MGMT在腎細(xì)胞癌中的研究

劉 剛， 關(guān)英華， 于江華， 王曉彬， 張明星， 竇中嶺， 梁 豪

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系統(tǒng)腫瘤的常見病，發(fā)病率居第二位，僅次于膀胱癌，近年來，腎癌的發(fā)病率有上升趨勢，據(jù)美國文獻(xiàn)報(bào)道，自 1970年來，腎細(xì)胞癌發(fā)病率為 2.3% ～4.3%，且呈逐年遞增趨勢，導(dǎo)致每年有超過35 000例新增患者和12 000的死亡人數(shù)［1-2］，其中有60%的腎癌是偶然發(fā)現(xiàn)的［3］，而這些偶發(fā)癌大部分具有小腎癌和不易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)［4］。

腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、長期相互作用的過程，與DNA損傷程度以及修復(fù)能力密切相關(guān)。人體的DNA長期暴露在理化因素的環(huán)境中(電離輻射和化學(xué)物質(zhì))以及異常代謝產(chǎn)物中(氧自由基)而遭受襲擊，引起DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)及其編碼特性的改變而致DNA損傷，這些損傷如果不能得到及時(shí)有效的修復(fù)，細(xì)胞的正?；顒?dòng)就會受到破壞，并由此誘發(fā)一系列的遺傳疾病乃至腫瘤的發(fā)生。DNA損傷修復(fù)是機(jī)體對DNA損傷所產(chǎn)生的重要生物學(xué)反應(yīng)，其通過各種不同的損傷修復(fù)通路對DNA序列中損傷的、錯(cuò)配的或不合適的堿基進(jìn)行修復(fù)，以保證基因遺傳的穩(wěn)定性［5］。

O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferase，MGMT)是自然界中各種生物體內(nèi)普遍存在的一種獨(dú)特DNA修復(fù)酶。人類 MGMT基因定位于10 q26，為單肽結(jié)構(gòu)，其cDNA長約769 bp，編碼207個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，第4外顯子中的半胱氨酸殘基為烷基受體，是蛋白酶的活性部位。人MGMT基因穩(wěn)定地存在于所有正常組織細(xì)胞內(nèi)，多在具有分裂增殖能力的正常及癌變的胃、結(jié)腸靠近管腔側(cè)腺上皮細(xì)胞核內(nèi)，研究結(jié)果提示其主要分布于活性基團(tuán)轉(zhuǎn)錄的部位。MGMT是一種DNA修復(fù)酶，其主要作用是保護(hù)DNA免受烷化劑的損傷，從而阻止腫瘤的發(fā)生，而且有研究表明許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展與MGMT缺失與突變關(guān)系密切［6-7］。

MGMT表達(dá)缺失或活性降低是否與腎細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制有關(guān)，國內(nèi)外報(bào)道甚少。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測80例腎細(xì)胞癌組織和30例癌旁組織及20例正常腎組織中MGMT的表達(dá)，探討MGMT表達(dá)的異常與腎細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料來源 選取河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2009年1月—2011年1月間診斷明確的腎細(xì)胞癌手術(shù)切除標(biāo)本80例，癌旁組織30例，另在河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院取正常腎組織20例。腎細(xì)胞癌患者中男62例，女18例，年齡35～80歲，平均63.3歲;腎細(xì)胞癌分期按2002年TNM分期系統(tǒng)(AJCC):T1+T262例、T3+T418例;分化程度按WHO1997分級法:高分化34例、中分化35例、低分化11例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)組織切片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.2 免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)(SP法)，鼠抗人MGMT單克隆抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽性標(biāo)本切片做陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷 細(xì)胞核、細(xì)胞漿或兩者均出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽性，陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，結(jié)果的判讀由兩名高級病理診斷醫(yī)師審核。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎細(xì)胞癌、癌旁組織及腎正常組織的MGMT表達(dá) MGMT在腎正常組織、癌旁組織及腎細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率依次為 65.0%、76.7%、32.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

2.2 MGMT表達(dá)與腎細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系MGMT在腎細(xì)胞癌中各個(gè)病理分級中的表達(dá)依次為高分化47.1%、中分化28.6%、低分化 9.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05);在各個(gè)臨床分期中依次為 T1+T248.6%、T3+T418.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MGMT表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤數(shù)量、患病次數(shù)均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)，詳見表1。

3 討論

腎細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展是多個(gè)因素參與的復(fù)雜的過程，與多種癌基因和抑癌基因的表達(dá)、調(diào)控以及細(xì)胞凋亡有關(guān)［8］。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為腫瘤的發(fā)生通常是基因損傷累積的結(jié)果，隨著研究的進(jìn)展，國內(nèi)外許多學(xué)者又發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子異常甲基化和腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，而基因啟動(dòng)子非甲基化正常狀態(tài)的維持則是靠甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用來實(shí)現(xiàn)。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)是從細(xì)菌到哺乳類動(dòng)物機(jī)體中存在的一種獨(dú)特DNA修復(fù)酶，其同時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶與甲基接受體的作用，在DNA交聯(lián)形成前將烷化基團(tuán)從O6-mG的O6位轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，使 DNA鏈上的鳥嘌呤損傷修復(fù)，同時(shí)MGMT在轉(zhuǎn)甲基后不可逆地失去活性。MGMT是體內(nèi)唯一可以去除這種甲基化損傷的DNA修復(fù)酶［9］，其可將O6鳥嘌呤加合物從DNA上移除，阻止腫瘤的發(fā)生。MGMT不僅在保護(hù)細(xì)胞免受烷基類物質(zhì)的毒性、突變性和致癌活性中具有決定性作用，同時(shí)也維持了其他抑癌基因的功能。Virmani等［10］通過研究發(fā)現(xiàn)MGMT啟動(dòng)子甲基化程度與宮頸病變發(fā)展程度一致。Allay等［11］發(fā)現(xiàn)MGMT過度表達(dá)能明顯降低淋巴瘤的發(fā)生率。Eads等［12］研究發(fā)現(xiàn)Barrett食管發(fā)展到腺癌與MGMT甲基化關(guān)系密切。Park等［13］研究發(fā)現(xiàn)胃癌MGMT啟動(dòng)子甲基化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級以及生存期有明顯相關(guān)性。

表1 MGMT表達(dá)與腎細(xì)胞癌病理參數(shù)的關(guān)系

我們采用免疫組化SP法研究MGMT在20例正常腎組織、30例癌旁組織及80例腎細(xì)胞癌中的表達(dá)，結(jié)果顯示MGMT在正常腎組織中的陽性表達(dá)率為65.0%(13/20)，在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為76.7%(23/30)，在腎細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率為32.5%(26/80)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。而且主要表達(dá)于細(xì)胞漿或細(xì)胞核，表明MGMT的低表達(dá)可能與腎細(xì)胞癌由正常組織發(fā)展而來的過程有關(guān)，在胞漿或胞核中起作用。

本組結(jié)果MGMT在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)明顯低于正常腎組織和癌旁組織，癌組織中的DNA損傷不能得到及時(shí)有效地修復(fù)，表明MGMT表達(dá)水平降低在腎正常組織逐漸演變?yōu)槟I細(xì)胞癌的過程中起到了促進(jìn)作用，這也與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果一致，MGMT可以作為檢測腎細(xì)胞癌的腫瘤指標(biāo)之一。

本組結(jié)果還顯示MGMT的陽性表達(dá)與腎細(xì)胞癌的分化程度顯著相關(guān)(高、中、低分化分別為47.1%、28.6%、9.1%)(P ＜ 0.05)，與臨床分期也顯著相關(guān)(T1+T248.6%、T3+T418.6%)(P ＜0.05);與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

MGMT蛋白由O6-烷化鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)，在不需要任何輔助因子或其他蛋白質(zhì)的條件下，特異性地對由致癌劑亞硝酸鹽類引起的胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的化學(xué)加合物起作用，可以催化DNA分子中胞嘧啶O4或鳥嘌呤O6位上的甲基、二氯乙基等一大類烷化基，使其轉(zhuǎn)移至自身肽鏈145位的半胱氨酸殘基上使他們失活，使DNA鏈上鳥嘌呤損傷修復(fù)，恢復(fù)DNA原來的化學(xué)結(jié)構(gòu)、狀態(tài)和功能的完整性。大量資料表明，MGMT含量與腫瘤發(fā)生呈明顯負(fù)相關(guān)，而MGMT甲基化在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中擔(dān)負(fù)重要作用。Cooper等［14］研究顯示，MGMT的表達(dá)減少與肺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，而且更易發(fā)生在伴有轉(zhuǎn)移的晚期肺癌的患者中。

在本實(shí)驗(yàn)中，MGMT在腎細(xì)胞癌中表達(dá)與其病理組織學(xué)分級呈負(fù)相關(guān)，即腫瘤的惡性程度越高而MGMT的表達(dá)越低，提示組織細(xì)胞中MGMT含量降低后，更多的DNA損傷沒有得到及時(shí)有效修復(fù)。Zhou等［15］研究發(fā)現(xiàn)，組織細(xì)胞內(nèi)MGMT表達(dá)缺失或活性降低會使DNA損傷不能得到及時(shí)修復(fù)從而導(dǎo)致基因突變不斷累積，增加細(xì)胞癌變機(jī)率。由此我們可以推斷，當(dāng)檢測到腫瘤組織中MGMT表達(dá)明顯降低時(shí)即可認(rèn)為腫瘤的惡性程度較高，檢測MGMT可作為診斷腎細(xì)胞癌的指標(biāo)之一。MGMT在腎細(xì)胞癌中表達(dá)水平與其臨床分期也呈負(fù)相關(guān)，即T3+T4中表達(dá)明顯低于T1+T2，提示MGMT低表達(dá)則預(yù)示著腎細(xì)胞癌的臨床分期進(jìn)展較高，其可以作為判斷腎細(xì)胞癌預(yù)后的指標(biāo)，并為臨床治療腎細(xì)胞癌提供一定的指導(dǎo)作用。

MGMT蛋白的表達(dá)可能成為一種預(yù)判RCC預(yù)后的重要腫瘤標(biāo)記物，從而指導(dǎo)臨床治療方案的選擇。但是國內(nèi)外對MGMT在腎細(xì)胞癌研究甚少，確切發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，本次研究收集的標(biāo)本數(shù)量也不夠充分，這將是我們下一步的研究方向。

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