熒光定量PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值

李秀武 劉建強(qiáng) 賈晨光 李曉霞 袁先改

熒光定量PCR技術(shù)在骨關(guān)節(jié)結(jié)核中的診斷價(jià)值

李秀武 劉建強(qiáng) 賈晨光 李曉霞 袁先改

目的探討熒光定量 PCR(FQ-PCR)技術(shù)對(duì)活動(dòng)性骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷價(jià)值。方法選擇關(guān)節(jié)炎患者 52例,應(yīng)用 FQ-PCR技術(shù)檢測患者尿液中 TB-DNA的檢出率,并與抗酸染色法的檢出率比較。結(jié)果52例關(guān)節(jié)炎疾病患者中,確診結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者 36例,TB-DNA陽性 22例,全部確診為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎,陽性率 61.11%,特異度 100%,抗酸染色陽性 2例,陽性率 5.56%。結(jié)論應(yīng)用 FQ-PCR技術(shù)檢測結(jié)核性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)腔積液中 TB-DNA,具有高度敏感性和特異性,明顯優(yōu)于抗酸染色法,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR；結(jié)核分枝桿菌；關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)腔積液

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部病例均來自 2006年 8月至 2009年 10月在我院住院的骨關(guān)節(jié)疾病患者52例,其中男 34例,女 18例；年齡 15～77歲。

1.2 標(biāo)本采集 在局麻和無菌條件下,抽取患者關(guān)節(jié)腔積液 2～5ml置于帶蓋的無菌瓶中,立即送檢,分別用 FQ-PCR技術(shù)和抗酸法檢測 TB-DNA和抗酸桿菌。

1.3 主要儀器與試劑 FQ-PCR 儀器設(shè)備為達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的 7600型實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng),試劑盒為中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增熒光試劑盒?？顾?5%的石炭酸復(fù)紅液,5%的鹽酸酒精液,稀釋美藍(lán)。

1.4 方法 FQ-PCR:每次操作均加入質(zhì)控品。

1.4.1 標(biāo)本處理:取無菌留取的關(guān)節(jié)腔積液 1m l加入 1.5ml的離心管中 12 000 r/min離心 5m in,留取沉淀,加入 1m l無菌0.9%氯化鈉溶液洗滌 1次,離心、留取沉淀,加入 50μl DNA提取液混勻,100℃恒溫干浴 10min,4℃冰箱冷卻至室溫后,離心待用。

1.4.2 質(zhì)控品處理:①將標(biāo)準(zhǔn)品、陰、陽性質(zhì)控品 6 000～8 000 r/min離心 5 s。②取陰、陽性質(zhì)控品各 50μl加等量已混勻的 DNA提取液混勻,100℃恒溫干浴 10min,4℃冰箱冷卻至室溫后,離心待用。

1.4.3 把處理過的標(biāo)本,標(biāo)準(zhǔn)品,陰、陽性質(zhì)控品分別吸取上清 2μl加入反應(yīng)管中,8 000 r/min離心 5 s,上機(jī),按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行擴(kuò)增和分析,得出結(jié)果。抗酸法:用厚涂片法。關(guān)節(jié)腔積液 2～3ml,3 000 r/min離心 15 min,棄上清,留沉渣涂片,固定,抗酸染色,陽性為紅色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

52例骨關(guān)節(jié)疾病患者中,經(jīng)臨床癥狀,X線檢查,實(shí)驗(yàn)室檢查,確診為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的病例 36例,診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床診治指南制定的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。其他原因引起感染者 16例。用 FQ-PCR法檢測關(guān)節(jié)腔積液TB-DNA陽性22例,全部為確診結(jié)核性關(guān)節(jié)炎的病例,陰性 30例,其中非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎 16例,假陰性為 14例,特異度 100%,陽性率 61.11%。用抗酸法檢出陽性病例 2例,TB-DNA陽性患者2例,特異度100%,陽性率 5.56%,陰性 50例,假陰性 34例。FQ-PCR檢出陽性率明顯高于抗酸法(P＜0.01)。見表 1、2。

表1 FQ-PCR與抗酸法檢測關(guān)節(jié)腔積液的結(jié)果比較 n=52

表2 FQ-PCR與抗酸法檢測關(guān)節(jié)腔積液的陽性率比較 n=36

3 討論

目前對(duì)結(jié)核性關(guān)節(jié)炎的診斷一直是困擾醫(yī)務(wù)工作者的難題,由于結(jié)核性關(guān)節(jié)炎的早期,臨床癥狀不明顯,癥狀不典型,與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)炎很難區(qū)分,沒有特異性,X線檢查在發(fā)病初期不明顯,一般在 3個(gè)月左右才顯示[1],據(jù)報(bào)道,結(jié)核性變態(tài)反應(yīng)型關(guān)節(jié)炎,首診100%誤認(rèn)為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,發(fā)病后 3個(gè)月以上還不考慮結(jié)核病的誤診率為 93%,嚴(yán)重影響患者預(yù)后[3]。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷骨與關(guān)節(jié)結(jié)核必不可少的項(xiàng)目。結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)檢查是發(fā)現(xiàn)病原體的主要手段,是確定結(jié)核病診斷和治療方案的重要依據(jù),長期以來,結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依據(jù)涂片抗酸染色鏡檢,結(jié)核菌培養(yǎng)法。涂片法的優(yōu)點(diǎn)是:簡便、快速、價(jià)廉,送檢當(dāng)天出結(jié)果。缺點(diǎn)是,敏感性低,特異性差,不能區(qū)分結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌,對(duì) L型和顆粒型結(jié)核菌也不能檢出[4]。結(jié)核菌培養(yǎng)法是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn),精確可靠,特異性高,但是,所需時(shí)間長,通常 4～8周出結(jié)果,且敏感性低,嚴(yán)重影響了結(jié)核病的早期診斷和及時(shí)治療[5]。PCR定性技術(shù)自1985年問世以來由于很多技術(shù)問題如易污染,假陽性率高被叫停,而 FQ-PCR是在常規(guī) PCR的基礎(chǔ)上,加入熒光標(biāo)記的探針,巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的定量檢測。技術(shù)特點(diǎn)是在封閉狀態(tài)下檢測,避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染所致的假陽性；光譜技術(shù)提高了靈敏度；熒光探針雜交進(jìn)一步提高了特異性[6]。理論上,只要樣本中有一個(gè)病原菌存在,FQ-PCR就可以檢測到。該技術(shù)已成功用于檢測痰標(biāo)本和肺泡灌洗液標(biāo)本,特別是含菌量低的標(biāo)本。如無空洞型或病變范圍較小的肺結(jié)核痰標(biāo)本[7]。對(duì)肺結(jié)核的早期診斷起到了積極的作用[8,9]。

我們用熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)結(jié)核性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)腔積液進(jìn)行檢測,并與抗酸染色法進(jìn)行了比較,在 52例關(guān)節(jié)炎患者中,FQ-PCR檢測的陽性數(shù)為 22例,陰性 30例,其中,結(jié)核性關(guān)節(jié)炎 36例,非結(jié)核性關(guān)節(jié)炎 16例,陽性患者 22例,全部為確診病例,特異度 100%,陽性率為 61.11%,抗酸染色檢測陽性 2例,陰性 50例,陽性率 5.56%,2例患者均為 TB-DNA陽性患者,特異度 100%。二者特異度無區(qū)別。實(shí)時(shí)熒光定量檢出的陽性率明顯高于抗酸染色法,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。兩種方法均存在假陰性,FQ-PCR的檢測的假陰性數(shù)為 14例,假陰性率為 38.89%,抗酸染色檢測的假陰性數(shù)為 34例,假陰性率為 94.44%,實(shí)時(shí)熒光定量檢出的假陰性率明顯低于抗酸染色法,二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。原因可能為關(guān)節(jié)腔積液中,結(jié)核桿菌的含量低,所檢測標(biāo)本的用量少,未能取到?；蛘卟僮鞑划?dāng),標(biāo)本的采集不當(dāng),可以通過加強(qiáng)培訓(xùn),做好標(biāo)本的采集和保存,使臨床檢測更準(zhǔn)確。

本研究結(jié)果表明,在骨關(guān)節(jié)結(jié)核的診斷中,漿膜腔積液細(xì)菌學(xué)檢測是一種重要的途徑,FQ-PCR技術(shù)具有敏感性,特異性強(qiáng)的特點(diǎn),FQ-PCR技術(shù)明顯優(yōu)于抗酸法,可作為結(jié)核性關(guān)節(jié)炎早期診斷的一個(gè)可靠指標(biāo)。

1 謝惠安,楊國太,林善梓,等.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué).第 1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000.378-383.

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)主編.臨床診治指南(結(jié)核病分冊).第 1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.64-86.

3 張敦容主編.現(xiàn)代結(jié)核病學(xué).第 1版.北京:人民軍醫(yī)出版社,2000.547-548.

4 馬玙,朱莉貞,潘毓萱主編.結(jié)核病.第 1版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2006.100-105.

5 譚笑.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室快速診斷方法的研究.湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào),2007,4:58-59.

6 李國釗.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)及在結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室的研究和應(yīng)用.臨床肺科雜志,2008,13:1315-1317.

7 張江漫,李志惠,田艷茹,等.熒光定量 PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中結(jié)核菌 DNA對(duì)肺結(jié)核診斷的臨床價(jià)值.河北醫(yī)藥,2008,30:1543-1544.

8 辛茶香,劉珍瓊.熒光定量 PCR技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌 DNA的應(yīng)用價(jià)值.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,28:201.

9 韓紀(jì)勤.熒光定量聚合酶連反應(yīng)診斷結(jié)核病臨床應(yīng)用研究.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37:180.

R 529.2

A

1002-7386(2011)01-0073-02

項(xiàng)目來源:河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào):20090260)

050041 石家莊市,河北省胸科醫(yī)院

骨與關(guān)節(jié)結(jié)核屬于肺外結(jié)核中最常見的多發(fā)慢性疾病,多繼發(fā)于肺結(jié)核,由于多種原因?qū)е路谓Y(jié)核不能得到及時(shí)有效的治療,使結(jié)核桿菌蔓延,經(jīng)淋巴或血行途徑而致病。由于發(fā)病遲緩,癥狀不明顯,早期診斷的難度大[1],檢出率明顯低于肺結(jié)核。嚴(yán)重影響患者的預(yù)后,致殘率高。我們用熒光定量 PCR(FQPCR)技術(shù)對(duì)骨關(guān)節(jié)結(jié)核病人的關(guān)節(jié)液進(jìn)行檢測,報(bào)告如下。

2010-09-20)