%，表明該工藝在最大限度保留和富集有效物質(zhì)的基礎(chǔ)上盡量去除無效物質(zhì)，大大降低了服用量。

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