宮頸鱗癌患者人乳頭瘤病毒感染和治療后轉(zhuǎn)歸情況分析

王 潔，曹海霞，馬 蓉，王 卓，吳建中

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)統(tǒng)計，每年約有50萬新發(fā)病例，其中80%發(fā)生在發(fā)展中國家。我國宮頸癌患病率和死亡率均約占世界的1/3，每年新增宮頸癌患者13.15萬，約有5萬例死于宮頸癌。大量研究證實(shí)，人乳頭瘤病毒(human papillom avirus，HPV)與宮頸癌變的發(fā)生密切相關(guān)，持續(xù)性高危型HPV感染是發(fā)展為宮頸癌的必然因素[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)的HPV基因亞型有100多種，其中超過1/3可以特異性感染肛門生殖器，并且具有地域差異性，在不同國家和地區(qū)HPV感染率和亞型分布不同[2]。了解宮頸癌患者HPV不同亞型的分布特點(diǎn)有助于為宮頸病變的預(yù)防提供重要依據(jù)，也為HPV疫苗的研發(fā)和臨床使用奠定了基礎(chǔ)。本研究采用實(shí)時熒光PCR技術(shù)對228例確診宮頸鱗癌患者進(jìn)行高危型HPV檢測，探討高危型HPV感染與宮頸鱗癌的關(guān)系及亞型分布特點(diǎn)。同時，對其中59例患者進(jìn)行跟蹤隨訪，分析不同治療方案對HPV感染轉(zhuǎn)歸的影響,從而為宮頸癌治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年10月—2011年6月在我院住院治療并經(jīng)病理檢查確診為宮頸鱗癌患者228例，年齡24～79歲。將患者分為6個年齡組，其中<30歲6例，30～39歲27例，40～49歲79例，50～59歲66例，60～69歲35例，≥70歲15例。所有患者治療前均進(jìn)行HPV基因分型檢測。隨訪患者于治療后1個月和3個月時分別再次進(jìn)行HPV基因分型檢測。

1.2 標(biāo)本收集和DNA抽提

1.2.1 標(biāo)本收集 用無菌生理棉球洗去宮頸外分泌物，將棉拭子伸入宮頸管內(nèi)鱗狀上皮交界處采樣，旋轉(zhuǎn)3～4圈，停留數(shù)秒，以取得宮頸分泌物或脫落細(xì)胞。將取樣后的棉拭子放入加有專用細(xì)胞保存液的取樣管中，充分漂洗。每份標(biāo)本取1 mL待檢，余-20℃凍存。

1.2.2 DNA抽提 將1 mL待檢標(biāo)本置1.5 mL離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2遍，采用試劑盒抽提患者宮頸脫落細(xì)胞DNA(QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp Blood Kit，QIAGEN，Germany)，操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 HPV基因分型定量檢測

1.3.1 HPV基因分型和擴(kuò)增 采用雙通道實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，同時對HPV16、18、45、31、33、52、58、67型DNA進(jìn)行分型定量。操作方法按照試劑盒說明書(Realquality RQ-HPV HR,AB ANALITICA,Italy)進(jìn)行。

1.3.2 PCR擴(kuò)增條件 將混合好的PCR反應(yīng)液在ABI-7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測，95℃預(yù)變性3 min后，以94℃變性15 s,57℃延伸40 s擴(kuò)增40個循環(huán)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由ABI-7300系統(tǒng)軟件自動計算待測樣品中HPV DNA拷貝含量。

1.4 治療方法[3]

1.4.1 化療 選用PVB化療方案，采用深靜脈插管化療，予DDP 60～80 mg d1靜脈滴注，VCR 1 mg d1靜推，BLM 15 mg d1肌肉注射，3～4周重復(fù)，共2～4個療程。根據(jù)患者的耐受性，決定化療的療程數(shù)。

1.4.2 放射治療 予15 MV X線或60Co盆腔前后野垂直外照射，盆腔中線平面劑量DT 45～50 Gy，常規(guī)分割放療1.8～2 Gy/次，部分患者給2/3量后予中擋鉛盆腔四野照射。后裝采用192Ir selectron 后裝治療機(jī)，A 點(diǎn)6～7 Gy/周，總量25～35 Gy。對于宮旁侵犯嚴(yán)重、病灶消退不滿意者，局部縮野劑量增加6～8 Gy。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用卡方檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV感染陽性率

228例宮頸鱗癌患者中HPV感染者共200例，HPV總陽性率為87.7%。其中HPV16陽性150例，占65.8%，HPV33/52/58/67陽性59例，占25.9%，HPV18/45陽性20例，占8.8%，HPV31陽性14例，占6.1%。各年齡組患者HPV陽性率分別為：<30歲83.3%(5/6)，30～39歲77.8%(21/27)，40～49歲89.9%(71/79)，50～59歲93.9%(62/66)，60～69歲82.9%(29/35)，≥70歲80.0%(12/15)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.238，見表1)。

表1 HPV主要基因型感染與年齡分布

2.2 各年齡組HPV16陽性率

150例HPV16陽性患者中，<30歲5例，30～39歲19例，40～49歲57例，50～59歲42例，60～69歲23例，≥70歲4例。各年齡組HPV16陽性率分別為：<30歲83.3%(5/6)，30～39歲70.4%(19/27)，40～49歲72.2%(57/79)，50～59歲63.6%(42/66)，60～69歲65.7%(23/35)，≥70歲26.7%(4/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030，見表1)。

2.3 各年齡組HPV33/52/58/67陽性率

HPV33/52/58/67次要高危型陽性患者共59例，其中<30歲1例，30～39歲4例，40～49歲12例，50～59歲11例，60～69歲19例，≥70歲12例。各年齡組HPV33/52/58/67陽性率分別為：<30歲16.7%(1/6)，30～39歲14.8%(4/27)，40～49歲15.2%(12/79)，50～59歲16.7%(11/66)，60～69歲54.3%(19/35)，≥70歲80.0%(12/15)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，見表1)。

2.4 治療后HPV感染的轉(zhuǎn)歸

在59例獲隨訪的HPV陽性患者中有24例(40.7%)治療后1個月轉(zhuǎn)陰，41例(69.5%)治療后3個月轉(zhuǎn)陰。將患者按照治療方法分為2組，其中放化療聯(lián)合治療組31例，單純放療組28例?；颊咧委熀?個月HPV感染轉(zhuǎn)陰人數(shù)分別為：放化療聯(lián)合組14例，占45.2%，單純放療組10例，占35.7%。治療后3個月HPV感染轉(zhuǎn)陰人數(shù)增加，分別為：放化療聯(lián)合組24例，占77.4%，單純放療組17例，占60.7%。在放化療聯(lián)合治療組中共有7例患者HPV感染未轉(zhuǎn)陰，其中4例病毒載量下降，2例同時感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒載量下降，后者病毒載量上升；1例感染HPV16，治療后病毒載量上升。在單純放療組中有11例HPV感染未轉(zhuǎn)陰，其中5例病毒載量下降，3例同時感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒載量下降或轉(zhuǎn)陰，后者病毒載量上升；1例治療前同時感染HPV16和HPV31，治療后HPV16和HPV31病毒感染轉(zhuǎn)陰，但HPV33/52/58/67轉(zhuǎn)陽；1例感染HPV16和HPV33/52/58/67，治療后前者病毒載量上升，后者病毒載量下降；1例治療前僅感染HPV16，治療后HPV16病毒載量下降，HPV33/52/58/67轉(zhuǎn)陽。

3 討論

HPV是一種嗜上皮性雙鏈環(huán)狀DNA病毒，在人和動物中分布廣泛，能夠特異性感染皮膚和黏膜。流行病學(xué)研究表明，HPV感染與宮頸病變密切相關(guān)，根據(jù)病毒致病性差異分為低危型HPV(LR-HPV，包括6,11、 40、42、 43、 44、54、61、70、72、51 型)和高危型HPV(HR-HPV，包括16、18、31、33、35、39、43、51、52、56、59、68、73、82 型)。LR-HPV主要引起尖銳濕疣和宮頸上皮內(nèi)瘤變，而HR-HPV的持續(xù)感染被認(rèn)為是宮頸癌發(fā)生的重要原因。

本研究選取了228例宮頸鱗癌患者，采用實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行基因分型檢測。結(jié)果表明HPV總陽性率為87.7%，其中HPV16占65.8%，HPV33/52/58/67占25.9%，HPV18/45占8.8%，HPV31占6.1%，提示宮頸鱗癌與HPV感染密切相關(guān)，且大部分與HPV16亞型有關(guān)，與國外文獻(xiàn)報道一致[4-5]。實(shí)驗中HPV次要高危型33/52/58/67陽性患者明顯多于HPV18/45亞型患者，與部分文獻(xiàn)報道有悖，我們認(rèn)為此為HPV亞型分布的人群差異性和地區(qū)特異性導(dǎo)致。將患者分為6個年齡組分別探討不同年齡段患者HPV感染情況和亞型分布，發(fā)現(xiàn)HPV感染陽性率在各年齡段之間無差異(P>0.05),提示HPV感染是各年齡段宮頸癌患者共同的致病因素。當(dāng)分別研究患者HPV16和HPV33/52/58/67陽性率時，我們發(fā)現(xiàn)各年齡組間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。HPV16陽性患者大都為70歲以下，70歲以上患者中僅26.7%(4/15)為陽性。相反，HPV次要高危型33/52/58/67感染則易見于高齡患者中，60歲以上患者中此亞型陽性率顯著增加，在70歲以上患者中高達(dá)80.0%(12/15)。結(jié)果提示在宮頸鱗癌患者中HPV亞型分布可能與年齡相關(guān)。由于本研究資料樣本數(shù)偏少，特別是30歲以下和70歲以上年齡組，因此還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

在對59例隨訪患者研究中我們發(fā)現(xiàn)40.7%的HPV感染陽性患者治療后1個月轉(zhuǎn)陰，69.5%的HPV感染陽性患者治療后3個月轉(zhuǎn)陰，提示HPV對宮頸癌治療敏感，在隨訪中具有一定意義。本院既往研究認(rèn)為，對中晚期宮頸癌行PVB或PF方案同步放化療可提高患者生存率，因此我們根據(jù)治療方法將隨訪患者分為放化療聯(lián)合組及單純放療組，探討不同治療方案對HPV感染轉(zhuǎn)歸的影響。結(jié)果表明患者治療后1個月HPV感染轉(zhuǎn)陰人數(shù)分別為放化療聯(lián)合組14例，占45.2%；單純放療組10例，占35.7%。治療后3個月HPV感染轉(zhuǎn)陰人數(shù)分別為：放化療聯(lián)合組24例，占77.4%；單純放療組17例，占60.7%。統(tǒng)計學(xué)分析兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。我們考慮與樣本量和隨訪時間有關(guān)，增加樣本數(shù)量，延長隨訪時間有利于進(jìn)一步研究。在HPV感染未轉(zhuǎn)陰的18例患者中有9例表現(xiàn)為病毒載量的下降，提示治療有效果。另外9例病毒載量不同程度上升，其中8例為多重感染，最常見的是HPV16合并HPV33/52/58/67感染，說明多重感染可能影響了治療效果，且與宮頸癌的不良預(yù)后有關(guān)[6]。

自WHO于1992年宣布HPV是引起宮頸癌變的首要因素以來,宮頸癌已成為了目前唯一病因明確的腫瘤。近年來，隨著HPV檢測技術(shù)的不斷提高和人們對HPV在宮頸癌中作用的不斷探討，高危型HPV的感染逐漸成為了宮頸癌早期診斷和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)之一。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了高危型HPV感染與宮頸癌變有關(guān)，同時還表明在高齡患者中更易出現(xiàn)HPV次要高危型33/52/58/67感染陽性，提示HPV亞型分布存在年齡差異性，為HPV疫苗的研發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。此外，在對隨訪患者HPV檢測中我們認(rèn)為宮頸癌的不同治療方法對于HPV感染的轉(zhuǎn)歸也可能存在一定影響，多重感染有可能與宮頸癌的療效預(yù)后相關(guān)。雖然目前尚無明顯證據(jù)證明不同HPV亞型之間的相互作用會加強(qiáng)宮頸癌的病理作用,但多重感染在疾病進(jìn)程中依舊是一個重要的宿主因素，有可能成為一個獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，提示在宮頸疾病的治療中應(yīng)高度重視多重感染的發(fā)生。

[1]Cutts FT,Franceschi S,Goldie S,et al.Human papillomavirus and HPV vaccines [J].Bulletin of the World Health Organization,2007,85(9):719-726.

[2]Clifford GM,Smith JS,Plummer M,et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis[J].Br J Cancer,2003,88(1):63-73.

[3]黃健,葉勁軍,陸諤梅.化療和放療聯(lián)合治療中晚期宮頸癌療效分析[J].癌癥進(jìn)展雜志,2008,6(2):181-184.

[4]Bulk S,Berkhof J,Bulkmans NW,et al.Preferential risk of HPV16 for squamous cell carcinoma and ofHPV18 for adenocaicinoma of the cervix compared to women with normal cytology in the Northern lands[J].Br J Cancer,2006,94(1):171-175.

[5]Castle PE,Solomon D,Schiffman M,et al.Human papillomavirus type 16 infections and 2-year absolute risk of cervical precancer in women with equivocal or mild cytologic abnormalities[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(14):1066-1071.

[6]Munagala R,Donà MG,Rai SN,et al.Significance of multiple HPV infection in cervical cancer patients and its impact on treatment response[J].Int J Oncol,2009,34(1):263-271.