漢族兒童Ⅱ相藥物代謝酶基因GSTM1和GSTT1的多態(tài)性分布

劉 芳 苗 青 肖 婧 孫 琳 申 晨 焦偉偉 馮衛(wèi)星 吳喜蓉 申 丹 申阿東

人谷胱甘肽-S-轉移酶(hGSTs)是體內生物轉化過程中Ⅱ相代謝酶的主要成員，在肝臟中含量最高。hGSTs由一個超基因家族編碼，根據(jù)所編碼酶蛋白化學性質、氨基酸順序及酶動力學特性的不同可將其分為α、μ、π、δ、θ、κ、ζ和ω等8個家族成員[1]。其中μ亞型的GSTM1和θ亞型的GSTT1由于位于基因兩側的兩段高度同源的序列發(fā)生同源重組而導致基因缺失(也稱空白基因型)[2]，在人群中的多態(tài)性表現(xiàn)為基因部分或全部缺失。研究發(fā)現(xiàn)GST基因多態(tài)性缺失除與肝癌、肺癌[3]、哮喘[4,5]及糖尿病[6]等疾病相關外，在藥物的Ⅱ相代謝過程中也起著十分重要的作用。以抗結核的一線藥物異煙肼為例，GST主要參與異煙肼代謝中的解毒過程，通過催化Ⅰ相代謝中產生的毒性中間代謝物與谷胱甘肽共價結合并排出體外而起到解毒作用。然而，GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性缺失將使GST活性下降或失活，解毒能力相應喪失，最終導致肝毒性，致使該藥物在抗結核治療中終止和治療失敗[7]，臨床已停用。不同個體在基因水平上的差異，是造成個體間GST含量和活性差異、代謝表型差異以及種族地域差異的主要原因之一[8,9]。目前研究顯示，中國漢族人群GSTM1和GSTT1基因缺失率較高，均高于40%[10～12]。因此，本研究以中國漢族兒童為研究對象，通過對GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性的檢測，初步了解中國漢族兒童GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布特征，并判斷代謝表型，豐富和完善中國漢族人群相關遺傳學數(shù)據(jù)庫，以期對不同個體制定合適的用藥方案提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 樣本來源和選擇 選擇2005至2010年首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院門診健康查體的漢族兒童，以進行血生化檢測的剩余血樣量能保證本研究需要量的血樣作為研究樣本。除外患有嚴重感染性疾病、自身免疫性疾病、內分泌系統(tǒng)疾病、遺傳性及先天性疾病、HIV感染，并除外患有與GST基因相關的肝癌、肺癌、膀胱癌[3]、哮喘[4,5]、白內障[13]、糖尿病[6]、心血管[14]及精神病[15]等疾病患兒。

1.2 倫理審核 本研究經首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因組DNA提取 取EDTA抗凝靜脈血2 mL，采用改進的Miller鹽析法提取全血中人基因組DNA，溶于TE溶液，經分光光度計測量濃度后，-20 ℃保存。

1.3.2 PCR擴增 根據(jù)文獻[16]合成4對引物(表1)，應用PCR擴增技術檢測GSTM1和GSTT1的基因多態(tài)性。

引物GSTM1 和GSTT1基因反應體系：50～100 ng 基因組DNA，引物1 μL，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司，KT201-02)，補充去離子水至總體積為25 μL。反應條件：預變性94℃ 3 min，變性94℃ 30 s，退火30 s，延伸72℃ 1 min。循環(huán)數(shù)30個，72℃延伸5 min。

引物GSTM1 和GSTT1缺失的反應體系：50～100 ng基因組DNA，引物1 μL，12.5 μL Prime STAR HS(TaKaRa，DR010A)，補充去離子水至總體積為25 μL。反應條件：預變性94℃ 3 min，變性98℃ 10 s，退火5 s，72℃延伸10 min，循環(huán)數(shù)40個，72℃延伸10 min。

PCR反應產物在1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg·mL-1溴化乙錠)中130 V電泳30 min，在紫外反射交聯(lián)儀上觀察結果，應用凝膠成像系統(tǒng)拍照。依據(jù)擴增條帶的有無，判定GSTM1和GSTT1基因型(圖1)。實驗結果經過反復PCR驗證，以保證實驗結果真實可靠。

表1 GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分析PCR引物

1.3.3GSTM1和GSTT1基因缺失拷貝數(shù)及代謝表型的判斷 根據(jù)GSTM1和GSTT1基因缺失的拷貝數(shù)不同，可將基因型/代謝表型分為：①完全缺失基因型/慢代謝型：含有2個拷貝缺失突變的等位基因而使酶活性完全喪失(突變純合子，即*0/*0)[17](圖1A條帶1a、b，圖1B條帶4a、b)；②單拷貝缺失基因型/中間代謝型：具有一個單拷貝缺失突變的等位基因而使酶活性減弱(突變雜合子，即*1/*0)(圖1A條帶2a、b，圖1B條帶5a、b)；③未缺失基因型/快代謝型：具有2個正?？截惖任换?野生型純合子，即*1/*1)，正常表型(圖1A條帶3a、b，圖1B條帶6a、b)。

圖1GSTM1和GSTT1基因型及代謝表型的判斷

Fig 1 Determination ofGSTM1/GSTT1 genotype and phenotype

Notes A:GSTM1; B:GSTT1; 1:GSTM1(*0/*0),GSTM1 deletion amplifying fragment was 4 748 bp; 2:GSTM1(*1/*0),GSTM1 gene amplifying fragment was 625 bp，GSTM1 deletion amplifying fragment was 4 748 bp; 3:GSTM1(*1/*1)，GSTM1 gene amplifying fragment was 625 bp；4：GSTT1(*0/*0)，GSTT1 deletion amplifying fragment was 3 106 bp；5GSTT1(*1/*0),GSTT1 gene amplifying fragment was 969 bp，GSTT1 deletion amplifying fragment was 3 106 bp；6GSTT1(*1/*1)，GSTT1 gene amplifying fragment was 969 bp; a: referring to the PCR product of used primers for gene; b: referring to the PCR product of used primers for gene deletion, respectively. Genotypes were determined by the combination of gel electrophoresis of a and b

1.4 不同人群GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性對比分析 以GSTM1和GSTT1為主題詞，檢索PubMed等數(shù)據(jù)庫，收集亞洲人、黑種人和高加索人群的GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布的文獻，入選文獻需有相關基因型的頻率數(shù)據(jù)，與本研究漢族分析人群基因型數(shù)據(jù)進行比較。

1.5 統(tǒng)計學方法 檢驗各基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳(HWE)平衡定律?；蛐皖l率比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布特征 786例漢族分析人群樣本進行GSTM1和GSTT1基因型檢測，其中男性486份，女性300份，年齡在0～14歲，平均年齡5.4歲。經反復實驗和結果判讀，全部樣本均獲得基因型判定結果。HWE平衡檢驗結果顯示，GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布符合HWE平衡定律(P>0.05)。

GSTM1和GSTT1完全缺失基因型/慢代謝型(*0/*0)的頻率分別為59.3%(466/786例)和58.4%(459/786例)；單拷貝缺失基因型/中間代謝型(*1/*0)的頻率分別為34.0%(267/786例)和35.1%(276/786例)；未缺失基因型/快代謝型(*1/*1)的頻率分別為6.7%(53/786例)和6.5%(51/786例)。

2.2GSTM1與GSTT1基因多態(tài)性的聯(lián)合表達χ2檢驗結果顯示，GSTM1和GSTT1基因型在研究人群中的分布相互獨立，無明顯關聯(lián)(表2)。

表2GSTM1與GSTT1基因多態(tài)性在漢族分析人群中聯(lián)合表達情況(n)

Tab 2 Co-expression frequency ofGSTM1 andGSTT1 in Chinese Han children(n)

GSTT1*1/*1*1/*0*0/*0TotalGSTM1*1/*14173253*1/*016106145267*0/*031153282466Total51276459786

Notesχ2=0.261,P=0.967

2.3GSTM1與GSTT1基因多態(tài)性的性別差異 如表3所示，GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布與性別無顯著關聯(lián)，差異無統(tǒng)計學意義。

表3GSTM1與GSTT1的基因多態(tài)性分布的性別差異分析[n(%)]

Tab 3 Genotype distribution ofGSTM1 andGSTT1 gene polymorphism between sexes[n(%)]

*1/*1*1/*0*0/*0GSTM1Male(n=486)35(7.2)1)161(33.1)1)290(59.7)1)Female(n=300)18(6.0)106(35.3)176(58.7)GSTT1Male(n=486)28(5.8)2)178(36.6)2)280(57.6)2)Female(n=300)23(7.7)98(32.7)179(59.7)

Notes 1) malevsfemale,χ2=0.694,P=0.707; 2) malevsfemale,χ2=1.887,P=0.389

2.4GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性在不同種族的分布 本研究漢族分析人群GSTM1基因多態(tài)性分布與亞洲人和高加索人群接近，差異無統(tǒng)計學意義；與黑種人群差異有統(tǒng)計學意義；本研究分析人群GSTT1基因多態(tài)性分布與亞洲人接近，差異無統(tǒng)計學意義；與黑種人和高加索人群差異有統(tǒng)計學意義(表4)。提示GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性分布具有明顯的種族特異性。

表4 不同種族人群GSTM1和GSTT1基因純合缺失率(%)

Tab 4Frequencies ofGSTM1 andGSTT1 gene homozygotes of deletions in worldwide populations(%)

RacenGSTM1(*0/*0)GSTT1(*0/*0)Ourstudy78659.358.4Asian(average)51.741.6SaudiArabia[18]51354.625.0Taiwan,China[19]57450.043.9Japan[19]12850.845.8Korean[20]54951.451.6Black(average)28.526.2SouthAfrica[21]9623.020.0USA[22]27128.017.0Namibia[19]13411.235.8Zimbabwe[21]15024.026.0Turkey[23]9832.722.4Tanzania[21]22033.025.0Brazil[24]23332.826.3Ethiopia[25]15343.837.3Gaucasian(average)53.021.1Danmark[16]20052.514.0USA[22]39252.016.0France[26]13949.022.0Autrialian[27]17157.317.5Italy[25]12049.228.3Spain[25]9455.327.7Brazil[24]13755.422.3

NotesGSTM1: our studyvsAsian,χ2=0.992,P=0.393; our studyvsBlack,χ2=18.727,P=0.000; our studyvsGaucasian,χ2=0.476,P=0.476;GSTT1: our studyvsAsian,χ2=3.180,P=0.085; our studyvsBlack,χ2=21.018,P=0.000; our studyvsGaucasian,χ2=28.643,P=0.000

3 討論

同一種藥物以標準化劑量應用于不同個體時，藥物所產生的療效和個體對藥物的不良反應并不相同，盡管年齡、性別、飲食、肝功能、腎功能、基礎疾病及聯(lián)合用藥等因素都可能影響藥物的療效和毒性作用，但目前認為20%～95%的個體差異由個體遺傳背景所決定[28～30]，遺傳變異決定藥物代謝酶在不同個體中含量和活性的差異，從而導致對藥物反應的不同，是引起藥物不良反應個體差異的重要原因之一。因此，了解GSTM1和GSTM1基因多態(tài)性及代謝表型在中國漢族兒童中的分布，指導臨床針對不同基因型/代謝表型的個體實施個體化用藥有重要意義。

hGSTs是體內生物轉化最重要的Ⅱ相解毒酶之一，在外源性化學物質的體內轉化Ⅱ相反應中，通過催化化學物質和谷胱甘肽結合反應而發(fā)揮解毒作用。異煙肼最嚴重的不良反應肝損害可導致抗結核治療終止或失敗。異煙肼可通過旁路途徑水解產生肼，與乙酰肼在CYP2E1的作用下轉化為乙酰偶氮、烯酮及乙酰陽離子等，均屬于肝毒性物質。這類肝毒性物質必須通過Ⅱ相解毒酶GST催化，在肝臟內與谷胱甘肽共價結合并排出體外，從而起到解毒作用。GSTM1和GSTT1基因缺失多態(tài)性使GST活性降低或失活，導致藥物代謝過程中產生的毒性中間代謝物不能被及時消除，可能是引起肝損害的原因之一[31～33]。

既往針對GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性的研究多未將單拷貝缺失基因型(*1/*0)與完全缺失基因型(*0/*0)進行區(qū)分。本研究根據(jù)基因缺失的拷貝數(shù)，分為未缺失基因型即野生型純合子(*1/*1)、單拷貝缺失基因型即突變雜合子(*1/*0)和完全缺失基因型即突變純合子(*0/*0)。

既往國內學者研究顯示，中國漢族人群GSTM1和GSTT1基因缺失率均高于40%[10～12]。本研究與既往研究結果基本一致。其中GSTM1 和GSTT1完全缺失基因型/慢代謝型(*0/*0)的頻率分別為59.3%和58.4%。本研究同時顯示，GSTM1和GSTT1單拷貝缺失基因型/中間代謝型(*1/*0)頻率分別為34.0%和35.1%，提示有必要對中間代謝型(*1/*0)和慢代謝型(*0/*0)進行區(qū)分。

由于GST在藥物代謝過程中具有重要的解毒作用，其活性的高低決定了酶的解毒功能的強弱，而GST活性的高低又與個體的遺傳背景密切相關。因此，綜合其他與藥物代謝相關的因素，可根據(jù)個體遺傳基因的特異性，實現(xiàn)藥物的個體化治療。個體GSTM1和GSTT1基因為完全缺失基因型/慢代謝型或單拷貝缺失基因型/中間代謝型時，由于其解毒功能較弱，在臨床治療時應適當減少用藥劑量或延長用藥間隔時間，從而避免發(fā)生藥物的不良反應。個體攜帶GSTM1和GSTT1基因為未缺失基因型/快代謝型時，由于其解毒功能相對較強，在病情需要時可適當增加用藥劑量或縮短用藥間隔時間以提高臨床療效。鑒于性別對GSTM1和GSTT1基因多態(tài)性的影響不顯著，因此臨床上用藥可不考慮性別因素。

文獻對比分析顯示，不同的種族人群GSTM1和GSTT1基因缺失率存在明顯不同，提示Ⅱ相代謝中GST的解毒功能在不同種族也存在較大差別。而中國的抗結核藥物劑量使用標準與WHO基本一致[34,35]。因此有必要制定適合中國漢族兒童特有的藥物劑量及治療方案，并結合不同基因型實施個體化治療方案，從而提高藥物的療效。

本研究的不足之處和局限性：①GST僅是影響藥物代謝的一項因素，具體的藥物治療方案還需要結合許多其他因素進行分析；②本研究未涉及異煙肼肝損害和GST基因多態(tài)性的量效關系，需進一步研究明確。

[1]Strange RC, Spiteri MA, Ramachandran S, et al. Glutathione-S-transferase family of enzymes. Mutat Res, 2001, 482(1-2): 21-26

[2]Bolt HM, Thier R. Relevance of the deletion polymorphisms of the glutathione S-transferases GSTT1 and GSTM1 in pharmacology and toxicology. Curr Drug Metab, 2006, 7(6): 613-628

[3]Strange RC, Jones PW, Fryer AA. Glutathione S-transferase: genetics and role in toxicology. Toxicol Lett, 2000, 112-113: 357-363

[4]Lee YL, Lin YC, Lee YC, et al. Glutathione S-transferase P1 gene polymorphism and air pollution as interactive risk factors for childhood asthma. Clin Exp Allergy, 2004, 34(11): 1707-1713

[5]Tamer L, Calikoglu M, Ates NA, et al. Glutathione-S-transferase gene polymorphisms (GSTT1, GSTM1, GSTP1) as increased risk factors for asthma. Respirology, 2004, 9(4): 493-498

[6]Davis RL, Lavine CL, Arredondo MA, et al. Differential indicators of diabetes-induced oxidative stress in New Zealand white rabbits: role of dietary vitamin E supplementation. Int J Exp Diabetes Res, 2002, 3(3): 185-192

[7]Frieden TR, Sterling TR, Munsiff SS, et al. Tuberculosis. Lancet, 2003, 362(9387): 887-899

[8]Geisler SA, Olshan AF. GSTM1, GSTT1, and the risk of squamous cell carcinoma of the head and neck: a mini-HuGE review. Am J Epidemiol, 2001, 154(2): 95-105

[9]Cotton SC, Sharp L, Little J, et al. Glutathione S-transferase polymorphisms and colorectal cancer: a HuGE review. Am J Epidemiol, 2000, 151(1): 7-32

[10]Liu L, Li C, Gao J, et al. Genetic polymorphisms of glutathione S-transferase and risk of vitiligo in the Chinese population. J Invest Dermatol, 2009, 129(11): 2646-2652

[11]Lin GF(林國芳), Ma QW, Zha YL, et al. Genetic polymorphism of glutathione s-transferase T1 and M1 Shanghai "indigene" population. Carcinogenesis, Teratogenesis and Mutagenesis(癌變·畸變·突變), 2001, 13(1): 10-12

[12]Zheng TR(鄭天榮), Zheng QH, Gong FS, et al. Gene deletion polymorphisms of GSTT1 and GSTM1 and susceptibility to stomach neoplasm. Journal of Practical Oncology(實用腫瘤雜志), 2002, 17(3): 155-157

[13]Sun L, Xi B, Yu L, et al. Association of glutathione S-transferases polymorphisms (GSTM1 and GSTT1) with senile cataract: a meta-analysis. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010, 51(12): 6381-6386

[14]Forgione MA, Cap A, Liao R, et al. Heterozygous cellular glutathione peroxidase deficiency in the mouse: abnormalities in vascular and cardiac function and structure. Circulation, 2002, 106(9): 1154-1158

[15]Bernardini S, Bellincampil, Ballerini S, et al. Glutathione S-transferase P1 *C allelic variant increases susceptibility forlate-onset Alzheimer disease: association study and relationship with apolipoprotein E epsilon4 allele. Clin Chem, 2005, 51(6): 944-951

[16]Buchard A, Sanchez JJ, Dalhoff K, et al. Multiplex PCR detection of GSTM1, GSTT1, and GSTP1 gene variants: simultaneously detecting GSTM1 and GSTT1 gene copy number and the allelic status of the GSTP1 Ile105Val genetic variant. J Mol Diagn, 2007, 9(5): 612-617

[17]Sprenger R, Schlagenhaufer R, Kerb R, et al. Characterization of the glutathione S-transferase GSTT1 deletion: discrimination of all genotypes by polymerase chain reaction indicates a trimodular genotype-phenotype correlation. Pharmacogenetics, 2000, 10(6): 557-565

[18]Al-Dayel F, Al-Rasheed M, Ibrahim M, et al. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes CYP1A1, GSTT and GSTP contribute to the development of diffuse large B-cell lymphoma risk in the Saudi Arabian population. Leuk Lymphoma, 2008, 49(1): 122-129

[19]Fujihara J, Yasuda T, Iida R, et al. Cytochrome P450 1A1, glutathione S-transferases M1 and T1 polymorphisms in Ovambos and Mongolians. Leg Med (Tokyo), 2009, 11(S1): 408-410

[20]Uhm YK, Yoon SH, Kang IJ, et al. Association of glutathione S-transferase gene polymorphisms (GSTM1 and GSTT1) of vitiligo in Korean population. Life Sci, 2007, 81(3): 223-227

[21]Dandara C, Sayi J, Masimirembwa CM, et al. Genetic polymorphism of cytochrome P450 1A1 (Cyp1A1) and glutathione transferases (M1, T1 and P1) among Africans. Clin Chem Lab Med, 2002, 40(9): 952-957

[22]Millikan R, Pittman G, Tse CK, et al. Glutathione S-transferases M1, T1, and P1 and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2000, 9(6): 567-573

[23]Yalin S, Hatungil R, Tamer L, et al. Glutathione S-transferase gene polymorphisms in Turkish patients with diabetes mellitus. Cell Biochem Funct, 2007, 25(5): 509-513

[24]Gattas GJ, Kato M, Soares-Vielra JA, et al. Ethnicity and glutathione S-transferase (GSTM1/GSTT1) polymorphisms in a Brazilian population. Braz J Med Biol Res, 2004, 37(4): 451-458

[25]Piacentini S, Polimanti R, Porreca F, et al. GSTT1 and GSTM1 gene polymorphisms in European and African populations. Mol Biol Rep, 2011, 38(2): 1225-1230

[26]Abbas A, Delvinquiere K, Lechevrel M, et al. GSTM1, GSTT1, GSTP1 and CYP1A1 genetic polymorphisms and susceptibility to esophageal cancer in a French population: different pattern of squamous cell carcinoma and adencarcio-noma. World J Gastroenterol, 2004, 10(23): 3389-3393

[27]Gundacker C, Komarnicki G, Jagiello P, et al. Glutathione-S-transferase polymorphism, metallothionein expression, and mercury levels among students in Austria. Sci Total Environ, 2007, 385(1-3): 37-47

[28]Sharifzadeh M, Rasoulinejad M, Valipour F, et al. Evaluation of patient-related factors associated with causality, preventability, predictability and severity of hepatotoxicity during antituberculosis treatment. Pharmacol Res, 2005, 51(4): 353-358

[29]Sharma SK, Balamurugan A, Saha PK, et al. Evaluation of clinical and immunogenetic risk factors for the development of hepatotoxicity during antituberculosis treatment. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 166(7): 916-919

[30]Magnus IS, Cristina RA. Pharmacogenetics of drug-metabolizing enzymes: implications for a safer and more effective drug therapy. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2005, 360(1460): 1563-1570

[31]Roy B, Chowdhury A, Kundu S, et al. Increased risk of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in individuals with glutathione S-transferase M1 'null' mutation. J Gastroenterol Hepatol, 2001, 16(9): 1033-1037

[32]Leiro V, Fernndez-Villar A, Valverde D, et al. Influence of glutathione S-transferase M1 and T1 homozygous null mutations on the risk of antituberculosis drug-induced hepatotoxicity in a Caucasian population. Liver Int, 2008, 28(6): 835-839

[33]Huang YS, Su WJ, Huang YH, et al. Genetic polymorphisms of manganese superoxide dismutase, NAD(P)H:quinone oxidoreductase, glutathione S-transferase M1 and T1, and the susceptibility to drug-induced liver injury. J Hepatol, 2007, 47(1): 128-134

[34]The Subspecialty Group of Respiratory Diseases of the Society of Pediatrics, Chinese Medical Association(中華醫(yī)學會兒科學分會呼吸學組). Diagnostic standards and therapeutic recommendations for pulmonary tuberculosis in children. Chin J Pediatr(中華兒科雜志), 2006, 44(4): 249-251

[35]Treatment of tuberculosis :guidelines for national programmes. Geneva: World Health Organization, 1993